Reagenti
Il PET è stato ottenuto da bottiglie commerciali. Tutti gli altri prodotti chimici sono stati acquistati alla massima purezza da Sigma-Aldrich, Carl Roth, Alfa Aesar o Acros se non diversamente indicato.
Sintesi di ligandi e substrati
Identità e purezza di tutti i composti sintetizzati è stata verificata mediante NMR. Spettri 1H sono stati misurati in DMSO-d6 su un Bruker Avance II 300 dotato di un 5 mm PABBO BB-1H/D Z-GRD Z104275/0398 probehead a 25-28 °C (Fig. S7a-f). Per la calibrazione delle misure tetrametilsilano è stato utilizzato.
Bishydroxyethyl terephthalate (BHET): Il BHET è stato sintetizzato da una bottiglia di PET mediante alcoolisi con glicole etilenico. Venti grammi di PET e 0,2 g di acetato di sodio anidro sono stati fatti rifluire in 120 mL di glicole etilenico per 8 ore e poi raffreddati durante la notte. Sono stati aggiunti 120 mL di H2O e la filtrazione è stata eseguita a 4 °C. Il prodotto è stato lavato con 20 mL di H2O fredda ed estratto più volte con H2O calda. BHET è apparso come aghi bianchi (18 g (68%), Mp 210-212 °C).
Amide dell’acido bishydroxyethyl terephthalic (BHETA): Il BHETA è stato sintetizzato dal PET mediante aminolisi con 2-ammino etanolo. Venti grammi di PET e 0,2 g di acetato di sodio anidro sono stati fatti rifluire in 120 mL di etanolamina per 8 ore e poi raffreddati durante la notte. Sono stati aggiunti 120 mL di H2O e la filtrazione è stata eseguita a 4 °C. Il prodotto è stato lavato con 20 mL di H2O fredda e ricristallizzato due volte con 100 mL di H2O calda. Il BHETA è apparso come aghi leggermente rosati (20 g (76%), Mp 240-243 °C).
Dimetil tereftalato (DMT): DMT è stato sintetizzato per esterificazione del cloruro di tereftaloile con metanolo. 25 mmol tereftaloil cloruro è stato fatto reagire con 30 mL di metanolo a RT e poi riflusso per 3 ore. Dopo la distillazione del metanolo e l’essiccazione a 60 °C, 4,08 g è stato ottenuto (Mp 144-148 °C). Il lavaggio con 0,5 M KOH e acqua non ha cambiato il punto di fusione.
Monohydroxyethyl terephthalate (MHET): MHET è stato sintetizzato da BHET mediante idrolisi parziale con KOH. 8,7 mmol BHET è stato fatto reagire con 8,4 mmol KOH in 18 mL di glicole etilenico essiccato con MgSO4 a 110-130 °C per 2,5 h. Trenta millilitri H2O è stato aggiunto e la miscela è stata estratta tre volte con 5 mL CHCl3. La fase acquosa è stata regolata a pH 3 con 25% HCl e filtrata a 4 °C. Dopo due fasi di estrazione con 30 mL di H2O calda e filtrazione a 4 °C, il precipitato è stato essiccato a 60 °C (0,56 g (30%), Mp 185-190 °C).
Acido monoidrossietil tereftalico ammide (MHETA): MHETA è stato sintetizzato per amidazione parziale del cloruro di tereftaloile con etanolamina. 150 mmol NaOH e 50 mmol etanolamina in 50 mL H2O sono stati aggiunti a goccia entro 1 h a 50 mmol tereftaloil cloruro in 50 mL H2O a 0 °C. La reazione è stata eseguita per altre 2 h a 0 °C e 2 h sotto riflusso, seguita da filtrazione a caldo. Il pH è stato regolato a 3 con il 25% di HCl. La sospensione ottenuta è stata filtrata a freddo e il filtrato è stato lavato con 20 mL di acqua fredda. Il prodotto è stato ricristallizzato da 100 mL di H2O calda per produrre cristalli lucidi (2,4 g (23%), Mp 209-212 °C).
