Wprowadzenie

Nukleotyd macierzysty pirydyny, dinukleotyd nikotynamidowo-adeninowy (NAD+) jest obecny we wszystkich komórkach ciała i jest niezbędny dla żywotności i funkcji komórek.

Jako kofaktor odpowiedzialny za transport elektronów do łańcucha oddechowego, NAD+ i jego para redoks NADH są kluczowe dla produkcji energii (ATP) w mitochondriach poprzez fosforylację oksydacyjną. Fosforylowany metabolit NAD+, NADP+ z jego parą redoks NADPH, dostarcza również siły redukującej do wielu reakcji anabolicznych, w tym syntezy cholesterolu i kwasów nukleinowych, wydłużania kwasów tłuszczowych i regeneracji glutationu (GSH), jednego z głównych antyoksydantów organizmu. W sumie ta rodzina nukleotydów pirydynowych przyczynia się do wymiany redoks w ponad 400 reakcjach enzymatycznych. Co ważne, podczas działania jako para redoks NAD+ nie jest zużywany. Jednakże, NAD+ służy również jako substrat dla wielu innych ważnych procesów metabolicznych i dlatego jest zużywany w wyniku ich reakcji chemicznych, potencjalnie wyczerpując zasoby NAD+ w tkankach. Do tej liczby należą reakcje napędzane przez rodzinę enzymów poli adenozyno-fosforybozy-rybozy (ADPR) (PARP 1-17) kontrolujących naprawę DNA i stabilność jądrową, enzymy kontroli epigenetycznej (Sirt1-7), międzykomórkową komunikację immunologiczną (CD38/CD157) i regenerację neuronów (SARM1; Essuman i in., 2017). Potencjał istnieje zatem dla zaburzeń metabolizmu komórkowego na wielu poziomach w warunkach, w których zużycie NAD+ przez te enzymy przekracza podaż NAD+ lub syntezę.

Kliniczne znaczenie utrzymania komórkowych poziomów NAD+ zostało ustalone na początku ubiegłego wieku wraz z odkryciem, że pellagra, choroba charakteryzująca się biegunką, zapaleniem skóry, demencją i śmiercią, może być wyleczona za pomocą żywności zawierającej prekursor NAD+ – niacynę (znaną również jako witamina B3; Goldberger, 1914). Chociaż pellagra jest rzadka w krajach rozwiniętych, wykazano, że komórkowe stężenie NAD+ zmniejsza się w warunkach zwiększonego uszkodzenia oksydacyjnego, jakie występuje podczas starzenia się (Braidy et al., 2011; Massudi et al., 2012; Guest et al., 2014). Altered levels of NAD+ have been found to accompany several disorders associated with increased oxidative/free radical damage including diabetes (Wu et al., 2016), heart disease (Pillai et al., 2005), age-related vascular dysfunction (Csiszar et al., 2019), ischemic brain injury (Ying and Xiong, 2010), misfolded neuronal proteins (Zhou et al., 2015) i demencji Alzheimera (Abeti i Duchen, 2012).

Oprócz patologicznych znaków rozpoznawczych, jakimi są blaszki Aβ i splątki neurofibrylarne tau, uszkodzenia oksydacyjne są spójnym znaleziskiem w chorobie Alzheimera i są powszechnie uznawane za wczesne wydarzenie w procesie patogenetycznym, nawet poprzedzające odkładanie się Aβ (Su i in., 2008). Chociaż reaktywne formy tlenu (ROS) powodujące to uszkodzenie prawdopodobnie pochodzą z wielu źródeł, uważa się, że dominującą rolę odgrywają dysfunkcyjne mitochondria i dostępność metali aktywnych redoks, takich jak Fe++ i Cu+ (Zhua i in., 2007).

Główną konsekwencją komórkowego stresu oksydacyjnego, w mózgu i w innych miejscach, są jedno- lub dwuniciowe pęknięcia DNA. W odpowiedzi na uszkodzenia DNA, PARP1 hydrolizuje NAD+ w celu wytworzenia polimerów ADP-rybozy (Ying, 2013). Wykazaliśmy wcześniej, że poziomy NAD+ były odwrotnie skorelowane z miarami stresu oksydacyjnego w tkankach ludzkich (Massudi i in., 2012) oraz w mózgu szczura (Braidy i in., 2014). Tak więc, podczas gdy obniżony poziom NAD+ w mózgu żyjących osób cierpiących na chorobę Alzheimera czeka na potwierdzenie technikami nieinwazyjnymi, spójne odkrycia uszkodzeń oksydacyjnych w mózgu post mortem silnie wspierają pogląd, że przyspieszony obrót NAD+ i wyczerpanie przyczyniają się do dysfunkcji neurologicznej w tej chorobie. Ponieważ interwencje ukierunkowane na przywrócenie NAD+ wykazano w modelach zwierzęcych w celu wspierania zdrowego starzenia się i poprawy funkcji metabolicznych (Yoshino i in., 2011; Mills i in., 2016) i demencji (Long i in., 2015), strategie mające na celu podniesienie poziomu NAD+ u ludzi są aktywnie explored.

