Reagens
PET erhölls från kommersiella flaskor. Alla andra kemikalier köptes med högsta renhet från Sigma-Aldrich, Carl Roth, Alfa Aesar eller Acros om inget annat anges.
Syntes av ligander och substrat
Identitet och renhet hos alla syntetiserade föreningar verifierades med NMR. 1H-spektra mättes i DMSO-d6 på en Bruker Avance II 300 utrustad med ett 5 mm PABBO BB-1H/D Z-GRD Z104275/0398 sondhuvud vid 25-28 °C (fig. S7a-f). För kalibrering av mätningarna användes tetrametylsilan.
Bishydroxyetyltereftalat (BHET): BHET syntetiserades från en PET-flaska genom alkoholys med etylenglykol. Tjugo gram PET och 0,2 g vattenfri natriumacetat refluxades i 120 ml etylenglykol i 8 timmar och kyldes därefter över natten. 120 ml H2O tillsattes och filtrering utfördes vid 4 °C. Produkten tvättades med 20 ml kallt H2O och extraherades flera gånger med varmt H2O. BHET framträdde som vita nålar (18 g (68 %), Mp 210-212 °C).
Bishydroxyetyltereftalsyraamid (BHETA): BHETA syntetiserades från PET genom aminolys med 2-aminoetanol. Tjugo gram PET och 0,2 g vattenfri natriumacetat refluxades i 120 ml etanolamin i 8 timmar och kyldes därefter över natten. 120 ml H2O tillsattes och filtrering utfördes vid 4 °C. Produkten tvättades med 20 mL kallt H2O och omkristalliserades två gånger med 100 mL varmt H2O. BHETA framträdde som lätt rosiga nålar (20 g (76 %), Mp 240-243 °C).
Dimetyltereftalat (DMT): DMT syntetiserades genom förestring av tereftaloylklorid med metanol. 25 mmol tereftaloylklorid reagerades med 30 ml metanol vid RT och återflödes i 3 timmar. Efter destillering av metanolen och torkning vid 60 °C erhölls 4,08 g (Mp 144-148 °C). Tvättning med 0,5 M KOH och vatten ändrade inte smältpunkten.
Monohydroxietereftalat (MHET): MHET syntetiserades från BHET genom partiell hydrolys med KOH. 8,7 mmol BHET reagerades med 8,4 mmol KOH i 18 mL MgSO4-torkad etylenglykol vid 110-130 °C i 2,5 timmar. 30 ml H2O tillsattes och blandningen extraherades tre gånger med 5 mL CHCl3. Den vattenhaltiga fasen justerades till pH 3 med 25 % HCl och filtrerades vid 4 °C. Efter två extraktionssteg med 30 ml varmt H2O och filtrering vid 4 °C torkades utfällningen vid 60 °C (0,56 g (30 %), Mp 185-190 °C).
Monohydroxyetyltereftalsyraamid (MHETA): MHETA syntetiserades genom partiell amidering av tereftaloylklorid med etanolamin. 150 mmol NaOH och 50 mmol etanolamin i 50 mL H2O tillsattes droppvis inom 1 timme till 50 mmol tereftaloylklorid i 50 mL H2O vid 0 °C. Reaktionen genomfördes i ytterligare 2 timmar vid 0 °C och 2 timmar under återflöde, följt av varmfiltrering. pH justerades till 3 med 25 % HCl. Den erhållna suspensionen filtrerades kallt och filtratet tvättades med 20 ml kallt vatten. Produkten omkristalliserades i 100 mL varmt H2O för att ge glänsande kristaller (2,4 g (23 %), Mp 209-212 °C).
