Reagentes
PET foi obtida a partir de garrafas comerciais. Todos os outros produtos químicos foram adquiridos com a mais alta pureza da Sigma-Aldrich, Carl Roth, Alfa Aesar ou Acros, se não declarado de outra forma.
Síntese de ligantes e substratos
Identidade e pureza de todos os compostos sintetizados foi verificada pela RMN. Os espectros de 1H foram medidos em DMSO-d6 em uma Bruker Avance II 300 equipada com um PABBO BB-1H/D Z-GRD Z104275/0398 com cabeça de sonda de 5 mm a 25-28 °C (Fig. S7a-f). Para a calibração das medidas foi utilizado tetrametilsilano.
Bis-hidroxietil tereftalato (BHET): O BHET foi sintetizado a partir de uma garrafa PET por etilenoglicol por etilenoglicol. Vinte gramas de PET e 0,2 g de acetato de sódio anidro foram refluxados em 120 mL de etilenoglicol por 8 h e depois resfriados durante a noite. Foram adicionados 120 mL de H2O e a filtração foi realizada a 4 °C. O produto foi lavado com 20 mL de H2O frio e extraído várias vezes com H2O quente. O BHET apareceu como agulhas brancas (18 g (68%), Mp 210-212 °C).
Amida de ácido bi-hidroxietil tereftálico (BHETA): O BHETA foi sintetizado a partir do PET por aminólise com etanol 2-amino. Vinte gramas de PET e 0,2 g de acetato de sódio anidro foram refluxados em 120 mL de etanolamina por 8 h e depois resfriados durante a noite. Foram adicionados 120 mL de H2O e a filtração foi realizada a 4 °C. O produto foi lavado com 20 mL de H2O frio e recristalizado duas vezes com 100 mL de H2O quente. BHETA apareceu como agulhas levemente rosadas (20 g (76%), Mp 240-243 °C).
Dimetil tereftalato (DMT): O DMT foi sintetizado pela esterificação do cloreto de tereftaloilo com metanol. O cloreto de tereftaloil de 25 mmol foi reagido com 30 mL de metanol no RT e depois refluxado durante 3 h. Após destilar o metanol e secar a 60 °C, foi obtido 4,08 g (Mp 144-148 °C). A lavagem com 0,5 M KOH e água não alterou o ponto de fusão.
Monohydroxyethyl terephthalate (MHET): O MHET foi sintetizado a partir do BHET por hidrólise parcial com KOH. O BHET de 8,7 mmol foi reagido com 8,4 mmol KOH em 18 mL MgSO4-glicol seco a 110-130 °C durante 2,5 h. Trinta mililitros de H2O foram adicionados e a mistura foi extraída três vezes com 5 mL CHCl3. A fase aquosa foi ajustada a pH 3 com 25% de HCl e filtrada a 4 °C. Após duas etapas de extração com 30 mL de H2O quente e filtração a 4 °C, o precipitado foi seco a 60 °C (0,56 g (30%), Mp 185-190 °C).
Amida de ácido monohidroxietil tereftálico (MHETA): O MHETA foi sintetizado pela amidação parcial do cloreto de tereftaloil com etanolamina. 150 mmol de NaOH e 50 mmol de etanolamina em 50 mL de H2O foram adicionados em gotas de 1 h a 50 mmol de cloreto de tereftaloila em 50 mL de H2O a 0 °C. A reação foi realizada por mais 2 h a 0 °C e 2 h sob refluxo, seguida de filtração a quente. O pH foi ajustado para 3 com 25% HCl. A suspensão obtida foi filtrada a frio e o filtrado foi lavado com 20 mL de água fria. O produto foi recristalizado de 100 mL de H2O quente para produzir cristais brilhantes (2,4 g (23%), Mp 209-212 °C).