Mono-4-nitrofenil tereftalato (MpNPT): MpNPT è stato sintetizzato per esterificazione del cloruro di tereftaloile con 4-nitrofenolato. 50 mmol tereftaloil cloruro e 50 mmol 4-nitrofenolato di sodio sono stati sospesi in 50 mL di etere etilico e hanno reagito per 2 ore a 0 ° C, poi a RT durante la notte. Sono stati aggiunti 2,5 g di Na2CO3 e 4,5 g di NaHCO3 in 50 mL di H2O e hanno reagito a RT per 10 ore. Il pH è stato regolato a 8,5 con NaOH. La frazione insolubile è stata ulteriormente estratta con un totale di 2,5 g Na2CO3 e 2,5 g NaHCO3 in 100 mL H2O e poi lavato fino a un pH neutro. MpNPT è stato precipitato con HCl a pH 3 e lavato due volte con 50 mL di HCl 0,1 M e poi fino a pH neutro. MpNPT è stato separato dal contaminante bis-4-nitrofenil tereftalato mediante estrazione con 100 mM NaPi pH 7.4 e precipitazione con acido. Lo slurry giallo molto debole è stato essiccato a 60 °C (Mp 202 °C).
Purificazione così come cristallizzazione e soluzione della struttura
I. sakaiensis PETase (residui aminoacidici 28-290) è stato ordinato da Genscript (Piscataway, USA) come un gene sintetico codone-ottimizzato contenente un C-terminale His6-tag subclonato in pET-21b. Un frammento di DNA codificato per I. sakaiensis MHETase (residui aminoacidici 20-603) clonato in un vettore pUC19 è stato ordinato da Genscript e successivamente subclonato in un plasmide di espressione pColdII con un tag N-terminale His6 (TAKARA BIO, Inc, Otsu, Shiga, Giappone) da FastCloning (Figura supplementare 11)30.
Per l’espressione della proteina, E. coli Shuffle T7 express cells (New England Biolabs, Francoforte, Germania) sono stati trasformati con i plasmidi e selezionati su piastre di brodo lisogenico (LB) agar contenente 100 µgmL-1 ampicillina. Dopo una crescita notturna a 30 °C, sono state inoculate le colture notturne. Per la sovraespressione, sono state utilizzate delle beute con deflettore da 1 L contenenti 200 mL di terreno LB integrato con 100 µg mL-1 di ampicillina. Le cellule sono state coltivate a 33 °C e 160 rpm di velocità di scuotimento fino ad una densità ottica a 600 nm (OD600) di 1 prima di aggiungere 1 mM di isopropil β-d-1-thiogalactopyranoside (IPTG). Ad una OD600 di 2.5, la temperatura è stata abbassata a 16 °C e la sovraespressione è continuata durante la notte. Le cellule sono state raccolte mediante centrifugazione a 4 °C, 10.000 × g per 20 min e conservate a -20 °C fino a nuovo uso.
Le cellule sono state disgregate mediante sonicazione in 50 mM TRIS-HCl, pH 7.5, 150 mM NaCl, 10 mM imidazolo e 1 mM Dithiothreitol (DTT) (buffer R). I detriti cellulari sono stati eliminati per centrifugazione. L’estratto cellulare è stato caricato su una colonna a flusso di gravità con sefarosio Ni-NTA, lavato con tampone R integrato con 20 mM di imidazolo ed eluito con tampone R integrato con 200 mM di imidazolo (300 mM di imidazolo nel caso della PETasi). Frazioni proteiche sono state purificate su una colonna Superdex75 10/300 (GE Healthcare, Solingen, Germania) con 20 mM TRIS pH 7.5, 150 mM NaCl, concentrato a ~ 10 mg mL-1, flash-congelato in liquido N2 e conservati a -80 ° C. Le concentrazioni delle proteine sono state determinate spettrofotometricamente utilizzando ε280 = 102 955 M-1 cm-1 (ε280 = 97,455 M-1 cm-1 per il mutante W397A). La purezza dei campioni è stata stimata utilizzando il software GelAnalyzer (versione 2010a).