Najbardziej bezpośrednią metodą zwiększenia poziomu NAD+ jest dożylne (IV) podawanie. Chociaż dane z badań eksperymentalnych są minimalne, znaczące korzyści kliniczne z IV infuzji NAD+ w wycofaniu alkoholu zostały wcześniej zgłoszone (O’Holleran, 1961; Mestayer, 2019). Co zaskakujące, podczas gdy doustne podawanie prekursorów NAD+, takich jak rybozyd nikotynamidu (NR) lub mononukleotyd nikotynamidu (NMN), jest entuzjastycznie badane pod kątem ich wpływu na poziom NAD+ (Yoshino i in., 2011, 2018; Mills i in., 2016; Airhart i in., 2017), losy metaboliczne i właściwości farmakokinetyczne dożylnego podawania NAD+ nie zostały jeszcze zgłoszone u ludzi. W związku z tym w niniejszym badaniu po raz pierwszy przedstawiono zmiany w stężeniach NAD+ i jego metabolitów podczas dożylnego wlewu NAD+ w kohorcie zdrowych uczestników płci męskiej.

Materiały i metody

Uczestnicy

Jedenastu (Test n = 8, Kontrola n = 3) uczestników płci męskiej w wieku 30-55 lat rekrutowano poprzez ogłoszenia w radiu, telewizji i mediach społecznościowych. Wszyscy uczestnicy mieli BMI poniżej 30 kg/m2 (Test średnia BMI = 27,5 ± 2,5 kg/m2; Kontrola średnia BMI = 24,6 ± 6,5 kg/m2), nie chorowali na cukrzycę, palili mniej niż 1 papierosa i spożywali mniej niż 2 standardowe napoje alkoholowe dziennie. Z badania wykluczono osoby przyjmujące leki obniżające stężenie lipidów lub przeciwzapalne, z niewydolnością wątroby lub nerek w wywiadzie, z niedawno przebytą infekcją bakteryjną, urazem lub innymi znaczącymi lub nieleczonymi zaburzeniami medycznymi. Uczestnicy otrzymali wynagrodzenie pieniężne za swój czas i udział w badaniu, niezależnie od tego, czy ukończyli eksperyment. Uczestnikom nie wolno było stosować naturalnych produktów zdrowotnych zawierających NAD+, NR lub nikotynamid w ciągu 14 dni przed badaniem i w jego trakcie.

Standaryzacja diety

W dniu poprzedzającym wlew dożylny NAD+ uczestnicy spożywali identyczną dietę o obniżonej zawartości niacyny i pili tylko wodę.

W dniu badania nie spożywano żadnych pokarmów, aż do momentu pobrania końcowej próbki krwi/moczu po 8 godzinach. Uczestnicy byli zachęcani do picia wody, aby pozostać normalnie nawodnionymi. Żadne inne rodzaje napojów nie były dozwolone.

Aby zapewnić uczestnikom odpowiednie spożycie energii podczas 6-godzinnej infuzji, roztwór dożylny zawierał również 0,1% dekstrozy, dostarczając około 2000 kalorii w ciągu 6-godzinnego okresu infuzji.

Protokół infuzji

Uczestników randomizowano do grupy badanej (n = 8) lub kontrolnej (n = 3). Uczestnikom w grupie badanej podawano dożylnie 750 mg NAD+ w normalnej soli fizjologicznej (Archway Apothecary, Covington, LA, USA) przez okres 6 godzin (szybkość infuzji = ~2 mg/min ≡ 3 μmoles/min). Ta dawka NAD+ została ustalona empirycznie i odzwierciedla schemat dawkowania powszechnie stosowany w klinikach (np. Springfield Wellness Clinic, Springfield, LA, USA), które w praktyce klinicznej regularnie podają dożylne wlewy NAD+. Uczestnikom w grupie kontrolnej podawano dożylnie zwykłą sól fizjologiczną przez okres 6 h.

Kliniczna administracja i nadzór nad wlewami dożylnymi i zbieraniem próbek zostały przeprowadzone w Springfield Wellness Center, Springfield, LA, USA.

Zbieranie próbek krwi

Próbki krwi linii podstawowej (TO) zostały pobrane u wszystkich uczestników po nocnym 12-godzinnym poście tak, aby wystąpiły bezpośrednio przed rozpoczęciem wlewu. Dodatkowe próbki pobierano następnie w 30, 60, 120 (2 h), 360 (6 h) i 480 (8 h) minutach po rozpoczęciu wlewu.

