Reagents
PETは市販ボトルから入手したものを使用した。
リガンドと基質の合成
合成したすべての化合物の同一性と純度は、NMRで確認した。 1H スペクトルは、5 mm PABBO BB-1H/D Z-GRD Z104275/0398 プローブヘッドを装備した Bruker Avance II 300 で DMSO-d6 中、25-28 ℃で測定した（図 S7a-f）。 測定値の較正にはテトラメチルシランを用いた。
Bishydroxyethyl terephthalate (BHET): BHETはPETボトルからエチレングリコールでアルコール分解して合成された。 20gのPETと0.2gの無水酢酸ナトリウムを120mLのエチレングリコール中で8時間還流させ、その後一晩冷却した。 120 mL H2Oを加え、4℃で濾過を行った。 生成物を 20 mL の冷 H2O で洗浄し、熱 H2O で数回抽出した。 BHETは白色の針として現れた（18 g (68%), Mp 210-212 ℃）
Bishydroxyethyl terephthalic acid amide (BHETA): BHETAは、2-アミノエタノールによるアミノリシスによってPETから合成された。 20gのPETと0.2gの無水酢酸ナトリウムを120mLのエタノールアミンで8時間還流させ、その後一晩冷却した。 120 mL H2Oを加え、4℃で濾過を行った。 生成物を 20 mL の冷 H2O で洗浄し、100 mL の熱 H2O で 2 回再結晶を行った。 BHETAは薄バラ針として現れた（20 g (76%), Mp 240-243 ℃）。
Dimethyl terephthalate (DMT): テレフタロイルクロライドをメタノールでエステル化することによりDMTを合成した。 25 mmolのテレフタロイルクロリドを30 mLのメタノールと常温で反応させ、3時間還流させた。メタノールを留去し、60℃で乾燥後、4.08 gを得た (Mp 144-148 ℃)。 0.5 M KOHと水で洗浄しても融点は変わらなかった。
Monohydroxyethyl terephthalate (MHET): MHETはBHETからKOHによる部分加水分解で合成した。 8.7mmolのBHETを18mLのMgSO4乾燥エチレングリコール中で8.4mmolのKOHと110-130℃で2.5時間反応させ、30ミリリットルのH2Oを加え、混合物を5mLのCHCl3で3度抽出した。 水相を25％HClでpH 3に調整し、4℃で濾過した。 30mLの熱H2Oで2回抽出し、4℃でろ過した後、沈殿物を60℃で乾燥した（0.56g (30%), Mp 185-190℃）＜2690＞＜7896＞モノヒドロキシエチルテレフタル酸アミド（MHETA）． MHETAは、テレフタロイルクロライドをエタノールアミンで部分アミド化することによって合成された。 50 mL H2O中の150 mmol NaOHおよび50 mmolエタノールアミンを、0℃で50 mL H2O中の50 mmolテレフタロイルクロリドに1時間以内に滴下して添加した。 この反応をさらに0℃で2時間、還流下で2時間行い、その後、熱時濾過を行った。 25% HClでpHを3に調整した。 得られた懸濁液を冷濾過し、濾液を20mLの冷水で洗浄した。 生成物を100mLの熱H2Oから再結晶し、光沢のある結晶（2.4g（23％）、Mp 209-212 ℃）を得た。
Mono-4-nitrophenyl terephthalate (MpNPT): MpNPTは、テレフタロイルクロライドと4-ニトロフェノラートのエステル化によって合成された。 50 mmolのテレフタロイルクロライドと50 mmolの4-ニトロフェノール酸ナトリウムを50 mLのジエチルエーテルに懸濁し、0 ℃で2時間、その後RTで一晩反応させた。 2.5 g Na2CO3 および 4.5 g NaHCO3 in 50 mL H2O を加え、10 時間 RT で反応させ、NaOH で pH を 8.5 に調整した。 不溶性画分をさらに100mL H2O中2.5g Na2CO3および2.5g NaHCO3で抽出し、中性pHになるまで洗浄した。 MpNPTをpH 3のHClで沈殿させ、50 mL 0.1 M HClで2回洗浄し、その後中性pHになるまで洗浄した。 100 mM NaPi pH 7.4 と酸沈殿で抽出し、MpNPT を汚染しているビス-4-ニトロフェニルテレフタレートから分離した。 2690>
Purification as well as crystallization and structure solution