La PETasi è stata cristallizzata a una concentrazione di 10 mg mL-1 mediante diffusione di vapore a goccia seduta (1 µL di proteina più 1 µL di serbatoio) a 20 °C. I cristalli tipici di PETasi sono cresciuti a 20 °C con una soluzione serbatoio contenente 0,1 M citrato di sodio o acetato di sodio pH 5,0, 15% (v/v) PEG8000 e 0,5 M solfato di litio. MHETase cristallizzato ad una concentrazione di 10 mg mL-1 per diffusione di vapore di goccia seduta (1 µL proteina più 1 µL serbatoio) a 20 ° C con un serbatoio contenente 0,1 M HEPES, pH 7,5, 30% (v / v) 2,4-MPD e 0,12 M solfato di ammonio (gruppo di spazio P212121) o 0,1 MES, pH 6,5, 10% (v / v) PEG8000 e 0,1 M zinco acetato (gruppo di spazio P1). I cristalli di MHETase cresciuti con MPD sono stati crio-raffreddati nella loro soluzione di riserva. Il cristallo di PETasi è stato crioprotetto con acetato di sodio 0,1 M, pH 5,0, 10% (v/v) PEG8000, 15% (v/v) PEG400 e solfato di litio 0,5 M. Il cristallo di P1 MHETase è stato crioprotetto con 0,1 M TRIS, pH 8,5, 5% (v/v) PEG8000, 20% (v/v) PEG400 e 0,5 M solfato di litio. Per gli esperimenti di derivatizzazione, i cristalli sono stati incubati per 24 ore nella rispettiva soluzione crio-protettiva satura con il ligando e flash-congelati in azoto liquido. MHETase dati di diffrazione sono stati raccolti a 100 K a beamlines 14.1 e 14.2 dell’anello di stoccaggio BESSY II, Berlino, Germania 31. Dati di diffrazione PETase sono stati raccolti a beamline P13, PETRAIII, Amburgo 32. Tutti i dati di diffrazione sono stati elaborati con XDS33,34.
La struttura della PETasi è stata risolta mediante sostituzione molecolare utilizzando le coordinate strutturali di T. fusca cutinasi TfCut2 (PDB voce 4CG111,23). La struttura di MHETase complessata a MHETA è stata risolta per sostituzione molecolare impiegando la pipeline MR MoRDa35, che ha posizionato sei copie di un modello omologico basato sulla voce PDB 6G21 (una feruloil esterasi A. oryzae non pubblicata, AoFaeB-2; 26% di identità con MHETase con una copertura di query dell’87%). Le strutture sono state completate durante diversi cicli di raffinamento con PHENIX.REFINE o Refmac nel caso di PETase35,36 interrotto dalla costruzione manuale del modello con COOT che era esteso per MHETase37. La struttura di MHETase complessato a BA è stato risolto per sostituzione molecolare utilizzando l’intera unità asimmetrica del MHETA co-struttura come modello di ricerca e completato, rispettivamente. I ligandi MHETA e BA sono stati collocati nelle rispettive densità senza ambiguità nelle fasi finali di perfezionamento. La struttura della MHETase senza ligando P1 è stata risolta per sostituzione molecolare utilizzando le coordinate della struttura di una co-struttura MHETase-MHETA finalizzata che omette il ligando. Le dieci copie di MHETase nell’unità asimmetrica sono state costruite manualmente o da PHENIX.AUTOBUILD e raffinate con PHENIX.REFINE36.
Generazione di mutanti MHETase mediante mutagenesi sito-diretta
Per la creazione di mutanti a sito singolo, sono stati utilizzati sia il kit di mutagenesi sito-diretta Q5 (New England Biolabs) che il metodo QuikChange®. Nel primo caso, il kit è stato utilizzato secondo le istruzioni del produttore. Nel caso del metodo QuikChange®, è stata utilizzata una miscela PCR standard (25 µL) composta da 2,5 µL di buffer Pfu 10× (Roboklon GmbH, Berlino, Germania), 0,5 µL di trifosfati deossinucleosidici misti (0,25 mM ciascuno), DNA plasmidico (~40 ng), 1,25 µL di primer forward e reverse (10 µM; Tabella 4 supplementare), 1 µL di PfuPlus! polimerasi (Roboklon GmbH) e 18,1 µL di acqua ultrapura. Per la denaturazione, la temperatura è stata tenuta a 95 °C per 30 s. In seguito sono stati condotti 20 cicli di 30 s di denaturazione a 95 °C, annealing per 30 s a 63 °C ed elongazione per 6 min a 72 °C. In un ultimo passaggio l’allungamento finale è stato effettuato a 72 °C per 10 minuti. Dopo la PCR, il DNA campione è stato digerito con DpnI (New England BioLabs) per 2 ore a 37 °C prima che l’enzima fosse inattivato a 80 °C per 10 minuti. Le cellule di E. coli TOP10 sono state trasformate con i prodotti di PCR ottenuti e placcate su piastre di agar LB contenenti 100 µg mL-1 di ampicillina e coltivate per una notte a 37 °C. La sequenza nucleotidica è stata confermata mediante sequenziamento presso Eurofins (Ebersberg, Germania).