Krew pełną pobierano poprzez standardowe nakłucie żyły (ramię przeciwne do miejsca wlewu) do 5 mL nieżelowej heparynizowanej probówki. Natychmiast po pobraniu, krew odwirowano w temperaturze 4°C przez 10 minut przy 1,409× g.

Frakcje osocza i czerwonych krwinek zostały natychmiast oddzielone i rozdzielone do 5 × 500 μL alikwotów każda. Wszystkie podwielokrotności zostały następnie natychmiast zamrożone i przechowywane w temperaturze -80°C do czasu analizy.

Zbieranie próbek moczu

Po zebraniu podstawowej próbki moczu ze środkowego strumienia, uczestnicy zostali poproszeni o oddanie całego moczu do pojemnika(ów) dostarczonego(ych) w ciągu 30 min, 2 h, 6 h i 8 h po rozpoczęciu wlewu NAD+. Jeśli uczestnicy musieli oddawać mocz z przerwami pomiędzy tymi punktami czasowymi, byli proszeni o oddanie go do kolejnego pojemnika. Wszystkie próbki były alikwotowane i przechowywane w temperaturze -80°C natychmiast po otrzymaniu.

Metoda analityczna

Chromatograficzna separacja NAD+ i powiązanych metabolitów oraz detekcja MS Chromatografia cieczowa sprzężona z tandemową spektrometrią mas (LC/MS/MS) została przeprowadzona przy użyciu spektrometru mas Sciex QTRAP 5500 (Sciex, Redwood City, CA, USA), jak wcześniej opisano (Clement i in., 2018). Krótko mówiąc, 100 μL ludzkiego osocza lub moczu ekstrahowano w 400 μL lodowatego metanolu, odwirowywano w temperaturze 4°C przez 10 min i filtrowano przez wkłady membranowe 3 kDa. Ekstrakty próbek suszono w próżni, rekonstytuowano w 200 μL buforu 100 mM NH4OAc i przenoszono do szklanych fiolek o pojemności 200 μL i zakrywano przed analizą LC/MS/ MS. Standardy i próbki (20 μL) wstrzykiwano na kolumnę Phenomenex NH2 (150 mm- 2 mm- 3 mm), jak opisano wcześniej. Użyto gradientu dwuskładnikowego rozpuszczalnika składającego się z 5 mM NH4OAc pH 9,5 skorygowanego amoniakiem (faza ruchoma A) i acetonitrylu (faza ruchoma B) z szybkością przepływu 250 μL/min. Początkowy skład rozpuszczalnika podczas wstrzykiwania wynosił 25 % A, po czym następował 2-minutowy gradient do 45 % A oraz szybki wzrost gradientu do 80 % A (0,1 min), który utrzymywano przez 5,9 min, ponownie zwiększano A do 95 % (2 min), utrzymywano przez 13 min, a następnie powracano do warunków początkowych (0,1 min) w celu wyrównania, przy czym całkowity czas trwania badania wynosił 30 min. Przepływ w kolumnie kierowany był do detektora MS. Krzywe kalibracji poszczególnych metabolitów zostały skonstruowane przy użyciu stosunku powierzchni piku (powierzchnia piku metabolitu podzielona przez powierzchnię piku wybranego IS) każdego kalibratora do jego stężenia.

Wewnętrzne standardy składały się z 2H2NAM (dla NAM, methylNAM i ADPR) i 13C5;-Cyclic AMP (dla NMN i NAD+). Należy zauważyć, że ponieważ etykiety izotopowe nie są komercyjnie dostępne dla wszystkich metabolitów NAD, blisko spokrewniona cząsteczka (analog strukturalny) może być również użyta (Yamada i in., 2006), pod warunkiem, że jest uważana za podobną stabilność i wydajność jonizacji podczas analizy. Standardy wewnętrzne wybrane w tym badaniu zostały wcześniej zoptymalizowane dla powiązanego metabolitu (Bustamante et al., 2017).

Bezpieczeństwo

Bezpieczeństwo IV NAD+ oceniano za pomocą testów czynności wątroby i obserwacji klinicznej wszelkich zdarzeń niepożądanych. Testy czynnościowe wątroby obejmowały surowicę, bilirubinę całkowitą (bili), fosfatazę alkaliczną (ALP), aminotransferazę alaninową (ALT), gamma glutamylotransferazę (GGT), dehydrogenazę mleczanową (LD) i aminotransferazę asparaginianową (AST).