Mono-4-nitrofenyltereftalat (MpNPT): MpNPT syntetiserades genom förestring av tereftaloylklorid med 4-nitrofenolat. 50 mmol tereftaloylklorid och 50 mmol natrium-4-nitrofenolat suspenderades i 50 ml dietyleter och reagerade i 2 timmar vid 0 °C och sedan vid RT över natten. 2,5 g Na2CO3 och 4,5 g NaHCO3 i 50 mL H2O tillsattes och reagerade vid RT i 10 h. pH justerades till 8,5 med NaOH. Den olösliga fraktionen extraherades ytterligare med totalt 2,5 g Na2CO3 och 2,5 g NaHCO3 i 100 mL H2O och tvättades sedan till neutralt pH. MpNPT fälldes med HCl vid pH 3 och tvättades två gånger med 50 mL 0,1 M HCl och sedan tills pH-värdet blev neutralt. MpNPT separerades från kontaminerande bis-4-nitrofenyltereftalat genom extraktion med 100 mM NaPi pH 7,4 och syrafällning. Den mycket svagt gula slurryn torkades vid 60 °C (Mp 202 °C).
Purifiering samt kristallisering och strukturlösning
I. sakaiensis PETase (aminosyraresterna 28-290) beställdes från Genscript (Piscataway, USA) som en kodonoptimerad syntetisk gen som innehåller en C-terminal His6-tagg som subklonerades i pET-21b. Ett kodonoptimerat DNA-fragment som kodar för I. sakaiensis MHETase (aminosyraresterna 20-603) klonat i en pUC19-vektor beställdes från Genscript och subklonades senare i en pColdII-expressionsplasmid med en N-terminal His6-tagg (TAKARA BIO, Inc., Otsu, Shiga, Japan) genom FastCloning (kompletterande figur 11)30.
För proteinuttryck transformerades E. coli Shuffle T7-expressceller (New England Biolabs, Frankfurt, Tyskland) med plasmiderna och selekterades på agarplattor med lysogeny broth (LB) som innehöll 100 µgmL-1 ampicillin. Efter tillväxt över natten vid 30 °C inokulerades odlingar över natten. För överexpression användes 1 L baffled Erlenmeyer-flaskor som innehöll 200 mL LB-medium kompletterat med 100 µg mL-1 ampicillin. Cellerna odlades vid 33 °C och 160 rpm skakningshastighet till en optisk densitet vid 600 nm (OD600) på 1 innan 1 mM isopropyl β-d-1-thiogalaktopyranosid (IPTG) tillsattes. Vid en OD600 på 2,5 sänktes temperaturen till 16 °C och överexpressionen fortsatte över natten. Cellerna skördades genom centrifugering vid 4 °C, 10 000 × g i 20 minuter och förvarades vid -20 °C till vidare användning.
Cellerna splittrades genom sonikation i 50 mM TRIS-HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl, 10 mM imidazol och 1 mM Dithiothreitol (DTT) (buffert R). Cellrester avlägsnades genom centrifugering. Celextraktet laddades på en gravitationsflödeskolonn med Ni-NTA-sefaros, tvättades med buffert R kompletterad med 20 mM imidazol och eluerades med buffert R kompletterad med 200 mM imidazol (300 mM imidazol när det gäller PETase). Proteinfraktionerna renades på en Superdex75 10/300-kolonn (GE Healthcare, Solingen, Tyskland) med 20 mM TRIS pH 7,5, 150 mM NaCl, koncentrerades till ~10 mg mL-1, snabbfrystes i flytande N2 och förvarades vid -80 °C. Proteinkoncentrationerna bestämdes spektrofotometriskt med ε280 = 102 955 M-1 cm-1 (ε280 = 97 455 M-1 cm-1 för mutanten W397A). Provernas renhet uppskattades med hjälp av programvaran GelAnalyzer (version 2010a).