I. sakaiensis PETase (amino acid residues 28-290) is ordered from Genscript (Piscataway, USA) as the codon-optimized synthetic gene containing a C-terminal His6-tag subcloned into pET-21b. pUC19ベクターにクローニングしたI. sakaiensis MHETase（アミノ酸残基20-603）をコードするコドン最適化DNA断片をGenscript社から注文し、その後N末端His6-tagを有するpColdII発現プラスミドにサブクローンした（タカラバイオ社、TAKARA BIO、Inc, Otsu, Shiga, Japan）にFastCloningでサブクローニングした（補足図11）30。
タンパク質発現のために、大腸菌Shuffle T7 express細胞（New England Biolabs, Frankfurt, Germany）をプラスミドで形質転換し、100 μgmL-1 アンピシリン含有溶解ブロス（LB）寒天プレートで選別した。 30℃で一晩増殖させた後、オーバーナイト培養物を接種した。 過剰発現のために、100μg mL-1アンピシリンを補充した200mL LB培地を含む1Lバッフルアーレンマイヤーフラスコを使用した。 1 mMのイソプロピルβ-d-1-チオガラクトピラノシド（IPTG）を添加する前に、細胞を33℃、160rpmの振盪速度で600 nmの光学密度（OD600）が1になるまで増殖させた。 OD600が2.5で、温度を16℃に下げ、過剰発現を一晩続けた。 4℃、10,000×g、20分間の遠心分離により細胞を回収し、さらに使用するまで-20℃で保存した。
細胞を50 mM TRIS-HCl, pH 7.5, 150 mM NaCl, 10 mM imidazole and 1 mM Dithiothreitol (DTT) (buffer R) 中で超音波処理により破砕した。 細胞残渣は遠心分離により除去した。 細胞抽出物をNi-NTAセファロースの重力流カラムにロードし、20 mMイミダゾールを添加したバッファRで洗浄し、200 mMイミダゾールを添加したバッファR（PETaseの場合には300 mMイミダゾール）で溶出させた。 タンパク質画分を20 mM TRIS pH 7.5, 150 mM NaClのSuperdex75 10/300カラム（GE Healthcare, Solingen, Germany）で精製し、〜10 mgL-1に濃縮後、液体窒素中で瞬間冷凍し、-80℃で保管した。 タンパク質濃度は、ε280 = 102 955 M-1 cm-1 (変異体 W397A では ε280 = 97,455 M-1 cm-1) を用いて分光光度計で測定された。 サンプルの純度は GelAnalyzer ソフトウェア (Version 2010a) を用いて評価した。
PETase を 10 mg mL-1 濃度で、20 ℃で座液蒸気拡散法 (1 µL protein + 1 µL reservoir) により結晶化させた。 0.1 M クエン酸ナトリウムまたは酢酸ナトリウム pH 5.0, 15% (v/v) PEG8000 および 0.5 M 硫酸リチウムを含むリザーバー溶液を用いて、20 ℃で代表的な PETase 結晶を成長させた。 0.1 M HEPES, pH 7.5, 30% (v/v) 2,4-MPD および 0.12 M 硫酸アンモニウム (空間群 P212121) または 0.1 M MES, pH 6.5, 10% (v/v) PEG8000 および 0.1 M 酢酸亜鉛 (空間群 P1) を含むレザーバーを用いて20℃で座液蒸気拡散（タンパク質1 μLとレザーバー1 μL）によって10mg mL-1 濃度でMHETase結晶化させた。 MPDで成長させたMHETase結晶は、そのリザーバー液で凍結冷却した。 PETase結晶は、0.1M酢酸ナトリウム、pH5.0、10% (v/v) PEG8000、15% (v/v) PEG400および0.5M硫酸リチウムで凍結保護した。 P1 MHETase結晶は、0.1 M TRIS, pH 8.5, 5% (v/v) PEG8000, 20% (v/v) PEG400, 0.5 M 硫酸リチウムで低温保護された。 誘導体化実験のために、結晶はリガンドで飽和したそれぞれの凍結保護剤溶液中で24時間インキュベートされ、液体窒素中で瞬間凍結された。 MHETaseの回折データは、ドイツ、ベルリンのBESSY II蓄積リングのビームライン14.1および14.2にて100 Kで収集した31。 PETase回折データはPETRAIII（Hamburg）のビームラインP13で収集した32。 すべての回折データはXDS33,34で処理した。
