Reagents
PET byl získán z komerčních lahví. Všechny ostatní chemikálie byly zakoupeny v nejvyšší čistotě od společností Sigma-Aldrich, Carl Roth, Alfa Aesar nebo Acros, pokud není uvedeno jinak.
Syntéza ligandů a substrátů
Identita a čistota všech syntetizovaných sloučenin byla ověřena pomocí NMR. 1H spektra byla měřena v DMSO-d6 na přístroji Bruker Avance II 300 vybaveném 5 mm sondou PABBO BB-1H/D Z-GRD Z104275/0398 při 25-28 °C (obr. S7a-f). Pro kalibraci měření byl použit tetramethylsilan
Bishydroxyethyl tereftalát (BHET): BHET byl syntetizován z PET lahve alkoholýzou ethylenglykolem. Dvacet gramů PET a 0,2 g bezvodého octanu sodného bylo 8 h refluxováno ve 120 ml ethylenglykolu a poté přes noc ochlazeno. Bylo přidáno 120 ml H2O a provedena filtrace při 4 °C. Produkt byl promyt 20 ml studené H2O a několikrát extrahován horkou H2O. BHET se objevil ve formě bílých jehliček (18 g (68 %), Mp 210-212 °C).
Amid kyseliny bisydroxyethyltereftalové (BHETA): BHETA byla syntetizována z PET aminolýzou 2-aminoethanolem. Dvacet gramů PET a 0,2 g bezvodého octanu sodného bylo 8 h refluxováno ve 120 ml ethanolaminu a poté přes noc ochlazeno. Bylo přidáno 120 ml H2O a při 4 °C byla provedena filtrace. Produkt byl promyt 20 ml studené H2O a dvakrát rekrystalizován 100 ml horké H2O. BHETA se objevila jako světle růžové jehly (20 g (76 %), Mp 240-243 °C).
Dimethyltereftalát (DMT): DMT byl syntetizován esterifikací tereftaloylchloridu s methanolem. 25 mmol tereftaloylchloridu reagovalo s 30 ml methanolu při RT a poté bylo refluxováno po dobu 3 h. Po destilaci methanolu a vysušení při 60 °C bylo získáno 4,08 g (Mp 144-148 °C). Promýváním 0,5 M KOH a vodou se teplota tání nezměnila.
Monohydroxyethyltereftalát (MHET): MHET byl syntetizován z BHET částečnou hydrolýzou pomocí KOH. 8,7 mmol BHET reagovalo s 8,4 mmol KOH v 18 ml ethylenglykolu sušeného MgSO4 po dobu 2,5 h při 110-130 °C. Bylo přidáno 30 ml H2O a směs byla třikrát extrahována 5 ml CHCl3. Vodná fáze byla upravena na pH 3 25% HCl a filtrována při 4 °C. Po dvou extrakčních krocích s 30 ml horké H2O a filtraci při 4 °C byla sraženina vysušena při 60 °C (0,56 g (30 %), Mp 185-190 °C).
Monohydroxyethyl-amid kyseliny tereftalové (MHETA): MHETA byla syntetizována částečnou amidací tereftaloylchloridu s ethanolaminem. 150 mmol NaOH a 50 mmol ethanolaminu v 50 ml H2O bylo přidáno po kapkách během 1 h k 50 mmol tereftaloylchloridu v 50 ml H2O při 0 °C. Reakce probíhala další 2 h při 0 °C a 2 h pod refluxem, poté následovala horká filtrace. pH bylo upraveno na 3 pomocí 25% HCl. Získaná suspenze byla filtrována za studena a filtrát byl promyt 20 ml studené vody. Produkt byl rekrystalizován ze 100 ml horké H2O za vzniku lesklých krystalů (2,4 g (23 %), Mp 209-212 °C).