PETas kristalliserades i en koncentration på 10 mg mL-1 genom ångdiffusion med sittande droppar (1 µl protein plus 1 µl reservoar) vid 20 °C. Typiska PETasekristaller växte vid 20 °C med en reservoarlösning som innehöll 0,1 M natriumcitrat eller natriumacetat pH 5,0, 15 % (v/v) PEG8000 och 0,5 M litiumsulfat. MHETas kristalliserade vid en koncentration på 10 mg mL-1 genom ångdiffusion med sittande droppar (1 µl protein plus 1 µl reservoar) vid 20 °C med en reservoar som innehöll 0,1 M HEPES, pH 7,5, 30 % (v/v) 2,4-MPD och 0,12 M ammoniumsulfat (rymdgrupp P212121) eller 0,1 M MES, pH 6,5, 10 % (v/v) PEG8000 och 0,1 M zinkacetat (rymdgrupp P1). MHETas-kristaller som odlats med MPD kryokylades i sin reservoarlösning. PETasekristallen kryoskyddades med 0,1 M natriumacetat, pH 5,0, 10 % (v/v) PEG8000, 15 % (v/v) PEG400 och 0,5 M litiumsulfat. P1 MHETas-kristallen kryoskyddades med 0,1 M TRIS, pH 8,5, 5 % (v/v) PEG8000, 20 % (v/v) PEG400 och 0,5 M litiumsulfat. För derivatiseringsexperiment inkuberades kristallerna i 24 timmar i respektive kryoskyddslösning mättad med liganden och snabbfrystes i flytande kväve. MHETase-diffraktionsdata samlades in vid 100 K vid strålrör 14.1 och 14.2 i BESSY II-lagringsringen, Berlin, Tyskland31. PETase-diffraktionsdata samlades in vid strållinje P13, PETRAIII, Hamburg32. Alla diffraktionsdata bearbetades med XDS33,34.
Strukturen för PETas löstes genom molekylär ersättning med hjälp av strukturkoordinaterna för T. fusca cutinase TfCut2 (PDB-post 4CG111,23). Strukturen av MHETase komplexerat med MHETA löstes genom molekylär ersättning med hjälp av MR-pipeline MoRDa35, som placerade sex kopior av en homologimodell baserad på PDB-post 6G21 (ett opublicerat A. oryzae feruloylesteras, AoFaeB-2; 26 % identitet med MHETase med en frågetäckning på 87 %). Strukturerna kompletterades under flera omgångar av förfining med PHENIX.REFINE eller Refmac när det gäller PETase35,36 , med avbrott i manuellt modellbyggande med COOT som var omfattande för MHETase37. Strukturen för MHETas som är komplex med BA löstes genom molekylär ersättning med användning av hela den asymmetriska enheten i MHETA-kostrukturen som sökmodell respektive kompletterades. MHETA- och BA-liganderna placerades otvetydigt i respektive tätheter i förfiningens slutskede. Strukturen för det P1-ligandfria MHETaset löstes genom molekylär ersättning med hjälp av strukturkoordinater för en färdigställd MHETas-MHETA-kostruktur där liganden utelämnades. De tio kopiorna av MHETas i den asymmetriska enheten byggdes upp manuellt eller med PHENIX.AUTOBUILD och förfinades med PHENIX.REFINE36.
Generering av MHETasmutanter genom site-directed mutagenesis
För att skapa mutanter med en enda plats användes antingen Q5 kit för site-directed mutagenesis (New England Biolabs) eller QuikChange® metoden. I det första fallet användes kitet enligt tillverkarens instruktioner. När det gäller QuikChange®-metoden användes en standard-PCR-blandning (25 µl) bestående av 2,5 µl 10× Pfu-buffert (Roboklon GmbH, Berlin, Tyskland), 0,5 µl blandade desoxynukleosidtrifosfater (0,25 mM vardera), plasmid-DNA (~40 ng), 1,25 µl framåtriktade och bakåtriktade primers (10 µM; kompletterande tabell 4), 1 µl PfuPlus! polymeras (Roboklon GmbH) och 18,1 µl ultrarent vatten. För denaturering hölls temperaturen på 95 °C i 30 s. Därefter genomfördes 20 cykler med 30 s denaturering vid 95 °C, annealing i 30 s vid 63 °C och förlängning i 6 min vid 72 °C. I ett sista steg genomfördes den slutliga förlängningen vid 72 °C i 10 minuter. Efter PCR smältades DNA-mallen med DpnI (New England BioLabs) i 2 timmar vid 37 °C innan enzymet inaktiverades vid 80 °C i 10 minuter. E. coli TOP10-celler transformerades med de erhållna PCR-produkterna och utplacerades på LB-agarplattor innehållande 100 µg mL-1 ampicillin och odlades över natten vid 37 °C. Nukleotidsekvensen bekräftades genom sekvensering hos Eurofins (Ebersberg, Tyskland).
