Reactivi

PET a fost obținut din sticle comerciale. Toate celelalte substanțe chimice au fost achiziționate la cea mai mare puritate de la Sigma-Aldrich, Carl Roth, Alfa Aesar sau Acros, dacă nu se specifică altfel.

Sinteza liganzilor și a substraturilor

Identitatea și puritatea tuturor compușilor sintetizați a fost verificată prin RMN. Spectrele 1H au fost măsurate în DMSO-d6 pe un Bruker Avance II 300 echipat cu un cap de sondă PABBO BB-1H/D Z-GRD Z104275/0398 de 5 mm la 25-28 °C (Fig. S7a-f). Pentru calibrarea măsurătorilor s-a utilizat tetrametilsilan.

Bishidroxietil tereftalat (BHET): BHET a fost sintetizat dintr-o sticlă PET prin alcooliză cu etilenglicol. Douăzeci de grame de PET și 0,2 g de acetat de sodiu anhidru au fost puse la reflux în 120 ml de etilenglicol timp de 8 h și apoi răcite peste noapte. S-au adăugat 120 ml de H2O și s-a efectuat filtrarea la 4 °C. Produsul a fost spălat cu 20 ml de H2O rece și extras de mai multe ori cu H2O fierbinte. BHET a apărut sub formă de ace albe (18 g (68%), Mp 210-212 °C).

Amida acidului bishidroxietil tereftalic (BHETA): BHETA a fost sintetizată din PET prin aminoliză cu 2-aminoetanol. Douăzeci de grame de PET și 0,2 g de acetat de sodiu anhidru au fost puse la reflux în 120 ml de etanolamină timp de 8 ore și apoi răcite peste noapte. S-au adăugat 120 ml de H2O și s-a efectuat filtrarea la 4 °C. Produsul s-a spălat cu 20 ml de H2O rece și s-a recristalizat de două ori cu 100 ml de H2O fierbinte. BHETA a apărut sub formă de ace ușor trandafirii (20 g (76%), Mp 240-243 °C).

Tereftalat de dimetil (DMT): DMT a fost sintetizat prin esterificarea clorurii de tereftaloil cu metanol. 25 mmol de clorură de tereftaloil a reacționat cu 30 ml de metanol la RT și apoi a fost refluxat timp de 3 h. După distilarea metanolului și uscarea la 60 °C, s-au obținut 4,08 g (Mp 144-148 °C). Spălarea cu KOH 0,5 M și apă nu a modificat punctul de topire.

Tereftalat de monohidroxietil (MHET): MHET a fost sintetizat din BHET prin hidroliză parțială cu KOH. 8,7 mmol BHET a reacționat cu 8,4 mmol KOH în 18 ml de etilenglicol uscat cu MgSO4 la 110-130 °C timp de 2,5 h. S-au adăugat 30 mililitri H2O și amestecul a fost extras de trei ori cu 5 ml CHCl3. Faza apoasă a fost ajustată la pH 3 cu HCl 25% și filtrată la 4 °C. După două etape de extracție cu 30 ml de H2O fierbinte și filtrare la 4 °C, precipitatul a fost uscat la 60 °C (0,56 g (30%), Mp 185-190 °C).

Amida acidului monohidroxietil tereftalic (MHETA): MHETA a fost sintetizată prin amidarea parțială a clorurii de tereftaloil cu etanolamină. 150 mmol de NaOH și 50 mmol de etanolamină în 50 ml de H2O au fost adăugate picătură cu picătură în decurs de 1 h la 50 mmol de clorură de tereftaloil în 50 ml de H2O la 0 °C. Reacția a fost efectuată timp de încă 2 h la 0 °C și 2 h sub reflux, urmată de filtrare la cald. pH-ul a fost ajustat la 3 cu HCl 25%. Suspensia obținută a fost filtrată la rece, iar filtratul a fost spălat cu 20 mL de apă rece. Produsul a fost recristalizat din 100 mL de H2O fierbinte pentru a obține cristale strălucitoare (2,4 g (23%), Mp 209-212 °C).