PETaseの構造はT. fusca cutinase TfCut2 (PDB entry 4CG111,23) の構造座標を用いた分子置換法によって解かれた。 MHETaseとMHETAの複合体の構造はMRパイプラインMoRDa35を用いた分子置換により解かれ、PDBエントリー6G21（未発表のA. oryzae feruloyl esterase, AoFaeB-2; MHETaseと26%の同一性、クエリカバレッジ87%）に基づく相同モデルを6部配置した。 構造は、PETase35,36の場合はPHENIX.REFINEまたはRefmacによる数回の精密化によって補完され、MHETase37の場合はCOOTによる手動モデル構築によって中断された。 BAと複合化したMHETaseの構造は、 MHETA共構造の非対称ユニット全体を探索モデルとして用いた分子置換によって解かれ、 それぞれ完成しました。 MHETAおよびBAリガンドは、精密化の最終段階でそれぞれの密度に一義的に配置された。 リガンドを含まないP1 MHETaseの構造は、リガンドを除いた最終的なMHETase-MHETA共構造の構造座標を用いて、分子置換により解かれた。 非対称ユニット内のMHETaseの10個のコピーは手動またはPHENIX.AUTOBUILDで構築し、PHENIX.REFINE36で精製した。
Generation of MHETase mutants by site-directed mutagenesis
シングルサイト突然変異体の作成ではQ5部位特異的突然変異誘発キット (New England Biolabs) またはQuikChange®メソッドが使用された。 前者では、キットは製造元の説明書に従って使用した。 QuikChange® 法の場合，2.5 µL 10×Pfu buffer (Roboklon GmbH, Berlin, Germany), 0.5 µL mixed deoxynucleoside triphosphates (each 0.25 mM), プラスミドDNA (~40 ng), 1.25 µL forward and reverse primers (10 μM; Supplementary Table 4), 1 µL PfuPlus! polymerase (Roboklon GmbH) および 18.1 µL ultrapure water からなる標準PCR混合液 (25 µL) が使用された。 その後、95 ℃で30秒間の変性、63 ℃で30秒間のアニーリング、72 ℃で6分間の伸長のサイクルを20回行った。 最後のステップでは、72 °Cで10分間伸長させた。 PCR後、鋳型DNAをDpnI（New England BioLabs）で37℃、2時間消化した後、80℃で10分間酵素を不活性化した。 得られたPCR産物で大腸菌TOP10細胞を形質転換し、100 µg mL-1アンピシリンを含むLB寒天培地プレートにプレーティングし、37 °Cで一晩培養した。 塩基配列はEurofins (Ebersberg, Germany)でシークエンスにより確認した。
MpNPTの自動加水分解
加水分解は30℃で400 nmで分光光度的に追跡された。 加水分解がほぼ完了する高いpH値では指数関数的な減衰がフィットした。 低いpH値では、純度と4-ニトロフェノールの部分的な脱プロトン化を考慮して初期速度から減衰定数を計算した(pH 7.5での期待値はε405 nm = 18,000 M-1 cm-1 と4-ニトロフェノールのpKa = 7.15 で計算して12,420 M-1 cm-1) 38. 4-ニトロフェノールの400 nmと405 nmの吸光度の差は0.5%以下であった。 自動加水分解は100 mMリン酸塩またはホウ酸塩緩衝液とNaOH溶液でpH 7.5 から12.5まで測定し、d/dT = k2 、すなわちk1 = 2.9 × 10-6 s-1の速度定数を得た（補足図12）。 同じく酵素動力学に用いた 100 mM TRIS pH 7.5 では、d/dT = k1 に対して k1 = 46 × 10-6 s-1 が決定された。 TRISはpH7.5で予想される水酸化物との反応速度に比べて加水分解速度を〜10倍増加させる。
活性試験
活性は基質のMHETとBHETについてはHPLCにより、MpNPTについては分光光度計により測定された。 HPLC測定では、反応物（100 µL）に等量の160 mM NaPi（リン酸ナトリウム緩衝液）pH 2.5 with 20% (v/v) dimethyl sulfoxide (DMSO) を加え、80℃に10分間加熱して停止した。 TPA、MHET、BHETは、Kinetex 5 µm EVO C18 100Å, 150 × 4.6 mm (Phenomenex, Aschaffenburg, Germany) で、10 µLサンプル注入後、30℃でアセトニトリルおよび水中 0.1% (v/v) ギ酸のグラジェントで分離した。 アセトニトリルは12分目まで5%から44%まで増加し、15分目には70%まで増加し、その比率は3分間一定に保たれました。 TPA、MHET、BHETは240 nmで検出し、検量線を用いて定量した。