Mono-4-nitrofenil tereftalato (MpNPT): O MpNPT foi sintetizado pela esterificação do cloreto de tereftaloil com 4-nitrofenolato. O cloreto de tereftaloil de 50 mmol e o 4-nitrofenolato de sódio de 50 mmol foram suspensos em 50 mL de éter dietílico e reagiram durante 2 h a 0 °C, depois em RT durante a noite. 2,5 g de Na2CO3 e 4,5 g de NaHCO3 em 50 mL de H2O foram adicionados e reagiram ao RT durante 10 h. O pH foi ajustado para 8,5 com NaOH. A fração insolúvel foi extraída com um total de 2,5 g de Na2CO3 e 2,5 g de NaHCO3 em 100 mL de H2O e depois lavada até um pH neutro. O MpNPT foi precipitado com HCl a pH 3 e lavado duas vezes com 50 mL 0,1 M HCl e, em seguida, até um pH neutro. O MpNPT foi separado do tereftalato de bis-4-nitrofenilo contaminante por extração com NaPi 100 mM pH 7,4 e precipitação ácida. A polpa amarela muito fraca foi seca a 60 °C (Mp 202 °C).
Purificação assim como solução de cristalização e estrutura
I. sakaiensis PETase (resíduos de aminoácidos 28-290) foi encomendada da Genscript (Piscataway, EUA) como um gene sintético otimizado para códon contendo um C-terminal His6-tag subclonado em pET-21b. Um fragmento de DNA otimizado para códon que codifica I. sakaiensis MHETase (resíduos de aminoácidos 20-603) clonado em um vetor pUC19 foi pedido ao Genscript e posteriormente subclonado em um plasmídeo de expressão pColdII com um N-terminal His6-tag (TAKARA BIO, Inc., EUA) como um gene sintético otimizado para códon, contendo um gene C-terminal His6-tag subclonado no pET-21b, Otsu, Shiga, Japão) por FastCloning (Figura Complementar 11)30.
Para expressão de proteínas, células expressas E. coli Shuffle T7 (New England Biolabs, Frankfurt, Alemanha) foram transformadas com os plasmídeos e selecionadas em placas de ágar-lisogênico (LB) contendo 100 µgmL-1 ampicilina. Após o crescimento a 30 °C, foram inoculadas culturas de um dia para o outro. Para a sobreexpressão, foram utilizados frascos de Erlenmeyer de 1 L com 200 mL de meio LB suplementados com 100 µg de ampicilina mL-1. As células foram cultivadas a 33 °C e 160 rpm de velocidade de agitação para uma densidade óptica a 600 nm (OD600) de 1 antes de 1 mM isopropil β-d-1-iogalactopiranósido (IPTG) foi adicionado. A uma OD600 de 2,5, a temperatura foi baixada para 16 °C e a sobreexpressão continuou durante a noite. As células foram colhidas por centrifugação a 4 °C, 10.000 × g durante 20 min e armazenadas a -20 °C até a utilização posterior.
Células foram perturbadas por sonicação em 50 mM TRIS-HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl, 10 mM imidazol e 1 mM Dithiothreitol (TDT) (tampão R). Os detritos celulares foram removidos por centrifugação. O extrato celular foi carregado em uma coluna de fluxo gravitacional com separose Ni-NTA, lavado com tampão R suplementado com 20 mM imidazol e eluído com tampão R suplementado com 200 mM imidazol (300 mM imidazol no caso da PETase). As frações proteicas foram purificadas em uma coluna Superdex75 10/300 (GE Healthcare, Solingen, Alemanha) com 20 mM TRIS pH 7,5, 150 mM NaCl, concentrado a ~10 mg mL-1, congelado no líquido N2 e armazenado a -80 °C. As concentrações de proteínas foram determinadas espectrofotometricamente usando ε280 = 102 955 M-1 cm-1 (ε280 = 97.455 M-1 cm-1 para o mutante W397A). A pureza das amostras foi estimada usando o software GelAnalyzer (Versão 2010a).