Tereftalat de mono-4-nitrofenil (MpNPT): MpNPT a fost sintetizat prin esterificarea clorurii de tereftaloil cu 4-nitrofenolat. 50 mmol de clorură de tereftaloil și 50 mmol de 4-nitrofenolat de sodiu au fost suspendate în 50 ml de dietileter și au reacționat timp de 2 h la 0 °C, apoi la RT peste noapte. S-au adăugat 2,5 g de Na2CO3 și 4,5 g de NaHCO3 în 50 ml de H2O și s-a reacționat la RT timp de 10 h. pH-ul a fost ajustat la 8,5 cu NaOH. Fracțiunea insolubilă a fost extrasă în continuare cu un total de 2,5 g de Na2CO3 și 2,5 g de NaHCO3 în 100 ml de H2O și apoi a fost spălată până la un pH neutru. MpNPT a fost precipitat cu HCl la pH 3 și spălat de două ori cu 50 ml de HCl 0,1 M și apoi până la un pH neutru. MpNPT a fost separat de bis-4-nitrofenil tereftalatul de bis-4-nitrofenil contaminant prin extracție cu 100 mM NaPi pH 7,4 și precipitare acidă. Suspensia galbenă foarte slabă a fost uscată la 60 °C (Mp 202 °C).

Purificarea, precum și cristalizarea și soluția structurii

I. sakaiensis PETase (reziduurile de aminoacizi 28-290) a fost comandată de la Genscript (Piscataway, SUA) ca o genă sintetică optimizată din punct de vedere al codonului care conține un His6-tag C-terminal subclonat în pET-21b. Un fragment de ADN cu codon optimizat care codifică MHETase I. sakaiensis (reziduuri de aminoacizi 20-603) clonat într-un vector pUC19 a fost comandat de la Genscript și ulterior subclonat într-o plasmidă de expresie pColdII cu un His6-tag N-terminal (TAKARA BIO, Inc, Otsu, Shiga, Japonia) prin FastCloning (Figura suplimentară 11)30.

Pentru exprimarea proteinei, celulele de expresie E. coli Shuffle T7 (New England Biolabs, Frankfurt, Germania) au fost transformate cu plasmidele și selectate pe plăci de agar cu bulion de lisogenie (LB) care conțin 100 µgmL-1 ampicilină. După o creștere peste noapte la 30 °C, s-au inoculat culturile de o noapte. Pentru supraexprimare, s-au folosit flacoane Erlenmeyer cu deflectoare de 1 L conținând 200 ml de mediu LB suplimentat cu 100 µg mL-1 ampicilină. Celulele au fost cultivate la 33 °C și la o viteză de agitare de 160 rpm până la o densitate optică la 600 nm (OD600) de 1 înainte de a se adăuga 1 mM de izopropil β-d-1-thiogalactopyranoside (IPTG). La o OD600 de 2,5, temperatura a fost coborâtă la 16 °C și supraexprimarea a continuat peste noapte. Celulele au fost recoltate prin centrifugare la 4 °C, la 10 000 × g timp de 20 de minute și au fost păstrate la -20 °C până la utilizare ulterioară.

Celele au fost disruptate prin sonicare în 50 mM TRIS-HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl, 10 mM imidazol și 1 mM ditiotreitol (DTT) (tampon R). Resturile celulare au fost îndepărtate prin centrifugare. Extractul celular a fost încărcat pe o coloană de flux gravitațional cu sefaroză Ni-NTA, spălat cu tampon R suplimentat cu 20 mM de imidazol și eluat cu tampon R suplimentat cu 200 mM de imidazol (300 mM de imidazol în cazul PETazei). Fracțiunile proteice au fost purificate pe o coloană Superdex75 10/300 (GE Healthcare, Solingen, Germania) cu 20 mM TRIS pH 7,5, 150 mM NaCl, concentrate la ~10 mg mL-1, congelate rapid în N2 lichid și depozitate la -80 °C. Concentrațiile de proteine au fost determinate spectrofotometric folosind ε280 = 102 955 M-1 cm-1 (ε280 = 97,455 M-1 cm-1 pentru mutantul W397A). Puritatea probelor a fost estimată cu ajutorul software-ului GelAnalyzer (versiunea 2010a).