MHETとBHETのターンオーバー率を定量するため、80 mM NaClと20% (v/v) DMSOを含む40 mM NaPi pH 7.5 で基質を1 mM加えた反応 (100 μL) を30℃でインキュベートしてから停止して上記のように解析した。 MHETの場合、MHETaseは6nMで30分間使用された。 BHETの場合、6nMまたは12nMのMHETaseバリアントを用いたプレスクリーニングにより、潜在的に活性な酵素を同定し、その後、より高濃度で分析した。 約100 nMの変異体を19.25時間使用し、3 nMの野生型MHETaseをこれらの反応に加え、生成したMHETをTPAに完全に変換し、HPLCで定量化した。 実験は3回繰り返した。
MpNPTストック溶液は、10、1および0.1 mMの濃度でDMSO中に調製した。 基質濃度は、100 mM TRIS pH 7.5 または 100 mM NaPi pH 7.5 で 0.1-1200 µM であった。 キネティックパラメーターは両バッファーとも同じである。 400 µL キュベット内の反応は、約 1 nM (活性型) から 500 nM (不活性型) の最終濃度まで酵素を添加し、25 ℃で開始された。 Cary50 分光光度計 (Varian) を用いて、400 nm での吸収変化を追跡した。 吸収変化は、非酵素的加水分解（前の段落を参照）に対して補正された。 初期速度（各バリアントについて平均10種類の酵素と基質濃度の組み合わせ）は、ミカエリス・メンテンキネティクスに従ってKmとvmaxをフィッティングするために使用された。 競合阻害剤のKIは30℃で測定し、式(1)
基質（すなわちMpNPT）濃度を4〜8種類変えて使用。 野生型と変異型のS225A, 488A, W397A, F495A, F415A, S416A, R411Qも30℃で測定された。 2690>
フェルロイルエステラーゼとクロロゲン酸エステラーゼの活性を測定するために、4つの基質をテストした：クマール酸メチルエステル（Coom-ME）、カフェ酸メチルエステル（Caff-ME）、クロロゲン酸（Chlorogenic）およびp-ヒドロキシ-ヒドロキシ安息香酸メチルエステル（pHB-ME）であった。 エステルおよび遊離酸を10μM用いたUV-Visスペクトルを測定し、Δεを算出した（補足図10）。 加水分解はMpNPTと同様に測定したが、10〜35nMの酵素、100μMの基質を用い、335nm（Coom-ME、Δε＝-6100 M-1 cm-1）, 350nm（Caff-ME, Δε＝-5700 M-1 cm-1）, 350nm（Chlorogen, Δε＝-7400 M-1 cm-1）,280nm（pHB-ME, Δε＝-3900 M-1 cm-1）において測定した。
Differential Scanning Fluorimetry
MHETaseへのリガンド結合の解析には、DSFを使用した。 実験はPrometheus NT.48 (NanoTemper, Munich, Germany)で行った。 この装置は励起波長285 nm、発光波長330 nmと350 nmが固定されている。 MHETase（wt）は常に最終溶液に100 µgmL-1で使用された。 最終的なバッファー濃度は100 mM TRIS pH 7.5, 150 mM NaClと20% DMSOの併用または非併用であった。 キャピラリーは、ナノテンパー社製の高感度キャピラリーを使用した。 20から≧80℃の温度範囲を0.5K/minでスキャンした。 リガンドは21.7 mMのストック溶液を調製し、最終濃度10 mMに希釈した。 化合物が完全に溶解しない場合は、飽和溶液（0 または 42.5% DMSO入り）をストックとして使用した。 吸収測定（4-ニトロフェノール、4-ニトロチオフェノール、2-ヒドロキシ安息香酸）または蛍光測定（BHET）を妨げる化合物については、1 mM最終濃度でもテストした。 Tm値は、Prometheusソフトウェアによって提供されるように報告されている（I330 nm/I350 nm比のスロープの最大値）。 実験は1回の測定として行った。
Sequence alignment and phylogenetic tree
MHETase-like proteinのタンパク質相同性検索は、ESTHERデータベース（http://bioweb.ensam.inra.fr/ESTHER/general?what=blast）のNCBI basic local alignment search tool（BLAST）により、ブロック＿X＿pepデータベース22，39を使用して実施した。 複数配列のアライメントはMEGA740を用いたマッスルアライメントで行った。 進化史はJTTマトリックスベースモデルに基づく最尤法を用いて推論した41。 最も対数尤度の高い木（-19,562.87）を示す。 ヒューリスティック探索の初期木は、JTTモデルを用いて推定した対距離の行列にNeighbor-JoinとBioNJアルゴリズムを適用し、対数尤度の値が優れているトポロジーを選択することによって自動的に得られたものである。 解析対象は32のアミノ酸配列である。 ギャップや欠損データを含む位置はすべて削除した。 最終的なデータセットには、合計376の位置があった。 進化解析はMEGA740.
で行った。