Analiza statystyczna

Analiza statystyczna została zakończona przy użyciu programu SPSS wersja 24 i GraphPad Prism wersja 8 dla okien. Do określenia, czy średnie stężenia dla badanych analitów różniły się w ciągu 8 h oraz między grupą badaną i kontrolną, zastosowano metodę średnich nieważonych, dwukierunkową ANOVA z testem wielokrotnych porównań Bonferroniego post hoc. Test Wilcoxona Signed Ranks został użyty do określenia, czy różnice w średnich stężeniach testów czynnościowych wątroby były istotne pomiędzy punktem czasowym linii podstawowej i 8 h. Różnice uznawano za istotne statystycznie, gdy p < 0,05.

Etyka

Badanie to przeprowadzono zgodnie z Kodeksem Etycznym Światowego Stowarzyszenia Medycznego (Deklaracja Helsińska) dla eksperymentów z udziałem ludzi. Zgodę etyczną uzyskano od William Carey University Institutional Review Board, Hattiesburg, MS (protokół #2017-12). Od wszystkich uczestników uzyskano świadomą zgodę.

Wyniki

Bezpieczeństwo

Nie zaobserwowano żadnych zdarzeń niepożądanych podczas 6-godzinnego wlewu z kohortami placebo (sól fizjologiczna) lub testowymi (NAD+).

Znaczące zmniejszenie aktywności (1,3, 57, 3,6 jednostek/L) dla enzymów czynnościowych wątroby, odpowiednio GGT, LD i AST, zaobserwowano po 8 h od rozpoczęcia wlewu NAD+ (Tabela 1). Żadna istotna zmiana aktywności dla jakiegokolwiek markera funkcji wątroby nie była widoczna w 8 h w próbkach otrzymujących placebo (sól fizjologiczną), jednakże niska liczba próbek może zmniejszać czułość dyskryminacji. Zaobserwowano również znaczący wzrost bilirubiny w osoczu o 2,75 μmola/L. Jednak żadna z tych zmian nie została uznana za istotną klinicznie.

Osocze

Ciągły wlew NAD+ z szybkością 3 μmoli/min spowodował znaczący (398%) wzrost poziomu NAD+ w osoczu tylko w punkcie czasowym 6 h (tj. koniec wlewu) w stosunku do linii podstawowej (p < 0,0001). Było to znacząco różne od kontroli 6 h traktowanej solą fizjologiczną (p < 0.001).

Poziomy NAD+ pozostały podwyższone w 8 h (tj, 2 h po infuzji) w stosunku do linii podstawowej i próbek kontrolnych traktowanych solą.

Poziomy NAD+ w osoczu nie zmieniły się znacząco od linii podstawowej w całym okresie oceny 8 h w próbkach kontrolnych traktowanych solą (Figura 1A).

Podobnie do zmian obserwowanych dla NAD+, poziomy osocza metabolitu NAD+ nikotynamidu (NAM) wzrosły znacząco o 409% pod koniec infuzji NAD+ (tj, 6 h) w stosunku do linii podstawowej (p < 0,0001). Było to podobnie znacząco różne od kontroli 6 h traktowanej solą fizjologiczną (p < 0.001).

W punkcie czasowym 8 h (tj. 2 h po zakończeniu infuzji), poziomy NAM między grupą kontrolną i leczoną nie były już znacząco różne (p > 0.05).

Poziomy NAM dla próbek kontrolnych traktowanych solą fizjologiczną nie zmieniły się znacząco w okresie 8 h (p > 0.05, Figura 1B).

Zgodnie ze zmianami obserwowanymi dla NAM, poziomy osocza metabolitu NAD+ ADPR wzrosły znacząco o 393% na końcu infuzji NAD+ (tj. 6 h) w stosunku do linii podstawowej (p < 0,0001). Było to znacząco różne od kontroli traktowanej solą fizjologiczną 6 h (p < 0,0001).

W punkcie czasowym 8 h (tj. 2 h po zakończeniu infuzji) poziomy ADPR pozostały 305% powyżej linii podstawowej (p < 0,0001). Jednak nie było to znacząco większe niż poziomy ADPR w próbkach kontrolnych traktowanych solą fizjologiczną w tym samym punkcie czasowym (p > 0,05).

Poziomy ADPR dla próbek kontrolnych traktowanych solą fizjologiczną nie zmieniły się znacząco w całym 8-godzinnym okresie czasu (p > 0,05, Figura 1C).

Analiza korelacji Spearmana między średnimi grupowymi przez punkty czasowe 8 h dla dwóch metabolitów katabolicznych NAD+, NAM i ADPR, dała współczynnik korelacji 1,00 (p < 0.001).

Again, zgodnie ze zmianami obserwowanymi dla NAM, poziomy osocza metabolitu NAM, metylo-nikotynamidu (meNAM) wzrosły znacząco do 350% pod koniec infuzji NAD+ (tj, 6 h) w stosunku zarówno do linii podstawowej (p < 0,0001), jak i 6 h kontroli traktowanej solą fizjologiczną (p < 0,01).