Autoidrolisi di MpNPT
L’idrolisi è stata seguita spettrofotometricamente a 400 nm a 30 °C. A valori di pH più alti, dove l’idrolisi va verso il completamento, è stato applicato il decadimento esponenziale. A valori di pH inferiori costanti di decadimento sono stati calcolati da tassi iniziali tenendo conto della purezza e la deprotonazione parziale di 4-nitrofenolo (il valore atteso a pH 7,5 è 12.420 M-1 cm-1 calcolato con ε405 nm = 18.000 M-1 cm-1 e pKa = 7,15 per 4-nitrofenolo) 38. Differenza di assorbimento di 4-nitrofenolo a 400 e 405 nm era meno di 0,5%. Autoidrolisi è stata misurata da pH 7,5 a 12,5 in 100 mM tamponi fosfato o borato e soluzioni NaOH con una costante di tasso di k2 = 9,2 M-1 s-1 per d/dT = k2, cioè k1 = 2,9 × 10-6 s-1 (Figura supplementare 12). In 100 mM TRIS pH 7.5, utilizzato anche per la cinetica enzimatica, k1 = 46 × 10-6 s-1 per d/dT = k1 è stato determinato. TRIS aumenta quindi il tasso di idrolisi ~10 volte rispetto al tasso di reazione previsto con idrossido a pH 7.5.
Test di attività
L’attività è stata misurata per i substrati MHET e BHET mediante HPLC e per MpNPT mediante spettrofotometria. Per la misurazione HPLC, le reazioni (100 µL) sono state fermate con l’aggiunta di un volume uguale di 160 mM NaPi (tampone fosfato di sodio) pH 2.5 con 20% (v/v) dimetilsolfossido (DMSO) e riscaldamento a 80 °C per 10 min. TPA, MHET e BHET sono stati separati su un Kinetex 5 µm EVO C18 100 Å, 150 × 4,6 mm (Phenomenex, Aschaffenburg, Germania) con un gradiente di acetonitrile e 0,1% (v/v) di acido formico in acqua a 30 °C dopo l’iniezione di 10 µL di campione. L’acetonitrile è stato aumentato dal 5 al 44% fino al minuto 12 e poi al 70% al minuto 15, dove il rapporto è rimasto costante per 3 minuti. TPA, MHET e BHET sono stati rilevati a 240 nm e la quantificazione è stata realizzata mediante l’uso di curve di calibrazione.
Per quantificare i tassi di turnover di MHET e BHET, le reazioni (100 µL) con 1 mM del substrato in 40 mM NaPi pH 7.5 con 80 mM NaCl e 20% (v/v) DMSO sono state incubate a 30 °C prima di essere fermate e analizzate come descritto sopra. MHETase è stato utilizzato a 6 nM per 30 min in caso di MHET. Per BHET, un prescreening con 6 nM o 12 nM varianti MHETase è stato utilizzato per identificare gli enzimi potenzialmente attivi che sono stati poi analizzati a concentrazioni più elevate. Circa 100 nM delle varianti sono state utilizzate per 19,25 h e 3 nM di MHETase wild-type sono state aggiunte a queste reazioni per la conversione completa del MHET formato in TPA che è stato quantificato tramite HPLC. L’esperimento è stato ripetuto tre volte.
