Na podzim se cvrčci v mírném pásmu východní Asie, v Japonsku, obvykle projevují cvrčivým zpěvem. Ačkoli africký cvrček polní Gryllus bimaculatus pochází z tropických zemí, je celosvětově vznikajícím modelovým živočichem díky své schopnosti regenerovat amputované nohy během nymfy a způsobu vývoje (krátký zárodečný pás) (Mito a Noji, 2008).

Mnoho živých organismů v živočišné říši je schopno regenerovat části svého těla po zranění. Příkladem částí těla, které mohou být znovu odrostlé, je čočka a ocas u obojživelníků, hlava u planárních živočichů a srdce u ryb. Naproti tomu se dlouho předpokládalo, že člověk nemůže obnovit ztracené části těla, s výjimkou určitých tkání, včetně pokožky, jater a povrchu vaječníků po ovulaci. Proto je důležité objasnit molekulární mechanismy zapojené do regeneračních procesů pomocí zvířecích modelů, které jsou schopny regenerovat části těla, pro následnou aplikaci u neregenerovatelných lidských orgánů a tkání.

V posledních dvou letech vedly srovnávací genomické studie dvou druhů planárníků s různými regeneračními schopnostmi k úspěšné regeneraci hlav pomocí snížení aktivity beta-kateninu z jinak neregenerovatelných fragmentů ocasů (Umesono et al., 2013). Studie obratlovců se schopností obnovovat končetiny, včetně mloka, žáby a salamandry, ukázaly, že regenerace končetin probíhá postupně. Proces regenerace končetin se dělí na nejméně tři fáze: hojení ran, dediferenciaci a opětovný vývoj, přičemž fáze opětovného vývoje napodobuje embryonální vývoj (Endo et al., 2004).

Končetina cvrčka se skládá ze šesti segmentů, které jsou uspořádány podél proximo-distální (PD) osy: coxa, trochanter, femur, tibia, tarsus a claw (obr. 1). Tarsus se dále dělí na tři tarsomery. Při amputaci holenní kosti nymfy třetího instaru noha regeneruje a do šestého instaru (tj. do 20 dnů od amputace) získá alometrickou velikost a správný tvar a obnoví se do téměř normální velikosti a tvaru dospělce. Brzy po zhojení se v distální oblasti amputované nohy vytvoří blastém (zásobárna buněk, které se množí). Buňky blastému proliferují a vytvářejí chybějící struktury pomocí interkalárních procesů mezi nejdistálnější oblastí a zbývající částí nohy (French et al., 1976).

Předtím jsme provedli srovnávací analýzu transkriptomu regenerujících a normálně amputovaných nohou cvrčků s cílem profilovat expresi mRNA související s regenerací nohy (Bando et al., 2013). Nejprve jsme se zaměřili na upregulaci genů dráhy Jak/Stat, které jsou spojeny s imunitním systémem. RNA interference (RNAi) genů této dráhy důkladně narušila regeneraci nohy. Naproti tomu RNAi proti Socs, supresoru cytokinové signalizace, způsobila prodloužení nohy. Další experimenty ukázaly, že dráha Jak/Stat podporuje proliferaci buněk za dráhou Ds/Fat.

Následně jsme zkoumali epigenetickou regulaci během regenerace nohy cvrčka. Tetsuya Bando, vedoucí pracovník naší skupiny, identifikoval u G. bimaculatus jeden gen pro histon H3 lyzin 27 (H3K27) metyltransferázu, E(z), a jeden gen pro histon H3K27 demetylázu, Utx. Klonování genů Gryllus je nyní jednoduchý proces díky dostupným informacím o genomu cvrčka (Mito a Noji, osobní sdělení). Metylace histonu H3K27 pomocí E(z) potlačuje expresi cílových genů rekrutací proteinů skupiny Polycomb. Naopak demetylace trimetylovaného histonu H3K27 pomocí Utx podporuje expresi genů. Tetsuya zjistil, že transkripce genů E(z) i Utx je v buňkách blastému amputované nohy zvýšená (Bando et al., 2013). In situ hybridizace ověřila, že oba geny jsou všudypřítomně transkribovány v regenerujících nohách cvrčků a že oba geny jsou exprimovány ve vyvíjejících se embryích (Hamada et al., 2015). Imunobarvení na amputovaných drobných nohách po RNAi, které provedl Yoshimasa Hamada (doktorand), potvrdilo, že E(z) a Utx přispívají k metylaci, respektive demetylaci na histonu H3K27me3 během regenerace nohou.