Autohydrolys av MpNPT
Hydrolys följdes spektrofotometriskt vid 400 nm vid 30 °C. Vid högre pH-värden, där hydrolysen nästan är avslutad, anpassades ett exponentiellt sönderfall. Vid lägre pH-värden beräknades nedbrytningskonstanter från de initiala hastigheterna med hänsyn till renheten och den partiella deprotoneringen av 4-nitrofenol (det förväntade värdet vid pH 7,5 är 12 420 M-1 cm-1 beräknat med ε405 nm = 18 000 M-1 cm-1 och pKa = 7,15 för 4-nitrofenol)38. Absorptionsskillnaden för 4-nitrofenol vid 400 och 405 nm var mindre än 0,5 %. Autohydrolys mättes från pH 7,5 till 12,5 i 100 mM fosfat- eller boratbuffertar och NaOH-lösningar med en hastighetskonstant på k2 = 9,2 M-1 s-1 för d/dT = k2 , dvs. k1 = 2,9 × 10-6 s-1 (kompletterande figur 12). I 100 mM TRIS pH 7,5, som också används för enzymkinetik, bestämdes k1 = 46 × 10-6 s-1 för d/dT = k1. TRIS ökar således hydrolyshastigheten ~10 gånger jämfört med den förväntade reaktionshastigheten med hydroxid vid pH 7,5.
Aktivitetstester
Aktiviteten mättes för substraten MHET och BHET med HPLC och för MpNPT med spektrofotometri. För HPLC-mätningen stoppades reaktionerna (100 µl) genom tillsats av en lika stor volym 160 mM NaPi (natriumfosfatbuffert) pH 2,5 med 20 % (v/v) dimetylsulfoxid (DMSO) och uppvärmning till 80 °C i 10 minuter. TPA, MHET och BHET separerades på en Kinetex 5 µm EVO C18 100 Å, 150 × 4,6 mm (Phenomenex, Aschaffenburg, Tyskland) med en gradient av acetonitril och 0,1 % (v/v) myrsyra i vatten vid 30 °C efter injektion av 10 µl prov. Acetonitril ökades från 5 till 44 % fram till minut 12 och sedan till 70 % vid minut 15 där förhållandet förblev konstant i 3 minuter. TPA, MHET och BHET detekterades vid 240 nm och kvantifiering realiserades med hjälp av kalibreringskurvor.
För att kvantifiera omsättningshastigheterna för MHET och BHET inkuberades reaktioner (100 µL) med 1 mM av substratet i 40 mM NaPi pH 7,5 med 80 mM NaCl och 20 % (v/v) DMSO vid 30 °C innan de stoppades och analyserades enligt ovan. MHETas användes vid 6 nM i 30 minuter vid MHET. För BHET användes en förhandsgranskning med 6 nM eller 12 nM MHETasvarianter för att identifiera potentiellt aktiva enzymer som därefter analyserades vid högre koncentrationer. Cirka 100 nM av varianterna användes i 19,25 timmar och 3 nM MHETas av vildtyp tillsattes till dessa reaktioner för fullständig omvandling av det bildade MHET till TPA som kvantifierades via HPLC. Experimentet upprepades tre gånger.