W punkcie czasowym 8 h (tj, 2 h po zakończeniu infuzji) poziomy meNAM pozostawały 393% powyżej linii podstawowej (p < 0,0001) i znacznie większe niż próbki kontrolne traktowane solą fizjologiczną w tym samym punkcie czasowym (p < 0,05).

PoziomymeNAM dla próbek kontrolnych traktowanych solą fizjologiczną nie zmieniły się znacząco w całym 8-godzinnym okresie czasu (p > 0,05, Figura 1D).

Poziomy NMN, metabolit NAM poprzez anaboliczną ścieżkę zbawczą, były znacząco podwyższone (472%) tylko w 8-godzinnym punkcie czasowym (tj, 2 h po zakończeniu infuzji, p < 0,05).

NMN poziomy dla próbek kontrolnych traktowanych solą fizjologiczną nie zmieniły się znacząco w całym 8-godzinnym okresie czasu (p > 0,05, Figura 1E).

Mocz

Ciągły dożylny wlew NAD+ z szybkością 3 μmoli/min spowodował znaczący (538%) wzrost szybkości wydalania NAD+ z moczem w punkcie czasowym 6 h (tj, koniec infuzji) w stosunku do wydalanego w 30 min (p < 0,001). Było to również znacząco różne od ilości NAD+ wydalanego z moczem w 6 h przez kontrole traktowane solą fizjologiczną (p < 0,05).

Ilość NAD+ wydalanego w moczu zmniejszyła się o 43% (p < 0,05) w 8 h (tj, 2 h po infuzji) w stosunku do szczytowego wydalania w punkcie czasowym 6 h.

Szybkość wydalania NAD+ z moczem nie zmieniła się znacząco w okresie oceny 8 h w próbkach kontrolnych traktowanych solą fizjologiczną (Figura 2A).

Szybkość wydalania metabolitu NAD+ NAM nie zmieniała się znacząco w całym okresie 8 h badania i nie różniła się od obserwowanej szybkości wydalania NAM dla kontroli traktowanych solą fizjologiczną (Figura 2B).

Szybkość wydalania z moczem metabolitu NAM meNAM była znacząco zwiększona (403%) w punkcie czasowym 6 h (tj, koniec infuzji) w stosunku do obserwowanego w 30 min (p < 0,01). Ilość meNAM wydalana z moczem zmniejszyła się o 43% (p < 0,05) w 8 h (tj, 2 h po infuzji) w stosunku do szczytowego wydalania w punkcie czasowym 6 h.

Szybkość wydalania meNAM z moczem nie zmieniła się znacząco w okresie oceny 8 h w kontrolach traktowanych solą fizjologiczną (Figura 2C).

Dyskusja

Rosnące zainteresowanie terapiami opartymi na NAD+, w tym infuzjami NAD+, uwydatniło potrzebę wyraźniejszego zrozumienia losu NAD+ i jego metabolitów po podaniu dożylnym. Obecne badanie dokumentuje zmiany w poziomach NAD+ i kluczowych metabolitów zarówno w osoczu, jak i w moczu w ciągu 8 godzin przy zastosowaniu typowego klinicznego schematu dawkowania 750 mg NAD+ podawanego dożylnie w ciągu 6 godzin.

Co ważne, infuzja NAD+ nie spowodowała żadnych obserwowalnych zdarzeń niepożądanych w badanej kohorcie, a raczej zmniejszyła aktywność osoczową enzymów wskazujących na stres wątrobowy, takich jak wewnątrzwątrobowa LD i AST oraz enzymu po-wątrobowego (przewód żółciowy) GGT, sugerując, że integralność zarówno wewnątrzwątrobowej, jak i po-wątrobowej tkanki została wzmocniona nawet w stosunkowo krótkich ramach czasowych 8 h. Wzrost bilirubiny, produktu degradacji krwinek czerwonych, w 8 godzinie może odzwierciedlać albo bardzo mały wzrost obrotu krwinek czerwonych, co może wystąpić w wyniku hemolizy indukowanej infuzją, albo zmniejszony metabolizm hemu (Tabela 1). Jednakże, biorąc pod uwagę bardzo małą wielkość tej zmiany, nie uznano tego za istotne klinicznie.

Jak oczekiwano, u uczestników leczonych solą (tj. kontrola), poziomy osocza NAD+ i metabolitów NAM i ADPR oraz metabolitów NAM, NMN i meNAM pozostały zasadniczo niezmienione przez okres 8 h. Jednakże między 30 min a 6 h zaobserwowano wyraźny spadek NAM, meNAM i ADPR, najprawdopodobniej spowodowany efektem rozcieńczenia solą fizjologiczną. Zgodnie z tą koncepcją, wartości dla tych analitów powróciły do poziomu wyjściowego w 8 h (tj. 2 h po zakończeniu podawania soli), 2 h po zakończeniu infuzji soli).