Ještě předtím Yoshimasa nečekaně zjistil, že po RNAi proti E(z) se vytvoří extra segment nohy (obrázek 1). Zpočátku jsme nebyli schopni určit identitu segmentu nohy. Morfologicky se segment nohy jevil jako tibie, protože měl trny a ostruhy, které byly charakteristické pro autentickou tibii. Naše úvodní hypotéza byla, že fenotypy po RNAi mohou záviset na místě amputace v holenní kosti. Avšak i při amputaci nohy v distální části stehenní kosti se objeví další segment podobný holenní kosti. Tvorba vzorů podél antero-posteriorní a dorzoventrální osy zůstala nezměněna, s výjimkou osy PD. Poté jsme zjišťovali, zda místo amputace podél osy PD v holenní kosti ovlivňuje fenotypovou závažnost. Extratibia, která se vytvořila, byla tím delší, čím proximálnější byla místa amputace na tibii (obr. 1). Naopak RNAi proti Utx vedla ke ztrátě tvorby spoje mezi tarsomerem 1 (Ta1) a Ta2 (obr. 2). In situ hybridizace ukázala, že exprese genů pro patternování nohy se změnila podél osy PD. Konkrétně se exprese domény jezevce (dac) rozšířila v E(z)RNAi regenerujících nohách, zatímco exprese Egfr se v UtxRNAi nohách snížila. E(z) tedy může potlačovat expresi dac během normální regenerace nohy, zatímco Utx indukuje expresi Egfr.

dac kóduje transkripční korepresor, který je zařazen do genů mezery nohy. dac vytváří hrubé poziční hodnoty podél PD osy nohy a zprostředkovává tvorbu distální tibie a Ta1 (proximální tarsomery) během regenerace nohy cvrčka (expresní doména dac je na obrázku 2 znázorněna zeleně) (Ishimaru et al., 2015). Konkrétně dac podporuje proliferaci buněk tibie. Protože tedy RNAi proti E(z) reguluje dac, může exprese E(z) v buňkách blastému potlačovat blastemální nadměrnou proliferaci potlačením extra exprese dac.

Tato informace vyvolává otázku, jak E(z) specificky reguluje expresi dac. Dále jaký je mechanismus, který určuje cílové geny E(z)? E(z) patří do Polycombova represivního komplexu 2 (PRC2), který je jedním ze tří komplexů skupiny Polycomb (PcG) (Schuettengruber et al., 2007). Během embryogeneze cvrčka E(z) potlačuje expresi Hox genů směrem dopředu a zajišťuje správnou identitu embryí (Matsuoka et al., 2015). Tyto informace naznačují, že cílové geny E(z) se liší v závislosti na buněčném kontextu. DNA vazebný protein Pleiohomeotic (Pho) se spolu s dalšími faktory váže na elementy odpovědi Polycomb (PRE) cílových genů, načež E(z) trimetyluje histon H3K27. Ačkoli PRE byly identifikovány pouze u drozofily, metaanalýza předpokládaných cílových genů pro proteiny PcG ukázala, že mnoho cílových genů je společných pro mouchu, myš a člověka. mezi tyto geny patří dac a Egfr (Schuettengruber et al., 2007). Regulační oblast cvrččího genu dac tedy pravděpodobně obsahuje PRE, jejichž prostřednictvím E(z) epigeneticky reguluje expresi dac během regenerace cvrččí nohy (obrázek 2). Probíhající výzkum se zaměřuje na charakterizaci funkcí genu Pho a dalších genů komplexu PcG a epigenetických modifikátorů během regenerace nohy Gryllus.