PETase a fost cristalizată la o concentrație de 10 mg mL-1 prin difuzie de vapori cu picături așezate (1 µL de proteină plus 1 µL de rezervor) la 20 °C. Cristalele tipice de PETază au crescut la 20 °C cu o soluție rezervor care conține citrat de sodiu 0,1 M sau acetat de sodiu pH 5,0, 15% (v/v) PEG8000 și sulfat de litiu 0,5 M. MHETase a cristalizat la o concentrație de 10 mg mL-1 prin difuzie de vapori în picături așezate (1 µL de proteină plus 1 µL de rezervor) la 20 °C cu un rezervor care conține 0,1 M HEPES, pH 7,5, 30% (v/v) 2,4-MPD și 0,12 M de sulfat de amoniu (grup spațial P212121) sau 0,1 M MES, pH 6,5, 10% (v/v) PEG8000 și 0,1 M de acetat de zinc (grup spațial P1). Cristalele de MHETază crescute cu MPD au fost crio-refrigerate în soluția lor de rezervor. Cristalul de PETază a fost crioprotejat cu acetat de sodiu 0,1 M, pH 5,0, 10% (v/v) PEG8000, 15% (v/v) PEG400 și sulfat de litiu 0,5 M. Cristalul P1 MHETase a fost crioprotejat cu 0,1 M TRIS, pH 8,5, 5% (v/v) PEG8000, 20% (v/v) PEG400 și 0,5 M sulfat de litiu. Pentru experimentele de derivatizare, cristalele au fost incubate timp de 24 de ore în soluția crio-protectoare respectivă saturată cu ligandul și congelate rapid în azot lichid. Datele de difracție MHETase au fost colectate la 100 K la liniile de fascicule 14.1 și 14.2 ale inelului de stocare BESSY II, Berlin, Germania31. Datele de difracție ale PETazei au fost colectate la beamline P13, PETRAIII, Hamburg32. Toate datele de difracție au fost procesate cu XDS33,34.

Structura PETazei a fost rezolvată prin înlocuire moleculară utilizând coordonatele structurale ale cutinazei TfCut2 din T. fusca (intrare PDB 4CG111,23). Structura MHETazei complexată cu MHETA a fost rezolvată prin înlocuire moleculară utilizând pipeline-ul MR MoRDa35, care a plasat șase copii ale unui model de omologie bazat pe intrarea PDB 6G21 (o feruloil-esterază inedită din A. oryzae, AoFaeB-2; 26% identitate cu MHETaza cu o acoperire a interogării de 87%). Structurile au fost completate în timpul mai multor runde de rafinare cu PHENIX.REFINE sau Refmac în cazul PETazei35,36 , întrerupte de construirea manuală a modelului cu COOT, care a fost extinsă în cazul MHETazei37. Structura MHETazei complexată cu BA a fost rezolvată prin înlocuire moleculară utilizând întreaga unitate asimetrică a co-structurii MHETA ca model de căutare și, respectiv, completată. Liganzii MHETA și BA au fost plasați în densitățile respective fără ambiguitate în etapele finale de rafinare. Structura MHETazei P1 fără ligand a fost rezolvată prin înlocuire moleculară utilizând coordonatele structurii unei co-structuri MHETazei-MHETA finalizate care omite ligandul. Cele zece copii ale MHETazei din unitatea asimetrică au fost construite manual sau cu PHENIX.AUTOBUILD și rafinate cu PHENIX.REFINE36.

Generarea mutanților MHETazei prin mutageneză dirijată pe site

Pentru crearea de mutanți cu un singur site, s-a folosit fie kitul de mutageneză dirijată pe site Q5 (New England Biolabs), fie metoda QuikChange®. În primul caz, kitul a fost utilizat în conformitate cu instrucțiunile producătorului. În cazul metodei QuikChange®, s-a utilizat un amestec PCR standard (25 µL) format din 2,5 µL de tampon Pfu 10× (Roboklon GmbH, Berlin, Germania), 0,5 µL de deoxinucleozide trifosfați amestecați (0,25 mM fiecare), ADN plasmidic (~40 ng), 1,25 µL de primeri înainte și înapoi (10 µM; tabelul suplimentar 4), 1 µL de polimerază PfuPlus! (Roboklon GmbH) și 18,1 µL de apă ultrapură. Pentru denaturare, temperatura a fost menținută la 95 °C timp de 30 s. Apoi s-au efectuat 20 de cicluri de 30 s de denaturare la 95 °C, aneantizare timp de 30 s la 63 °C și alungire timp de 6 min la 72 °C. Într-o ultimă etapă, s-a efectuat alungirea finală la 72 °C timp de 10 minute. După PCR, ADN-ul șablon a fost digerat cu DpnI (New England BioLabs) timp de 2 ore la 37 °C înainte ca enzima să fie inactivată la 80 °C timp de 10 minute. Celulele E. coli TOP10 au fost transformate cu produșii PCR obținuți și plasate pe plăci de agar LB care conțin 100 µg mL-1 de ampicilină și cultivate peste noapte la 37 °C. Secvența nucleotidică a fost confirmată prin secvențiere la Eurofins (Ebersberg, Germania).