Mono-4-nitrofenyl tereftalát (MpNPT): MpNPT byl syntetizován esterifikací tereftaloylchloridu se 4-nitrofenolátem. 50 mmol tereftaloylchloridu a 50 mmol 4-nitrofenolátu sodného bylo suspendováno v 50 ml diethyletheru a reagovalo 2 h při 0 °C a poté přes noc při RT. Bylo přidáno 2,5 g Na2CO3 a 4,5 g NaHCO3 v 50 ml H2O a reagovalo se 10 h při RT. pH bylo upraveno na 8,5 pomocí NaOH. Nerozpustná frakce byla dále extrahována celkem 2,5 g Na2CO3 a 2,5 g NaHCO3 ve 100 ml H2O a poté promyta do neutrálního pH. MpNPT byl vysrážen HCl při pH 3 a dvakrát promyt 50 ml 0,1 M HCl a poté do neutrálního pH. MpNPT byl oddělen od kontaminujícího bis-4-nitrofenyltereftalátu extrakcí 100 mM NaPi o pH 7,4 a srážením kyselinou. Velmi slabě žlutá suspenze byla vysušena při 60 °C (Mp 202 °C).
Purifikace i krystalizace a strukturní roztok
PETasa I. sakaiensis (aminokyselinové zbytky 28-290) byla objednána u firmy Genscript (Piscataway, USA) jako kodonově optimalizovaný syntetický gen obsahující C-terminální His6-tag subklonovaný do pET-21b. Kodonově optimalizovaný fragment DNA kódující MHETázu I. sakaiensis (aminokyselinové zbytky 20-603) klonovaný ve vektoru pUC19 byl objednán u společnosti Genscript a později subklonován do expresního plazmidu pColdII s N-terminální His6-značkou (TAKARA BIO, Inc.), Otsu, Shiga, Japonsko) pomocí rychlého klonování (doplňkový obrázek 11)30.
Pro expresi proteinu byly buňky E. coli Shuffle T7 express (New England Biolabs, Frankfurt, Německo) transformovány s plazmidy a selektovány na agarových plotnách s lyzogenním bujónem (LB) obsahujícím 100 µgmL-1 ampicilinu. Po růstu přes noc při 30 °C byly naočkovány jednodenní kultury. Pro overexpresi byly použity 1l Erlenmeyerovy baňky s přepážkou obsahující 200 ml LB média doplněného 100 µg ml-1 ampicilinu. Buňky byly kultivovány při 33 °C a rychlosti třepání 160 otáček za minutu do optické hustoty při 600 nm (OD600) 1, než byl přidán 1 mM isopropyl β-d-1-thiogalaktopyranosid (IPTG). Při OD600 2,5 byla teplota snížena na 16 °C a overexprese pokračovala přes noc. Buňky byly sklizeny centrifugací při 4 °C, 10 000 × g po dobu 20 minut a do dalšího použití uloženy při -20 °C.
Buňky byly rozrušeny sonikací v 50 mM TRIS-HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl, 10 mM imidazolu a 1 mM dithiothreitolu (DTT) (pufr R). Buněčné zbytky byly odstraněny odstředěním. Buněčný extrakt byl vložen na gravitační kolonu s Ni-NTA sefarosou, promyt pufrem R doplněným 20 mM imidazolem a eluován pufrem R doplněným 200 mM imidazolem (300 mM imidazolem v případě PETasy). Proteinové frakce byly přečištěny na koloně Superdex75 10/300 (GE Healthcare, Solingen, Německo) s 20 mM TRIS pH 7,5, 150 mM NaCl, zahuštěny na ~10 mg ml-1, bleskově zmrazeny v kapalném N2 a skladovány při -80 °C. Koncentrace bílkovin byla stanovena spektrofotometricky pomocí ε280 = 102 955 M-1 cm-1 (ε280 = 97,455 M-1 cm-1 pro mutant W397A). Čistota vzorků byla odhadnuta pomocí softwaru GelAnalyzer (verze 2010a).