PETase foi cristalizada a 10 mg mL-1 de concentração por difusão de vapor de gota sentada (1 µL de proteína mais 1 µL de reservatório) a 20 °C. Os cristais típicos da PETase cresceram a 20 °C com uma solução de reservatório contendo citrato de sódio 0,1 M ou acetato de sódio pH 5,0, 15% (v/v) PEG8000 e 0,5 M de sulfato de lítio. MHETase cristalizada a uma concentração de 10 mg mL-1 por difusão de vapor de gota sentada (1 µL de proteína mais 1 µL de reservatório) a 20 °C com um reservatório contendo 0,1 M HEPES, pH 7,5, 30% (v/v) 2,4-MPD e 0,12 M de sulfato de amônio (grupo espacial P212121) ou 0,1 M MES, pH 6,5, 10% (v/v) PEG8000 e 0,1 M de acetato de zinco (grupo espacial P1). Os cristais de MHETase cultivados com MPD foram resfriados crio-refecidos na solução do seu reservatório. O cristal PETase foi crio-protegido com acetato de sódio 0,1 M, pH 5,0, 10% (v/v) PEG8000, 15% (v/v) PEG400 e 0,5 M de sulfato de lítio. O cristal P1 MHETase foi crio-protegido com TRIS 0,1 M, pH 8,5, 5% (v/v) PEG8000, 20% (v/v) PEG400 e 0,5 M de sulfato de lítio. Para experimentos de derivatização, os cristais foram incubados durante 24 h na respectiva solução crioprotetora saturada com o ligante e congelados em nitrogênio líquido. Os dados de difração de MHETase foram coletados a 100 K nas linhas de feixe 14,1 e 14,2 do anel de armazenamento BESSY II, Berlim, Alemanha31. Os dados de difração de PETase foram coletados na linha de feixe P13, PETRAIII, Hamburgo32. Todos os dados de difração foram processados com XDS33,34.
A estrutura do PETase foi resolvida pela substituição molecular empregando as coordenadas estruturais de T. fusca cutinase TfCut2 (entrada PDB 4CG111,23). A estrutura do MHETase complexado ao MHETA foi resolvida pela substituição molecular empregando o MoRDa35, que colocou seis cópias de um modelo homológico baseado na entrada 6G21 do PDB (um A. oryzae feruloyl esterase, AoFaeB-2; 26% de identidade para MHETase com uma cobertura de consulta de 87%). As estruturas foram complementadas durante várias rodadas de refinamento com PHENIX.REFINE ou Refmac no caso do PETase35,36 intermitente pelo modelo de construção manual com COOT que foi extensivo para MHETase37. A estrutura de MHETase complexada para BA foi resolvida através da substituição molecular empregando toda a unidade assimétrica da co-estrutura MHETA como modelo de busca e completada, respectivamente. Os ligandos MHETA e BA foram colocados nas respectivas densidades sem ambiguidade nos estágios finais de refinamento. A estrutura do ligante P1 livre de MHETase foi resolvida através da substituição molecular empregando coordenadas estruturais de uma co-estrutura MHETase-MHETA finalizada, omitindo o ligante. As dez cópias de MHETase na unidade assimétrica foram construídas manualmente ou por PHENIX.AUTOBUILD e refinadas com PHENIX.REFINE36.
Geração de mutantes MHETase por mutagênese direcionada ao local
Para a criação de mutantes de local único, foi utilizado o kit de mutagênese direcionada ao local Q5 (New England Biolabs) ou o método QuikChange®. No primeiro caso, o kit foi utilizado de acordo com as instruções do fabricante. No caso do método QuikChange®, foi utilizada uma mistura padrão de PCR (25 µL) que consiste em 2,5 µL de tampão 10× Pfu (Roboklon GmbH, Berlim, Alemanha), 0,5 µL de deoxinucleosídeos trifosfatos mistos (0,25 mM cada), DNA plasmídeo (~40 ng), 1,25 µL de iniciadores para a frente e para trás (10 µM; Tabela suplementar 4), 1 µL de PfuPlus! polimerase (Roboklon GmbH) e 18,1 µL de água ultra pura. Para a desnaturação, a temperatura foi mantida a 95 °C durante 30 s. Após 20 ciclos de desnaturação de 30 s a 95 °C, recozimento durante 30 s a 63 °C e elongação durante 6 min a 72 °C. Numa última etapa, o alongamento final foi realizado a 72 °C durante 10 min. Após a PCR, o ADN modelo foi digerido com DpnI (New England BioLabs) durante 2 h a 37 °C antes da enzima ser inactivada a 80 °C durante 10 min. As células de E. coli TOP10 foram transformadas com os produtos obtidos da PCR e banhadas em placas de ágar LB contendo 100 µg de ampicilina mL-1 e cultivadas de um dia para o outro a 37 °C. A sequência nucleotídica foi confirmada por sequenciamento em Eurofins (Ebersberg, Alemanha).