Autohidroliza MpNPT

Hidroliza a fost urmărită spectrofotometric la 400 nm la 30 °C. La valori mai mari ale pH-ului, unde hidroliza merge până aproape de finalizare, s-a încadrat o descreștere exponențială. La valori mai mici ale pH-ului, constantele de descreștere au fost calculate din ratele inițiale, ținând cont de puritatea și deprotonarea parțială a 4-nitrofenolului (valoarea așteptată la pH 7,5 este de 12 420 M-1 cm-1 calculată cu ε405 nm = 18 000 M-1 cm-1 și pKa = 7,15 pentru 4-nitrofenol)38. Diferența de absorbție a 4-nitrofenolului la 400 și 405 nm a fost mai mică de 0,5%. Autohidroliza a fost măsurată de la pH 7,5 la 12,5 în soluții tampon de 100 mM de fosfat sau de borat și în soluții de NaOH cu o constantă de viteză de k2 = 9,2 M-1 s-1 pentru d/dT = k2 , adică k1 = 2,9 × 10-6 s-1 (Figura suplimentară 12). În 100 mM TRIS pH 7,5, utilizat, de asemenea, pentru cinetica enzimatică, s-a determinat k1 = 46 × 10-6 s-1 pentru d/dT = k1. Astfel, TRIS crește rata de hidroliză de ~10 ori față de rata de reacție așteptată cu hidroxidul la pH 7,5.

Teste de activitate

Activitatea a fost măsurată pentru substraturile MHET și BHET prin HPLC și pentru MpNPT prin spectrofotometrie. Pentru măsurarea HPLC, reacțiile (100 µL) au fost oprite prin adăugarea unui volum egal de 160 mM NaPi (tampon fosfat de sodiu) pH 2,5 cu 20% (v/v) dimetilsulfoxid (DMSO) și încălzirea la 80 °C timp de 10 min. TPA, MHET și BHET au fost separate pe un Kinetex 5 µm EVO C18 100 Å, 150 × 4,6 mm (Phenomenex, Aschaffenburg, Germania) cu un gradient de acetonitril și 0,1% (v/v) acid formic în apă la 30 °C după injectarea a 10 µL de probă. Acetonitrilul a fost crescut de la 5 la 44% până la minutul 12 și apoi la 70% la minutul 15, unde raportul a rămas constant timp de 3 min. TPA, MHET și BHET au fost detectate la 240 nm, iar cuantificarea a fost realizată prin utilizarea curbelor de calibrare.

Pentru a cuantifica ratele de turnover ale MHET și BHET, reacțiile (100 µL) cu 1 mM de substrat în 40 mM NaPi pH 7,5 cu 80 mM NaCl și 20% (v/v) DMSO au fost incubate la 30 °C înainte de a fi oprite și analizate conform descrierii de mai sus. MHETase a fost utilizată la 6 nM timp de 30 min în cazul MHET. În cazul BHET, s-a utilizat o preselecție cu variante de MHETază 6 nM sau 12 nM pentru a identifica enzimele potențial active, care au fost ulterior analizate la concentrații mai mari. Aproximativ 100 nM de variante au fost utilizate timp de 19,25 h, iar 3 nM de MHETază de tip sălbatic au fost adăugate la aceste reacții pentru conversia completă a MHET format în TPA, care a fost cuantificat prin HPLC. Experimentul a fost repetat de trei ori.

Soluțiile stoc de MPNPT au fost preparate în DMSO la concentrații de 10, 1 și 0,1 mM. Concentrațiile de substrat au fost de 0,1-1200 µM în 100 mM TRIS pH 7,5 sau 100 mM NaPi pH 7,5. Parametrii cinetici sunt aceiași în ambele soluții tampon. Reacția în cuva de 400 µL a fost inițiată la 25 °C prin adăugarea enzimei la o concentrație finală de aproximativ 1 nM (variante active) până la 500 nM (variante inactive). Modificarea absorbției a fost urmărită pe un spectrofotometru Cary50 (Varian) la 400 nm. Modificările de absorbție au fost corectate pentru hidroliza neenzimatică (a se vedea paragraful anterior). Vitezele inițiale (în medie zece combinații diferite de concentrații de enzimă și substrat pentru fiecare variantă) au fost utilizate pentru ajustarea Km și vmax în conformitate cu cinetica Michaelis Menten. KI pentru inhibitorii competitivi au fost măsurați la 30 °C și sunt calculați cu Ecuația (1)

folosind 4-8 concentrații diferite de substrat (adică MpNPT). Tipul sălbatic și variantele S225A, 488A, W397A, F495A, F415A, S416A și R411Q au fost, de asemenea, măsurate la 30 °C. Acești parametri cinetici au fost normalizați în funcție de activitățile de tip sălbatic la 25 °C.

