Odczynniki

PET uzyskano z butelek komercyjnych. Wszystkie inne substancje chemiczne zostały zakupione w najwyższej czystości od Sigma-Aldrich, Carl Roth, Alfa Aesar lub Acros, jeśli nie podano inaczej.

Synteza ligandów i substratów

Tożsamość i czystość wszystkich zsyntetyzowanych związków została zweryfikowana przez NMR. Widma 1H zostały zmierzone w DMSO-d6 na aparacie Bruker Avance II 300 wyposażonym w głowicę 5 mm PABBO BB-1H/D Z-GRD Z104275/0398 w temperaturze 25-28 °C (Rys. S7a-f). Do kalibracji pomiarów użyto tetrametylosilanu.

Tereftalan bis-hydroksyetylu (BHET): BHET został zsyntetyzowany z butelki PET poprzez alkoholizę z glikolem etylenowym. Dwadzieścia gramów PET i 0.2 g bezwodnego octanu sodu refluksowano w 120 mL glikolu etylenowego przez 8 h, a następnie chłodzono przez noc. Dodano 120 mL H2O i przeprowadzono filtrację w temperaturze 4 °C. Produkt przemyto 20 mL zimnej H2O i kilkakrotnie ekstrahowano gorącą H2O. BHET pojawił się jako białe igły (18 g (68%), Mp 210-212 °C).

Amid kwasu bis-hydroksyetylotereftalowego (BHETA): BHETA był syntetyzowany z PET przez aminolizę z 2-aminoetanolem. Dwadzieścia gramów PET i 0.2 g bezwodnego octanu sodu refluksowano w 120 mL etanoloaminy przez 8 h, a następnie chłodzono przez noc. Dodano 120 mL H2O i przeprowadzono filtrację w temperaturze 4 °C. Produkt przemyto 20 mL zimnej H2O i dwukrotnie rekrystalizowano w 100 mL gorącej H2O. BHETA pojawił się jako lekko różowe igły (20 g (76%), Mp 240-243 °C).

Tereftalan dimetylu (DMT): DMT zsyntetyzowano przez estryfikację chlorku tereftaloilu metanolem. Chlorek tereftaloilu o masie 25 mmol reagował z 30 mL metanolu w temperaturze RT, a następnie skraplał się przez 3 h. Po oddestylowaniu metanolu i wysuszeniu w temperaturze 60 °C otrzymano 4,08 g (Mp 144-148 °C). Przemywanie 0,5 M KOH i wodą nie zmieniło temperatury topnienia.

Tereftalan monohydroksyetylu (MHET): MHET syntetyzowano z BHET przez częściową hydrolizę za pomocą KOH. 8,7 mmol BHET reagowano z 8,4 mmol KOH w 18 mL glikolu etylenowego wysuszonego MgSO4 w temp. 110-130°C przez 2,5 h. Dodano 30 mililitrów H2O i mieszaninę ekstrahowano trzykrotnie 5 mL CHCl3. Fazę wodną doprowadzono do pH 3 za pomocą 25% HCl i przefiltrowano w temperaturze 4 °C. Po dwóch etapach ekstrakcji 30 mL gorącej H2O i filtracji w 4 °C, osad wysuszono w 60 °C (0,56 g (30%), Mp 185-190 °C).

Amid kwasu monohydroksyetylotereftalowego (MHETA): MHETA zsyntetyzowano przez częściowe amidowanie chlorku tereftaloilu etanoloaminą. 150 mmol NaOH i 50 mmol etanoloaminy w 50 mL H2O dodawano kroplowo w ciągu 1 h do 50 mmol chlorku tereftaloilu w 50 mL H2O w temp. 0 °C. Reakcję prowadzono przez kolejne 2 h w temperaturze 0 °C i 2 h pod chłodnicą zwrotną, po czym przesączono na gorąco. Doprowadzono pH do 3 za pomocą 25% HCl. Otrzymaną zawiesinę przefiltrowano na zimno, a przesącz przemyto 20 mL zimnej wody. Produkt rekrystalizowano ze 100 mL gorącej H2O, otrzymując błyszczące kryształy (2.4 g (23%), Mp 209-212 °C).

Tereftalan mono-4-nitrofenylu (MpNPT): MpNPT zsyntetyzowano przez estryfikację chlorku tereftaloilu 4-nitrofenolanem. 50 mmol chlorku tereftaloilu i 50 mmol 4-nitrofenolanu sodu zawieszono w 50 mL eteru dietylowego i poddawano reakcji przez 2 h w temperaturze 0 °C, a następnie przez noc w temperaturze RT. Dodano 2,5 g Na2CO3 i 4,5 g NaHCO3 w 50 mL H2O i reagowano w RT przez 10 h. pH dostosowano do 8,5 za pomocą NaOH. Nierozpuszczalna frakcja była dalej ekstrahowana łącznie 2,5 g Na2CO3 i 2,5 g NaHCO3 w 100 mL H2O, a następnie przemywana do uzyskania neutralnego pH. MpNPT wytrącano za pomocą HCl o pH 3 i przemywano dwukrotnie 50 mL 0,1 M HCl, a następnie do uzyskania obojętnego pH. MpNPT został oddzielony od zanieczyszczającego tereftalanu bis-4-nitrofenylu przez ekstrakcję 100 mM NaPi o pH 7,4 i wytrącenie kwasem. Bardzo słabo żółtą zawiesinę suszono w temperaturze 60 °C (Mp 202 °C).