Nakonec, proč RNAi E(z) způsobuje tvorbu extratibií? Jedním z hypotetických scénářů je, že když je holenní kost amputována v proximální poloze, kde je exprese dac nízká, exprese Utx (který dominuje expresi E(z)) umožňuje expresi dac (obr. 3a) obnovit holenní kost. Takto tyto histonové modifikátory vnímají hodnoty polohy podél osy PD v místě amputace a dolaďují úroveň exprese genů pro patternování nohy, jako je dac. V případě E(z) RNAi těsně před proximální amputací je indukována intenzivní exprese dac a rozšiřuje se v regenerující noze (obr. 3b). Exprese genu distal-less (Dll), což je další gen pro štěrbinu nohy, který specifikuje distální doménu nohy (Angelini a Kaufman, 2005), se může posunout více distálně v závislosti na rozšířené expresi dac (obr. 3b). Doména exprimující Egfr tak může být rozdělena na dvě části, kde (1) je exprese Dll nízká a (2) Dll vysoká. Extra-tibia pravděpodobně vzniká mezi dvěma různými Egfr-exprimujícími doménami interkalární buněčnou proliferací a patternováním (obr. 3c).

Naším cílem je objasnit plány pro „výrobu regenerované nohy“ pomocí tohoto atraktivního modelu hemimetabolického hmyzu. Očekává se, že tyto plány objasní, jak se určuje počet segmentů nohy. Naše pozoruhodná pozorování RNAi proti E(z) vedoucí k „tvorbě extra tibie“ představují důležitý krok k objasnění tohoto procesu.

1. Mito, T. a Noji, S. (2008). Cvrček dvoukřídlý Gryllus bimaculatus: An emerging Model for Developmental and Regeneration Studies (Vznikající model pro vývojové a regenerační studie). Cold Spring Harb Protoc, 331-346.
2. Umesono, Y., Tasaki, J., Nishimura, Y., Hrouda, M., Kawaguchi, E., Yazawa, S., Nishimura, O., Hosoda, K., Inoue, T. a Agata, K. (2013). Molekulární logika regenerace planárních rostlin podél osy anterior-posterior. Nature 500, 73-76.
3. Endo, T., Bryant, S. V. a Gardiner, D. M. (2004). A stepwise model system for limb regeneration (Postupný modelový systém regenerace končetin). Dev Biol 270, 135-145.
4. French, V., Bryant, P. J. a Bryant, S. V. (1976). Regulace vzorů v epimorfních polích. Science 193, 969-981.
5. Bando, T., Ishimaru, Y., Kida, T., Hamada, Y., Matsuoka, Y., Nakamura, T., Ohuchi, H., Noji, S. a Mito, T. (2013). Analýza dat RNA-Seq odhaluje zapojení signalizace JAK/STAT během regenerace nohy u cvrčka Gryllus bimaculatus. Development 140, 959-964.
6. Hamada, Y., Bando, T., Nakamura, T., Ishimaru, Y., Mito, T., Noji, S., Tomioka, K. a Ohuchi, H. (2015). Regenerace nohou je epigeneticky regulována metylací histonu H3K27 u cvrčka Gryllus bimaculatus. Development 142, 2916-2927.
7. Ishimaru, Y., Nakamura, T., Bando, T., Matsuoka, Y., Ohuchi, H., Noji, S. a Mito, T. (2015). Zapojení jezevčíka a distálního bezvládí do tvorby distálního vzoru cvrččí nohy během regenerace. Sci Rep 5, 8387.
8. Schuettengruber, B., Chourrout, D., Vervoort, M., Leblanc, B. a Cavalli, G. (2007). Regulace genomu pomocí proteinů polycomb a trithorax. Cell 128, 735-745.
9. Matsuoka, Y., Bando, T., Watanabe, T., Ishimaru, Y., Noji, S., Popadić, A. a Mito, T. (2015). Krátkozobý hmyz využívá jak předpotopní, tak odvozený způsob epigenetického umlčování Hox genů zprostředkovaný skupinou Polycomb. Biol Open 4, 702-709.
10. Angelini，R. a Kaufman, T. C. (2005). Přídatné orgány hmyzu a srovnávací ontogenetika. Dev Biol 286, 57-77.

(1 hlasů)