Pentru măsurarea activității feruloil și clorogenat esterazei au fost testate patru substraturi: esterul metilic al acidului cumaric (Coum-ME), esterul metilic al acidului cafeic (Caff-ME), acidul clorogenic (Chlorogen) și esterul metilic al acidului p-hidroxi-hidroxi benzoic (pHB-ME). S-au măsurat spectrele UV-Vis utilizând 10 μM de ester și de acid liber și s-a calculat Δε (Fig. suplimentară 10). Hidroliza a fost măsurată ca pentru MpNPT, dar cu 10-35 nM de enzimă, 100 µM de substrat și la 335 nm (Coum-ME, Δε = -6100 M-1 cm-1), 350 nm (Caff-ME, Δε = -5700 M-1 cm-1), 350 nm (Clorogen, Δε = -7400 M-1 cm-1) și 280 nm (pHB-ME, Δε = -3900 M-1 cm-1).

Fluorimetrie de scanare diferențială

Pentru analiza legării ligandului la MHETază, s-a folosit DSF. Experimentele au fost efectuate cu un Prometheus NT.48 (NanoTemper, München, Germania). Dispozitivul are o lungime de undă de excitație fixă de 285 nm și lungimi de undă de emisie de 330 și 350 nm. MHETase (wt) a fost întotdeauna utilizată la 100 µgmL-1 în soluția finală. Concentrațiile finale ale tamponului au fost de 100 mM TRIS pH 7,5, 150 mM NaCl cu sau fără 20% DMSO. S-au folosit capilare de înaltă sensibilitate furnizate de NanoTemper. Intervalul de temperatură de la 20 la ≥80 °C a fost scanat la 0,5 K pe minut. Liganzii au fost preparați în soluții stoc de 21,7 mM și au fost diluați la o concentrație finală de 10 mM. Soluția saturată (cu 0 sau 42,5 % DMSO) a fost utilizată ca stoc, în cazul în care compușii nu s-au dizolvat complet. Pentru compușii care împiedică măsurătorile fiabile prin absorbție (4-nitrofenol, 4-nitrotiofenol, acid 2-hidroxibenzoic) sau fluorescență (BHET) s-au testat, de asemenea, concentrații finale de 1 mM. Valorile Tm sunt raportate așa cum sunt furnizate de software-ul Prometheus (valoarea maximă a pantei pentru raportul I330 nm/I350 nm). Experimentul a fost efectuat ca o singură măsurătoare.

Alinierea secvențelor și arborele filogenetic

Cercetarea homologiei proteice pentru proteinele asemănătoare MHETazei a fost efectuată cu instrumentul de căutare a alinierii locale de bază (BLAST) al NCBI în baza de date ESTHER (http://bioweb.ensam.inra.fr/ESTHER/general?what=blast) folosind baza de date Block_X.pep22,39. Alinierea secvențelor multiple a fost realizată prin aliniere musculară cu ajutorul MEGA740. Istoria evolutivă a fost dedusă prin utilizarea metodei de maximă verosimilitate pe baza modelului bazat pe matricea JTT41. Este prezentat arborele cu cea mai mare verosimilitate logaritmică (-19,562.87). Arborele (arborii) inițial(i) pentru căutarea euristică a fost (au fost) obținut(e) automat prin aplicarea algoritmilor Neighbor-Join și BioNJ la o matrice de distanțe pe perechi estimată cu ajutorul unui model JTT, apoi prin selectarea topologiei cu o valoare superioară a verosimilității logaritmice. Analiza a implicat 32 de secvențe de aminoacizi. Toate pozițiile care conțineau lacune și date lipsă au fost eliminate. A existat un total de 376 de poziții în setul de date final. Analizele evolutive au fost efectuate în MEGA740.

.