MpNPT-stocklösningar framställdes i DMSO i koncentrationerna 10, 1 och 0,1 mM. Substratkoncentrationerna var 0,1-1200 µM i 100 mM TRIS pH 7,5 eller 100 mM NaPi pH 7,5. De kinetiska parametrarna är desamma i båda buffertarna. Reaktionen i 400 µL-kuvetten startades vid 25 °C genom tillsats av enzymet till en slutkoncentration på ca 1 nM (aktiva varianter) till 500 nM (inaktiva varianter). Absorptionsförändringen följdes på en Cary50-spektrofotometer (Varian) vid 400 nm. Absorptionsförändringarna korrigerades för icke-enzymatisk hydrolys (se föregående stycke). Initiala hastigheter (i genomsnitt tio olika kombinationer av enzym- och substratkoncentrationer för varje variant) användes för att anpassa Km och vmax enligt Michaelis Menten-kinetiken. KI för kompetitiva hämmare mättes vid 30 °C och beräknas med Eq. (1)
med användning av 4-8 olika substratkoncentrationer (dvs. MpNPT). Wild type och varianterna S225A, 488A, W397A, F495A, F415A, S416A och R411Q mättes också vid 30 °C. Dessa kinetiska parametrar normaliserades på vildtypaktiviteter vid 25 °C.
För mätning av feruloyl- och klorogenatesterasaktivitet testades fyra substrat: kumarsyrametylestrar (Coum-ME), koffeinsyrametylestrar (Caff-ME), klorogensyra (Klorogen) och p-hydroxihydroxibensoesyrametylestrar (pHB-ME). UV-Vis-spektra med 10 μM ester och fri syra mättes och Δε beräknades (kompletterande figur 10). Hydrolysen mättes som för MpNPT, men med 10-35 nM enzym, 100 µM substrat och vid 335 nm (Coum-ME, Δε = -6100 M-1 cm-1), 350 nm (Caff-ME, Δε = -5700 M-1 cm-1), 350 nm (Chlorogen, Δε = -7400 M-1 cm-1) och 280 nm (pHB-ME, Δε = -3900 M-1 cm-1).
Differential scanning fluorimetry
För analys av ligandbindning till MHETas användes DSF. Experimenten genomfördes med en Prometheus NT.48 (NanoTemper, München, Tyskland). Apparaten har en fast excitationsvåglängd på 285 nm och emissionsvåglängder på 330 och 350 nm. MHETase (vikt) användes alltid med 100 µgmL-1 i den slutliga lösningen. De slutliga buffertkoncentrationerna var 100 mM TRIS pH 7,5, 150 mM NaCl med eller utan 20 % DMSO. Högkänsliga kapillärer som tillhandahålls av NanoTemper användes. Temperaturområdet 20 till ≥80 °C skannades med 0,5 K per minut. Liganderna framställdes i 21,7 mM stamlösningar och späddes till 10 mM slutlig koncentration. Den mättade lösningen (med 0 eller 42,5 % DMSO) användes som lager, om föreningarna inte löste sig helt. För föreningar som hindrar tillförlitliga mätningar genom absorption (4-nitrofenol, 4-nitrotiofenol, 2-hydroxibensoesyra) eller fluorescens (BHET) testades också 1 mM slutkoncentrationer. Tm-värdena rapporteras enligt Prometheus-programvaran (maximum av lutningen för förhållandet I330 nm/I350 nm). Experimentet utfördes som en enda mätning.
Sekvensanpassning och fylogenetiskt träd
Proteinhomologisökningar för MHETase-liknande proteiner utfördes med NCBI Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) i ESTHER-databasen (http://bioweb.ensam.inra.fr/ESTHER/general?what=blast) med hjälp av Block_X.pep-databasen22,39. Flera sekvensanpassningar utfördes genom Muscle alignment med hjälp av MEGA740. Den evolutionära historien härleddes med hjälp av Maximum Likelihood-metoden baserad på den JTT-matrisbaserade modellen41. Trädet med den högsta logiska sannolikheten (-19 562,87) visas. Initiala träd för den heuristiska sökningen erhölls automatiskt genom att tillämpa algoritmerna Neighbor-Join och BioNJ på en matris av parvisa avstånd som uppskattats med hjälp av en JTT-modell, och sedan välja den topologi som har det högsta loglikelihood-värdet. Analysen omfattade 32 aminosyrasekvenser. Alla positioner som innehöll luckor och saknade uppgifter eliminerades. Det fanns totalt 376 positioner i det slutliga datasetet. Evolutionsanalyser genomfördes i MEGA740.