Niespodziewanie jednak u uczestników infuzji NAD+, poziomy NAD+ w osoczu nie wzrosły do czasu po punkcie czasowym 2 h, osiągając maksimum ~400% powyżej linii podstawowej dla NAD+ i metabolitów NAM, meNAM i ADPR (odpowiednio 398%, 409%, 393%) tylko w punkcie czasowym 6 h (Figury 1A-E). Było to wewnętrznie spójne ze szczytem wydalania z moczem zarówno NAD+ jak i meNAM również występującym w 6 h przed gwałtownym spadkiem po zakończeniu infuzji (ryc. 2A-C).

NAD+ był infuzowany ze stałą szybkością 3 μmoli/min. Dlatego 90 μmoli NAD+ było infuzowane bezpośrednio do przedziału naczyniowego co 30 min dostarczając łącznie 1080 μmoli do końca infuzji w 6 h. Mieszanie wewnątrznaczyniowe z dowolnego punktu infuzji zachodzi w ciągu ~2 min; zakładając średnią objętość krwi 5, dodany NAD+, przy braku znaczącego metabolizmu lub absorpcji, odpowiadałby dodatkowemu wzrostowi (NAD+) o co najmniej 18 μM, co 30 min przez 6 h infuzji. Podczas gdy wzrost tej wielkości mieści się w granicach wykrywalności analitycznej tego badania, nie zaobserwowano wzrostu NAD+ ani jego metabolitów aż do 2 h (tj. w punkcie czasowym 6 h) ani w osoczu ani w moczu. Ta nieoczekiwana obserwacja wskazuje na szybki, i co najmniej przez pierwsze 2 h, całkowity wychwyt tkankowy i/lub metabolizm NAD+ i/lub jego metabolitów.

Liczba enzymów może osiągnąć skuteczny katabolizm NAD+, w tym sirtuiny (SIRTs 1-7) transferazy adenozynodifosforanu (ADP)-rybozy (ARTs) i polimerazy poli(ADP-rybozy) (PARPs 1-17) oraz syntazy cyklicznej ADP-rybozy (cADPR) (CD38, CD157). Pozakomórkowe pirofosfatazy NAD+ obecne w ludzkiej surowicy mogą również degradować NAD+ do AMP i NMN (Schmidt-Brauns i in., 2001). Białko powierzchniowe komórki CD73 również przekształca NMN w NR, który łatwo przekracza błony komórkowe w celu potencjalnej resyntezy do NAD+. Co ważne, glikohydrolazy katabolizujące NAD+, CD38 i CD157, pirofosfataza ektonukleotydowa (CD203a) i katabolizator NMN CD73 są ektoenzymami występującymi na wielu różnych komórkach, w tym limfoidalnych, granulocytarnych, neuronalnych i śródbłonkowych (Wei i in., 2014), a rozpuszczalne w osoczu glikohydrolazy NAD mogą być również obecne (rysunek 3; Funaro i in., 2009). Równoległy wzrost NAM i ADPR w osoczu (współczynnik korelacji 1,000, p < 0,001, dane nie pokazane) silnie sugeruje, że przynajmniej do 6 h głównym przeznaczeniem NAD + jest metabolizm poprzez rozszczepienie glikozydowego wiązania ADPribozy-nikotynamidowego do NAM i ADPR, produktów ubocznych symptomatycznych dla aktywności glikohydrolazy NAD (np. CD38). Jest to zgodne z dowodami innych, gdzie CD38, w szczególności, wykazano, że ma podstawową rolę w kontrolowaniu pozakomórkowych poziomów NAD+ (Wei i in., 2014). Dorosłe ludzkie erytrocyty są CD38 pozytywne i wyrażają wysoki poziom aktywności glikohydrolazy NAD+, rozszczepiając egzogenny NAD+ w celu dostarczenia erytrocytom rybozy ADP, która może być skutecznie pobrana do komórki (Kim i in., 1993; Albeniz i in., 2004). Brak jakiegokolwiek wzrostu NAD+ lub metabolitów, w osoczu lub moczu, do czasu po pierwszych 2 h infuzji wskazuje, że NAD+ i/lub jego metabolity są przemieszczane z zewnątrzkomórkowej przestrzeni naczyniowej i skutecznie sekwestrowane w tkankach lub przedziałach pozanaczyniowych jako NAD+ i/lub jego metabolity w tym okresie czasu.