PETáza byla krystalizována v koncentraci 10 mg ml-1 difuzí páry vsedě (1 µl proteinu plus 1 µl rezervoáru) při 20 °C. Typické krystaly PETasy rostly při 20 °C s rezervoárovým roztokem obsahujícím 0,1 M citrát sodný nebo octan sodný pH 5,0, 15 % (v/v) PEG8000 a 0,5 M síran lithný. MHETasa krystalizovala při koncentraci 10 mg ml-1 difuzí par vsedě (1 µl proteinu plus 1 µl rezervoáru) při 20 °C s rezervoárem obsahujícím 0,1 M HEPES, pH 7,5, 30 % (v/v) 2,4-MPD a 0,12 M síranu amonného (prostorová skupina P212121) nebo 0,1 MES, pH 6,5, 10 % (v/v) PEG8000 a 0,1 M octanu zinečnatého (prostorová skupina P1). Krystaly MHETasy vypěstované pomocí MPD byly kryochlazeny ve svém zásobním roztoku. Krystal PETasy byl kryochráněn 0,1 M octanem sodným, pH 5,0, 10 % (v/v) PEG8000, 15 % (v/v) PEG400 a 0,5 M síranem lithným. Krystal P1 MHETasy byl kryochráněn 0,1 M TRIS, pH 8,5, 5 % (v/v) PEG8000, 20 % (v/v) PEG400 a 0,5 M síranu lithného. Pro derivatizační experimenty byly krystaly inkubovány 24 hodin v příslušném roztoku kryoprotektantu nasyceném ligandem a bleskově zmrazeny v kapalném dusíku. Difrakční data MHETasy byla shromážděna při teplotě 100 K na svazkových linkách 14.1 a 14.2 úložného kruhu BESSY II, Berlín, Německo31. Difrakční data PETasy byla shromážděna na svazkové lince P13, PETRAIII, Hamburk32. Všechna difrakční data byla zpracována pomocí XDS33,34.
Struktura PETasy byla vyřešena molekulární náhradou s využitím strukturních souřadnic T. fusca cutinasy TfCut2 (položka PDB 4CG111,23). Struktura MHETázy v komplexu s MHETA byla vyřešena molekulární náhradou s využitím MR pipeline MoRDa35, která umístila šest kopií homologického modelu založeného na záznamu PDB 6G21 (nepublikovaná feruloylesteráza A. oryzae, AoFaeB-2; 26% identita s MHETázou s pokrytím dotazu 87 %). Struktury byly doplněny během několika kol zpřesňování pomocí PHENIX.REFINE nebo Refmac v případě PETase35,36 s přestávkami ručního sestavování modelu pomocí COOT, které bylo rozsáhlé v případě MHETase37. Struktura MHETasy v komplexu s BA byla řešena molekulární náhradou s využitím celé asymetrické jednotky ko-struktury MHETA jako vyhledávacího modelu a doplněna, resp. MHETA a BA ligandy byly v závěrečných fázích zpřesňování jednoznačně umístěny do příslušných hustot. Struktura MHETázy P1 bez ligandu byla vyřešena molekulární náhradou s využitím strukturních souřadnic finalizované ko-struktury MHETázy-MHETA s vynecháním ligandu. Deset kopií MHETázy v asymetrické jednotce bylo sestaveno ručně nebo pomocí PHENIX.AUTOBUILD a upřesněno pomocí PHENIX.REFINE36.
Generace mutantů MHETázy pomocí mutageneze řízené na jednom místě
Pro vytvoření mutantů řízené na jednom místě byla použita sada Q5 pro mutagenezi řízenou na jednom místě (New England Biolabs) nebo metoda QuikChange®. V prvním případě byla souprava použita podle pokynů výrobce. V případě metody QuikChange® byla použita standardní směs PCR (25 µl) sestávající z 2,5 µl 10× Pfu pufru (Roboklon GmbH, Berlín, Německo), 0,5 µl směsi deoxynukleosidtrifosfátů (každý 0,25 mM), plazmidové DNA (~40 ng), 1,25 µl přímých a reverzních primerů (10 µM; doplňková tabulka 4), 1 µl polymerázy PfuPlus! (Roboklon GmbH) a 18,1 µl ultračisté vody. Pro denaturaci byla teplota udržována na 95 °C po dobu 30 s. Poté bylo provedeno 20 cyklů 30 s denaturace při 95 °C, 30 s žíhání při 63 °C a 6 min elongace při 72 °C. V posledním kroku byla provedena závěrečná elongace při 72 °C po dobu 10 min. Po PCR byla templátová DNA trávena pomocí DpnI (New England BioLabs) po dobu 2 h při 37 °C a poté byl enzym inaktivován při 80 °C po dobu 10 min. Buňky E. coli TOP10 byly transformovány získanými produkty PCR a naneseny na LB agarové plotny obsahující 100 µg ml-1 ampicilinu a kultivovány přes noc při 37 °C. Sekvence nukleotidů byla potvrzena sekvenováním u společnosti Eurofins (Ebersberg, Německo).