Puryfikacja, jak również krystalizacja i rozwiązanie struktury

I. sakaiensis PETase (reszty aminokwasowe 28-290) została zamówiona w Genscript (Piscataway, USA) jako zoptymalizowany kodonowo syntetyczny gen zawierający C-końcowy His6-tag subklonowany do pET-21b. Zoptymalizowany kodonowo fragment DNA kodujący MHETazę I. sakaiensis (reszty aminokwasowe 20-603) sklonowany w wektorze pUC19 został zamówiony w firmie Genscript, a następnie subklonowany do plazmidu ekspresyjnego pColdII z N-końcowym His6-tagiem (TAKARA BIO, Inc., Otsu, Shiga, Japonia) przez FastCloning (Supplementary Figure 11)30.

Do ekspresji białka, komórki ekspresyjne E. coli Shuffle T7 (New England Biolabs, Frankfurt, Niemcy) transformowano plazmidami i selekcjonowano na płytkach agarowych z bulionem lizogenicznym (LB) zawierającym 100 µgmL-1 ampicyliny. Po wzroście przez noc w temperaturze 30 °C, posiewano hodowle nocne. Do nadekspresji używano 1 L przegrodowych kolb Erlenmeyera zawierających 200 mL pożywki LB uzupełnionej 100 µg mL-1 ampicyliny. Komórki hodowano w temperaturze 33 °C i prędkości wytrząsania 160 rpm do osiągnięcia gęstości optycznej przy 600 nm (OD600) równej 1 przed dodaniem 1 mM izopropylo β-d-1-tiogalaktopiranozydu (IPTG). Przy OD600 równej 2,5 obniżono temperaturę do 16 °C i kontynuowano nadekspresję przez noc. Komórki zbierano przez odwirowanie w 4 °C, 10 000 × g przez 20 min i przechowywano w -20 °C do dalszego użycia.

Komórki rozbijano przez sonikację w 50 mM TRIS-HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl, 10 mM imidazolu i 1 mM Dithiothreitolu (DTT) (bufor R). Szczątki komórkowe oczyszczono przez odwirowanie. Ekstrakt komórkowy ładowano na kolumnę grawitacyjną z sefarozą Ni-NTA, przemywano buforem R uzupełnionym 20 mM imidazolu i eluowano buforem R uzupełnionym 200 mM imidazolu (300 mM imidazolu w przypadku PETazy). Frakcje białkowe były oczyszczane na kolumnie Superdex75 10/300 (GE Healthcare, Solingen, Niemcy) z 20 mM TRIS pH 7,5, 150 mM NaCl, zatężane do ~10 mg mL-1, zamrażane w ciekłym N2 i przechowywane w -80 °C. Stężenia białek oznaczano spektrofotometrycznie przy użyciu ε280 = 102 955 M-1 cm-1 (ε280 = 97,455 M-1 cm-1 dla mutanta W397A). Czystość próbek oceniano przy użyciu oprogramowania GelAnalyzer (wersja 2010a).

PETazę krystalizowano w stężeniu 10 mg mL-1 metodą dyfuzji par na siedząco (1 µL białka plus 1 µL rezerwuaru) w temperaturze 20 °C. Typowe kryształy PETazy rosły w temperaturze 20 °C z roztworem zbiornika zawierającym 0,1 M cytrynian sodu lub octan sodu pH 5,0, 15% (v/v) PEG8000 i 0,5 M siarczan litu. MHETaza krystalizowała w stężeniu 10 mg mL-1 metodą dyfuzji par na siedząco (1 µL białka plus 1 µL rezerwuaru) w temperaturze 20 °C z rezerwuarem zawierającym 0,1 M HEPES, pH 7,5, 30% (v/v) 2,4-MPD i 0,12 M siarczanu amonu (grupa przestrzenna P212121) lub 0,1 M MES, pH 6,5, 10% (v/v) PEG8000 i 0,1 M octanu cynku (grupa przestrzenna P1). Kryształy MHETazy wyhodowane z MPD były chłodzone kriokonserwatywnie w ich roztworze rezerwuarowym. Kryształy PETazy były krioochronione 0.1 M octanem sodu, pH 5.0, 10% (v/v) PEG8000, 15% (v/v) PEG400 i 0.5 M siarczanem litu. Kryształ MHETAZY P1 zabezpieczono kriogenicznie za pomocą 0,1 M TRIS, pH 8,5, 5% (v/v) PEG8000, 20% (v/v) PEG400 i 0,5 M siarczanu litu. Do eksperymentów derywatyzacji, kryształy inkubowano przez 24 h w odpowiednim roztworze krioochronnym nasyconym ligandem i zamrażano w ciekłym azocie. Dane dyfrakcyjne MHETazy zostały zebrane w temperaturze 100 K na liniach 14.1 i 14.2 pierścienia BESSY II, Berlin, Niemcy31. Dane dyfrakcyjne PETazy zostały zebrane na linii wiązki P13, PETRAIII, Hamburg32. Wszystkie dane dyfrakcyjne zostały przetworzone przy użyciu XDS33,34.