Le soluzioni stock di MpNPT sono state preparate in DMSO a concentrazioni di 10, 1 e 0,1 mM. Le concentrazioni di substrato erano 0,1-1200 µM in 100 mM TRIS pH 7,5 o 100 mM NaPi pH 7,5. I parametri cinetici sono gli stessi in entrambi i buffer. La reazione nella cuvetta da 400 µL è stata avviata a 25 °C aggiungendo l’enzima a una concentrazione finale di circa 1 nM (varianti attive) fino a 500 nM (varianti inattive). Il cambiamento di assorbimento è stato seguito su uno spettrofotometro Cary50 (Varian) a 400 nm. I cambiamenti di assorbimento sono stati corretti per l’idrolisi non enzimatica (vedi paragrafo precedente). I tassi iniziali (in media dieci diverse combinazioni di concentrazioni di enzima e substrato per ogni variante) sono stati utilizzati per adattare Km e vmax secondo la cinetica di Michaelis Menten. I KI per gli inibitori competitivi sono stati misurati a 30 °C e sono calcolati con l’Eq. (1)
utilizzando 4-8 diverse concentrazioni di substrato (cioè MpNPT). Il tipo selvaggio e le varianti S225A, 488A, W397A, F495A, F415A, S416A e R411Q sono stati misurati anche a 30 °C. Questi parametri cinetici sono stati normalizzati sulle attività wild-type a 25 °C.
Per la misurazione dell’attività di feruloil e clorogenato esterasi sono stati testati quattro substrati: estere metilico di acido cumarico (Coum-ME), estere metilico di acido caffeico (Caff-ME), acido clorogenico (Chlorogen) ed estere metilico di acido p-idrossi-idrossi benzoico (pHB-ME). Gli spettri UV-Vis usando 10 μM dell’estere e dell’acido libero sono stati misurati e il Δε calcolato (Fig. 10 supplementare). L’idrolisi è stata misurata come per MpNPT, ma con 10-35 nM di enzima, 100 µM di substrato e a 335 nm (Coum-ME, Δε = -6100 M-1 cm-1), 350 nm (Caff-ME, Δε = -5700 M-1 cm-1), 350 nm (Chlorogen, Δε = -7400 M-1 cm-1) e 280 nm (pHB-ME, Δε = -3900 M-1 cm-1).
Fluorimetria a scansione differenziale
Per l’analisi del legame del ligando alla MHETasi, è stata utilizzata la DSF. Gli esperimenti sono stati condotti con un Prometheus NT.48 (NanoTemper, Monaco, Germania). Il dispositivo ha una lunghezza d’onda di eccitazione fissa di 285 nm e lunghezze d’onda di emissione di 330 e 350 nm. MHETase (wt) è stato sempre usato a 100 µgmL-1 nella soluzione finale. Le concentrazioni finali del tampone erano 100 mM TRIS pH 7.5, 150 mM NaCl con o senza 20% DMSO. Sono stati utilizzati capillari ad alta sensibilità forniti da NanoTemper. L’intervallo di temperatura da 20 a ≥80 °C è stato scansionato a 0,5 K al minuto. Ligandi sono stati preparati in 21,7 mM soluzioni stock e diluiti a 10 mM concentrazione finale. La soluzione satura (con 0 o 42,5% DMSO) è stato utilizzato come stock, se i composti non si dissolvono completamente. Per i composti che ostacolano misure affidabili per assorbimento (4-nitrofenolo, 4-nitrotiofenolo, acido 2-idrossibenzoico) o fluorescenza (BHET) sono state testate anche concentrazioni finali di 1 mM. I valori di Tm sono riportati come fornito dal software Prometheus (massimo della pendenza per il rapporto I330 nm/I350 nm). L’esperimento è stato eseguito come una singola misura.
Allineamento delle sequenze e albero filogenetico
Ricerche di omologia della proteina per le proteine MHETase-like sono state eseguite con lo strumento di ricerca NCBI allineamento locale di base (BLAST) nel database ESTHER (http://bioweb.ensam.inra.fr/ESTHER/general?what=blast) utilizzando il database Block_X.pep22,39. L’allineamento di sequenze multiple è stato eseguito tramite allineamento muscolare utilizzando MEGA740. La storia evolutiva è stata dedotta utilizzando il metodo della massima verosimiglianza basato sul modello basato sulla matrice JTT41. L’albero con la massima verosimiglianza log (-19.562,87) è mostrato. Gli alberi iniziali per la ricerca euristica sono stati ottenuti automaticamente applicando gli algoritmi Neighbor-Join e BioNJ a una matrice di distanze a coppie stimate utilizzando un modello JTT, e selezionando poi la topologia con il valore di log likelihood superiore. L’analisi ha coinvolto 32 sequenze di aminoacidi. Tutte le posizioni contenenti lacune e dati mancanti sono state eliminate. C’era un totale di 376 posizioni nel dataset finale. Le analisi evolutive sono state condotte in MEGA740.