Autohydrolýza MpNPT
Hydrolýza byla sledována spektrofotometricky při 400 nm při 30 °C. Při vyšších hodnotách pH, kdy hydrolýza probíhá téměř do konce, byl naměřen exponenciální rozpad. Při nižších hodnotách pH byly konstanty rozpadu vypočteny z počátečních rychlostí s přihlédnutím k čistotě a částečné deprotonizaci 4-nitrofenolu (očekávaná hodnota při pH 7,5 je 12 420 M-1 cm-1 , vypočtená s ε405 nm = 18 000 M-1 cm-1 a pKa = 7,15 pro 4-nitrofenol)38 . Rozdíl v absorpci 4-nitrofenolu při 400 a 405 nm byl menší než 0,5 %. Autohydrolýza byla měřena od pH 7,5 do 12,5 ve 100 mM fosfátovém nebo boritanovém pufru a roztoku NaOH s rychlostní konstantou k2 = 9,2 M-1 s-1 pro d/dT = k2 , tj. k1 = 2,9 × 10-6 s-1 (doplňkový obrázek 12). Ve 100 mM TRIS o pH 7,5, který se rovněž používá pro enzymovou kinetiku, bylo stanoveno k1 = 46 × 10-6 s-1 pro d/dT = k1. TRIS tedy zvyšuje rychlost hydrolýzy ~10krát oproti očekávané rychlosti reakce s hydroxidem při pH 7,5.
Testy aktivity
Aktivita byla měřena pro substráty MHET a BHET pomocí HPLC a pro MpNPT pomocí spektrofotometrie. Pro měření HPLC byly reakce (100 µl) zastaveny přidáním stejného objemu 160 mM NaPi (fosforečnanový pufr sodný) pH 2,5 s 20% (v/v) dimethylsulfoxidu (DMSO) a zahřátím na 80 °C po dobu 10 min. TPA, MHET a BHET byly po nástřiku 10 µl vzorku separovány na přístroji Kinetex 5 µm EVO C18 100 Å, 150 × 4,6 mm (Phenomenex, Aschaffenburg, Německo) s gradientem acetonitrilu a 0,1 % (v/v) kyseliny mravenčí ve vodě při 30 °C. Poměr acetonitrilu se zvyšoval z 5 % na 44 % do 12. minuty a poté na 70 % v 15. minutě, kde zůstal konstantní po dobu 3 min. TPA, MHET a BHET byly detekovány při 240 nm a kvantifikace byla realizována pomocí kalibračních křivek.
Pro kvantifikaci rychlosti obratu MHET a BHET byly reakce (100 µl) s 1 mM substrátu ve 40 mM NaPi pH 7,5 s 80 mM NaCl a 20% (v/v) DMSO inkubovány při 30 °C, než byly zastaveny a analyzovány, jak je popsáno výše. V případě MHETasy bylo použito 6 nM po dobu 30 min. V případě BHET byl k identifikaci potenciálně aktivních enzymů použit předskript s variantami MHETasy 6 nM nebo 12 nM, které byly následně analyzovány při vyšších koncentracích. Bylo použito přibližně 100 nM variant po dobu 19,25 h a do těchto reakcí byly přidány 3 nM MHETasy divokého typu pro úplnou konverzi vzniklého MHET na TPA, který byl kvantifikován pomocí HPLC. Experiment byl opakován třikrát.
Zásobní roztoky MpNPT byly připraveny v DMSO v koncentracích 10, 1 a 0,1 mM. Koncentrace substrátu byly 0,1-1200 µM ve 100 mM TRIS o pH 7,5 nebo 100 mM NaPi o pH 7,5. V případě, že se jednalo o substrát, byl použit substrát o koncentraci 0,1-1200 µM. Kinetické parametry jsou v obou pufrech stejné. Reakce v kyvetě o objemu 400 µl byla zahájena při 25 °C přidáním enzymu na konečnou koncentraci cca 1 nM (aktivní varianty) až 500 nM (neaktivní varianty). Změna absorpce byla sledována na spektrofotometru Cary50 (Varian) při 400 nm. Absorpční změny byly korigovány na neenzymatickou hydrolýzu (viz předchozí odstavec). Počáteční rychlosti (v průměru deset různých kombinací koncentrací enzymu a substrátu pro každou variantu) byly použity pro fitování Km a vmax podle Michaelisovy Mentenovy kinetiky. KI pro kompetitivní inhibitory byly měřeny při 30 °C a jsou vypočteny pomocí rovnice (1)
při použití 4-8 různých koncentrací substrátu (tj. MpNPT). Divoký typ a varianty S225A, 488A, W397A, F495A, F415A, S416A a R411Q byly rovněž měřeny při 30 °C. Tyto kinetické parametry byly normalizovány na aktivity divokého typu při 25 °C.