Chociaż PARP i sirtuiny są zaangażowane w katabolizm NAD+, jako enzymy wewnątrzkomórkowe z przedstawicielami w cytoplazmie, jądrze i mitochondriach raczej nie wpływają bezpośrednio na pozakomórkowe poziomy NAD+. Można jednak oczekiwać, że enzymy te będą reagować na zmiany wewnątrzkomórkowych stężeń NAD+, NAM i NR, które mogą powstać w wyniku egzogennie dostarczonego NAD+. Rysunek 4 podsumowuje schematycznie możliwe losy egzogennego NAD+.

Podczas gdy istnieje znaczna zdolność do szybkiej degradacji egzogennie dostarczanego IV NAD+ do metabolitów składowych, warto również zauważyć, że może również występować wychwyt pozakomórkowego NAD+. Ponieważ NAD+, ma ogólny ładunek ujemny, nie jest w stanie biernie przekraczać błon komórkowych i dlatego musi być aktywnie transportowany przez membranę. To, że tak się dzieje, zostało wykazane przez wielu badaczy, którzy donieśli, że egzogenny NAD+ aplikowany do różnych typów ludzkich komórek rzeczywiście powoduje znaczne podwyższenie wewnątrzkomórkowego NAD+ (Ying et al., 2003; Zhu et al., 2005; Billington et al., 2008; Pittelli et al., 2011; Felici et al., 2013). Chociaż zaangażowany mechanizm(y) nie został jeszcze w pełni scharakteryzowany, Alano i wsp. (2010) donoszą, że egzogenny NAD+ może wnikać do neuronów przez kanały bramkowane P2X7, a inni konsekwentnie obserwują transport NAD+ przez błony za pośrednictwem hemichannels connexin 43 (CX43), nawet w stężeniach tak niskich jak 250 pM (Billington i wsp., 2008). Ponieważ koneksyny są szeroko rozpowszechnione w tkankach ludzkich, a CX43 wydaje się być najbardziej wszechobecną koneksyną w wielu typach komórek, nie można wykluczyć możliwości szybkiego wychwytu NAD+.

Więc komórkowy pobór i/lub metabolizm NAD+ i metabolitów NAM i ADPR i wtórnych metabolitów meNAM i NMN wydawał się postępować w tempie z 3 μmoles/min NAD+ infuzji dla przynajmniej pierwszych 2 h. Albo NAD+ i / lub pierwotne badane metabolity są skutecznie sekwestrowane podczas tego pierwszego 2-6 h okresu lub wtórne metabolity są również tworzone. ADPR może być poddawany recyklingowi w celu wytworzenia NAD+ z NAM (Figura 4) lub dalej metabolizowany przez ektoenzymy takie jak CD203a (pirofosfataza NAD+) w celu wytworzenia AMP, który może być dalej szybko metabolizowany do adenozyny przez CD73 a 5′-nukleotydazę (Bogan i Brenner, 2010; Horenstein i in., 2016; Morandi i in., 2018). Na poparcie tej hipotezy, wzrost poziomu adenozyny we krwi został uznany przez innych jako konsekwencja infuzji pozakomórkowego NAD+ (Szczepańska-Konkel i in., 2003). NAM może być również metabolizowany do NMN na drodze salwatoryjnej przed resyntezą do NAD+ (ryc. 3, 4) lub pod wpływem metylotransferaz wątrobowych wytwarzany jest N1-metylonikotynamid, który może być wydalany bezpośrednio lub dalej przekształcany do N-metylo-2-pirydono-5-karboksyamidu (2PY, +99% meNAM) i N-metylo-4-pirydono-3-karboksyamidu (4PY, ~0.25% meNAM) przed wydaleniem (Shibata i Matsuo, 1989; Okamoto i in…, 2003).

Jest oczywiste, że przy stosowanym reżimie dawkowania mechanizmy zaangażowane w metabolizm i sekwestrację NAD+ i metabolitów osiągnęły nasycenie gdzieś po 2 h, co spowodowało znaczne podwyższenie NAD+ w osoczu i akumulację wszystkich badanych metabolitów (NMA, ADPR, meNAM i NMN) w 6 h. Jak wspomniano wcześniej dane te wspierają pogląd, że jedną z głównych dróg metabolizmu NAD+ w tych warunkach jest rozszczepienie wiązania glikozydowego, przez ektoenzymy takie jak CD38 do produkcji NAM i ADPR. Jednak wzrost NMN w osoczu po 2 h sugeruje również, że egzogenny NAD+ jest prawdopodobnie działany przez zewnątrzkomórkowe pirofosfatazy NAD+, podnosząc NMN w osoczu i uwalniając AMP jako dodatkowy metabolit.