Autohidrólise de MpNPT
Hidrólise foi seguida espectrofotometricamente a 400 nm a 30 °C. A valores de pH mais elevados, onde a hidrólise está quase terminada, foi realizada uma decadência exponencial. A valores de pH mais baixos, as constantes de decaimento foram calculadas a partir das taxas iniciais, levando em conta a pureza e a desprotonação parcial do 4-nitrofenol (o valor esperado a pH 7,5 é 12.420 M-1 cm-1 calculado com ε405 nm = 18.000 M-1 cm-1 e pKa = 7,15 para o 4-nitrofenol)38. A diferença de absorção de 4-nitrofenol a 400 e 405 nm foi inferior a 0,5%. A auto-hidrólise foi medida de pH 7,5 a 12,5 em tampão fosfato ou borato 100 mM e soluções de NaOH com uma constante de taxa de k2 = 9,2 M-1 s-1 para d/dT = k2 , ou seja, k1 = 2,9 × 10-6 s-1 (Figura Suplementar 12). Em 100 mM TRIS pH 7,5, também utilizado para cinética enzimática, foi determinado k1 = 46 × 10-6 s-1 para d/dT = k1. Assim, o TRIS aumenta a taxa de hidrólise ~10 vezes a taxa de reação esperada com hidróxido a pH 7,5,
Testes de atividade
Atividade foi medida para os substratos MHET e BHET por HPLC e para MpNPT por espectrofotometria. Para a medição por HPLC, as reações (100 µL) foram interrompidas pela adição de um volume igual a 160 mM de NaPi (tampão fosfato de sódio) pH 2,5 com 20% (v/v) de dimetil sulfóxido (DMSO) e aquecimento a 80 °C durante 10 min. TPA, MHET e BHET foram separados em um Kinetex 5 µm EVO C18 100 Å, 150 × 4,6 mm (Phenomenex, Aschaffenburg, Alemanha) com um gradiente de acetonitrilo e 0,1% (v/v) de ácido fórmico em água a 30 °C após injeção de 10 µL de amostra. O acetonitrilo foi aumentado de 5 a 44% até ao minuto 12 e depois para 70% ao minuto 15 onde a razão permaneceu constante durante 3 min. TPA, MHET e BHET foram detectados a 240 nm e a quantificação foi realizada pelo uso de curvas de calibração.
Para quantificar as taxas de turnover de MHET e BHET, as reações (100 µL) com 1 mM do substrato em 40 mM NaPi pH 7,5 com 80 mM NaCl e 20% (v/v) DMSO foram incubadas a 30 °C antes de serem paradas e analisadas como descrito acima. O MHETase foi utilizado a 6 nM durante 30 min no caso do MHET. Para o BHET, uma pré-criagem com 6 nM ou 12 nM variantes de MHETase foi utilizada para identificar enzimas potencialmente ativas que foram posteriormente analisadas em concentrações mais elevadas. Cerca de 100 nM das variantes foram usadas para 19,25 h e 3 nM MHETase tipo selvagem foi adicionada a estas reações para a conversão total do MHET formado em TPA que foi quantificada via HPLC. O experimento foi repetido três vezes.