Pro měření aktivity feruloyl a chlorogenesterasy byly testovány čtyři substráty: metylester kyseliny kumarinové (Coum-ME), metylester kyseliny kávové (Caff-ME), kyselina chlorogenová (Chlorogen) a metylester kyseliny p-hydroxy-hydroxy-benzoové (pHB-ME). Byla změřena UV-Vis spektra s použitím 10 μM esteru a volné kyseliny a vypočteno Δε (doplňkový obr. 10). Hydrolýza byla měřena stejně jako u MpNPT, ale s 10-35 nM enzymu, 100 µM substrátu a při 335 nm (Coum-ME, Δε = -6100 M-1 cm-1), 350 nm (Caff-ME, Δε = -5700 M-1 cm-1), 350 nm (Chlorogen, Δε = -7400 M-1 cm-1) a 280 nm (pHB-ME, Δε = -3900 M-1 cm-1).
Diferenciální skenovací fluorimetrie
Pro analýzu vazby ligandu na MHETasu byla použita DSF. Experimenty byly prováděny pomocí přístroje Prometheus NT.48 (NanoTemper, Mnichov, Německo). Zařízení má pevnou excitační vlnovou délku 285 nm a emisní vlnové délky 330 a 350 nm. MHETáza (hm.) byla vždy použita v množství 100 µgmL-1 v konečném roztoku. Konečné koncentrace pufru byly 100 mM TRIS pH 7,5, 150 mM NaCl s 20% DMSO nebo bez něj. Byly použity vysoce citlivé kapiláry dodané společností NanoTemper. Teplotní rozsah 20 až ≥80 °C byl snímán rychlostí 0,5 K za minutu. Ligandy byly připraveny v 21,7 mM zásobních roztocích a naředěny na konečnou koncentraci 10 mM. Nasycený roztok (s 0 nebo 42,5 % DMSO) byl použit jako zásobní, pokud se sloučeniny plně nerozpustily. U sloučenin bránících spolehlivému měření pomocí absorpce (4-nitrofenol, 4-nitrothiofenol, kyselina 2-hydroxybenzoová) nebo fluorescence (BHET) byly rovněž testovány 1 mM konečné koncentrace. Hodnoty Tm jsou uvedeny podle softwaru Prometheus (maximum sklonu pro poměr I330 nm/I350 nm). Experiment byl proveden jako jediné měření.
Srovnání sekvencí a fylogenetický strom
Vyhledávání homologie proteinů podobných MHETase bylo provedeno pomocí základního nástroje NCBI pro lokální vyhledávání zarovnání (BLAST) v databázi ESTHER (http://bioweb.ensam.inra.fr/ESTHER/general?what=blast) s použitím databáze Block_X.pep22,39 . Zarovnání vícenásobných sekvencí bylo provedeno metodou Muscle alignment pomocí programu MEGA740. Evoluční historie byla odvozena pomocí metody maximální pravděpodobnosti založené na modelu založeném na matici JTT41. Zobrazen je strom s nejvyšší logaritmickou pravděpodobností (-19,562,87). Počáteční strom(y) pro heuristické hledání byly získány automaticky použitím algoritmů Neighbor-Join a BioNJ na matici párových vzdáleností odhadnutých pomocí modelu JTT a následným výběrem topologie s nejvyšší hodnotou log likelihood. Analýza zahrnovala 32 aminokyselinových sekvencí. Všechny pozice obsahující mezery a chybějící údaje byly vyřazeny. V konečném souboru dat bylo celkem 376 pozic. Evoluční analýzy byly provedeny v programu MEGA740.
.