Podsumowując, to badanie ujawniło po raz pierwszy, że: (a) przy szybkości przepływu 3 μmole/min cały egzogennie infuzowany NAD+ był szybko i całkowicie usuwany z osocza przez co najmniej pierwsze 2 h; (b) analizowany wzrost bioproduktów metabolicznych jest zgodny z aktywnością glikohydrolaz NAD+ i pirofosfatazy NAD+; oraz (c) produkty wydalania z moczem powstające w wyniku infuzji NAD+ obejmują natywny NAD+ i meNAM, ale nie NAM.

Pomimo, że ustalenia tego badania są nowatorskie i zmierzają w pewnym stopniu do pogłębienia naszego zrozumienia czasowego losu egzogennego NAD+ u ludzi, zidentyfikowano ograniczenia. Aby poprawić ogólne metaboliczne przeliczanie przyszłe badania powinny zbadać zmiany w czerwonych komórkach NAD+ i metabolitów i wydalanie z moczem wtórnych metabolitów meNAM, 2PY i 4PY. Ponadto, prawdopodobnie przydatna będzie ocena wpływu egzogennego NAD+ na zmiany w metabolizmie puryn, która powinna obejmować co najmniej ocenę osoczowego i czerwonokrwinkowego AMP i adenozyny. Zastosowanie modeli zwierzęcych może również pomóc w wyjaśnieniu względnego zaangażowania różnych szlaków metabolicznych poprzez zastosowanie odpowiednich inhibitorów farmakologicznych i pobieranie próbek tkanek.

W podsumowaniu, to badanie było w stanie ujawnić po raz pierwszy kilka bardzo użytecznych, wcześniej nieznanych, informacji o losie egzogennego IV NAD+ u ludzi, w tym, ogólne bezpieczeństwo i tolerancja infuzji IV NAD+ w tempie 3 μmoli/min, szybkiego sekwestrowania NAD+ z osocza, prawdopodobnego udziału zarówno glikohydrolazy NAD+ jak i aktywności pirofosforanu NAD+ w metabolizmie NAD+ oraz najwyraźniej skutecznej reabsorpcji NAM w kanalikach nerkowych. Konieczne jest jednak przeprowadzenie dodatkowych badań w celu pełnego ujawnienia złożonego metabolicznego losu tej ważnej cząsteczki. Ponadto, charakterystyka tych zmian pomoże w rozwoju i poprawie schematów leczenia opartych na NAD+ dla zaburzeń, które prawdopodobnie skorzystają ze zwiększonej dostępności NAD+, w tym warunków wymagających zwiększonej regeneracji i naprawy komórkowej, takich jak choroba Alzheimera i inne demencje neurodegeneracyjne.

Dostępność danych

Zestawy danych wygenerowane dla tego badania są dostępne na żądanie do odpowiedniego autora.

Oświadczenie o etyce

Badania z udziałem ludzi zostały przejrzane i zatwierdzone przez William Carey University Institutional Review Board, Hattiesburg, MS (protokół #2017-12). Pacjenci/uczestnicy wyrazili pisemną świadomą zgodę na udział w tym badaniu.

Wkład autorów

RG uczestniczył w projektowaniu i nadzorowaniu badania, krytycznej dyskusji i autorstwie manuskryptu. JBer uczestniczył w projektowaniu badania, krytycznej dyskusji, zbieraniu danych, analizie statystycznej, redagowaniu i przeglądzie manuskryptu. RM uczestniczył w projektowaniu badania, krytycznej dyskusji, nadzorze klinicznym i przeglądzie manuskryptu. NB brał udział w analizie biochemicznej i przeglądzie manuskryptu. JW brał udział w projektowaniu badania, krytycznej dyskusji i przeglądzie manuskryptu. JBen uczestniczył w zbieraniu danych i przeglądzie manuskryptu. SB uczestniczył w projektowaniu badania i przeglądzie manuskryptu. Wszyscy autorzy przejrzeli, przeczytali i zatwierdzili ostateczną wersję manuskryptu i zgadzają się z kolejnością prezentacji autorów.

Funding

This study was funded jointly by the NAD+ Research Inc, (LA, USA) oraz Australasian Research Institute Incorporation (Sydney, Australia) i zostało przeprowadzone w Springfield Wellness Center, Springfield, LA, USA.

Oświadczenie o konflikcie interesów

RM jest dyrektorem NAD+ Research Inc. oraz dyrektorem medycznym Springfield Wellness Center, które stosuje IV NAD jako terapię kliniczną. SB otrzymał honoraria za konsultacje od NAD+ Research Inc.

Pozostali autorzy oświadczają, że badania zostały przeprowadzone przy braku jakichkolwiek komercyjnych lub finansowych powiązań, które mogłyby być interpretowane jako potencjalny konflikt interesów.

Podziękowania

Pragniemy podziękować Archway Apothecary Pty Limited, LA, USA za nieodpłatne dostarczenie IV NAD+ na potrzeby tego projektu.

.