MpNPT foram preparadas soluções de estoque em DMSO em concentrações de 10, 1 e 0,1 mM. As concentrações do substrato foram de 0,1-1200 µM em 100 mM TRIS pH 7,5 ou 100 mM NaPi pH 7,5. Os parâmetros cinéticos são os mesmos em ambos os tampões. A reação na cubeta de 400 µL foi iniciada a 25 °C pela adição da enzima a uma concentração final de ca. 1 nM (variantes ativas) até 500 nM (variantes inativas). A mudança de absorção foi seguida num espectrofotómetro Cary50 (Varian) a 400 nm. As alterações de absorção foram corrigidas para hidrólise não enzimática (ver parágrafo anterior). Foram usadas taxas iniciais (em média dez combinações diferentes de concentrações de enzimas e substratos para cada variante) para ajuste Km e vmax de acordo com a Cinética Quaresmal de Michaelis. KI para inibidores competitivos foram medidos a 30 °C e são calculados com Eq. (1)
utilizando 4-8 diferentes concentrações de substrato (i.e. MpNPT). O tipo selvagem e variantes S225A, 488A, W397A, F495A, F415A, S416A e R411Q também foram medidos a 30 °C. Esses parâmetros cinéticos foram normalizados em atividades do tipo selvagem a 25 °C.
Para a medição da atividade de feruloyl e esterase clorogênica foram testados quatro substratos: éster metílico do ácido cumárico (Coum-ME), éster metílico do ácido cafeico (Caff-ME), ácido clorogênico (Chlorogen) e éster metílico do ácido p-hidroxi-hidroxi benzóico (pHB-ME). Os espectros UV-Vis usando 10 μM do éster e do ácido livre foram medidos e Δε calculados (Suplemento Fig. 10). A hidrólise foi medida como para MpNPT, mas com enzima 10-35 nM, substrato 100 µM e a 335 nm (Coum-ME, Δε = -6100 M-1 cm-1), 350 nm (Caff-ME, Δε = -5700 M-1 cm-1), 350 nm (Chlorogen, Δε = -7400 M-1 cm-1) e 280 nm (pHB-ME, Δε = -3900 M-1 cm-1).
Diferencial fluorimetria de varredura
Para a análise da ligação ligante a MHETase, foi utilizado DSF. Foram realizadas experiências com uma NT.48 Prometheus (NanoTemper, Munique, Alemanha). O dispositivo tem um comprimento de onda de excitação fixo de 285 nm e comprimentos de onda de emissão de 330 e 350 nm. MHETase (wt) foi sempre usado a 100 µgmL-1 na solução final. As concentrações finais de tampão foram 100 mM TRIS pH 7,5, 150 mM NaCl com ou sem DMSO a 20%. Foram utilizados capilares de alta sensibilidade, conforme fornecidos pela NanoTemper. A faixa de temperatura de 20 a ≥80 °C foi escaneada a 0,5 K por minuto. Os ligandos foram preparados em soluções de 21,7 mM e diluídos a 10 mM de concentração final. A solução saturada (com DMSO 0 ou 42,5%) foi utilizada como reserva, caso os compostos não se dissolvessem completamente. Para compostos que dificultassem medições confiáveis por absorção (4-nitrofenol, 4-nitrotiofenol, ácido 2-hidroxibenzóico) ou fluorescência (BHET) também foram testadas concentrações finais de 1 mM. Os valores Tm são relatados como fornecidos pelo software Prometheus (máximo da inclinação para a relação I330 nm/I350 nm). O experimento foi realizado como uma única medida.
Alinhamento de sequência e árvore filogenética
Proteínas homólogas de pesquisa de proteínas MHETase-como proteínas foram realizadas com a ferramenta básica de pesquisa de alinhamento local NCBI (BLAST) na base de dados ESTHER (http://bioweb.ensam.inra.fr/ESTHER/general?what=blast) usando a base de dados Block_X.pep22,39. O alinhamento de sequências múltiplas foi realizado pelo alinhamento muscular utilizando o MEGA740. A história evolutiva foi inferida usando o método da Máxima Verossimilhança baseada no modelo baseado na matriz JTT41. A árvore com a maior probabilidade de logaritmo (-19.562,87) é mostrada. A(s) árvore(s) inicial(is) para a busca heurística foram obtidas automaticamente através da aplicação dos algoritmos Neighbor-Join e BioNJ a uma matriz de distâncias em pares estimada usando um modelo JTT, e então selecionando a topologia com valor superior de verossimilhança logarítmica. A análise envolveu 32 sequências de aminoácidos. Todas as posições contendo lacunas e dados ausentes foram eliminadas. Houve um total de 376 posições no conjunto de dados final. As análises evolutivas foram realizadas em MEGA740.