Struktura PETazy została rozwiązana metodą podstawienia molekularnego z wykorzystaniem współrzędnych strukturalnych kutynazy T. fusca TfCut2 (PDB entry 4CG111,23). Struktura MHETazy skompleksowanej z MHETA została rozwiązana przez podstawienie molekularne z wykorzystaniem potoku MR MoRDa35, który umieścił sześć kopii modelu homologicznego opartego na pozycji PDB 6G21 (niepublikowana esteraza feruloilowa A. oryzae, AoFaeB-2; 26% identyczności do MHETazy przy pokryciu zapytania 87%). Struktury były uzupełniane podczas kilku rund rafinacji przy użyciu PHENIX.REFINE lub Refmac w przypadku PETazy35,36 przerywanych ręcznym budowaniem modelu przy użyciu COOT, który był rozbudowany dla MHETazy37. Struktura MHETA skompleksowanej z BA została rozwiązana metodą wymiany molekularnej z wykorzystaniem całej jednostki asymetrycznej współstruktury MHETA jako modelu poszukiwań i odpowiednio uzupełniona. Ligandy MHETA i BA zostały jednoznacznie umieszczone w odpowiednich gęstościach na końcowych etapach rafinacji. Strukturę MHETAzy P1 bez liganda rozwiązano metodą podstawienia molekularnego, wykorzystując współrzędne strukturalne ukończonej współstruktury MHETA-MHETA z pominięciem liganda. Dziesięć kopii MHETazy w jednostce asymetrycznej zbudowano ręcznie lub za pomocą PHENIX.AUTOBUILD i rafinowano za pomocą PHENIX.REFINE36.

Generowanie mutantów MHETazy metodą mutagenezy kierowanej miejscem

Do tworzenia mutantów jednomiejscowych użyto zestawu do mutagenezy kierowanej miejscem Q5 (New England Biolabs) lub metody QuikChange®. W pierwszym przypadku zestaw został użyty zgodnie z instrukcjami producenta. W przypadku metody QuikChange® użyto standardowej mieszaniny PCR (25 µL) składającej się z 2,5 µL 10× buforu Pfu (Roboklon GmbH, Berlin, Niemcy), 0,5 µL mieszanych trifosforanów deoksynukleozydów (0,25 mM każdy), plazmidowego DNA (~40 ng), 1,25 µL primerów forward i reverse (10 µM; Tabela uzupełniająca 4), 1 µL polimerazy PfuPlus! (Roboklon GmbH) oraz 18,1 µL wody ultraczystej. W celu denaturacji temperaturę utrzymywano na poziomie 95 °C przez 30 s. Następnie przeprowadzano 20 cykli składających się z 30 s denaturacji w 95 °C, annealingu przez 30 s w 63 °C i elongacji przez 6 min w 72 °C. W ostatnim etapie końcową elongację prowadzono w 72 °C przez 10 min. Po PCR szablon DNA trawiono DpnI (New England BioLabs) przez 2 h w temp. 37 °C, a następnie inaktywowano enzym w temp. 80 °C przez 10 min. Komórki E. coli TOP10 transformowano otrzymanymi produktami PCR, posiewano na płytki agarowe LB zawierające 100 µg mL-1 ampicyliny i hodowano przez noc w temperaturze 37 °C. Sekwencja nukleotydów została potwierdzona przez sekwencjonowanie w Eurofins (Ebersberg, Niemcy).

Autohydroliza MpNPT

Hydrolizę śledzono spektrofotometrycznie przy 400 nm w temperaturze 30 °C. Przy wyższych wartościach pH, gdzie hydroliza zbliża się do końca, uzyskano rozkład wykładniczy. Przy niższych wartościach pH stałe zaniku obliczono z szybkości początkowych, biorąc pod uwagę czystość i częściową deprotonację 4-nitrofenolu (oczekiwana wartość przy pH 7,5 wynosi 12,420 M-1 cm-1, obliczona przy ε405 nm = 18,000 M-1 cm-1 i pKa = 7,15 dla 4-nitrofenolu)38. Różnica absorpcji 4-nitrofenolu przy 400 i 405 nm była mniejsza niż 0,5%. Autohydrolizę mierzono od pH 7,5 do 12,5 w 100 mM buforach fosforanowych lub boranowych i roztworach NaOH ze stałą szybkości k2 = 9,2 M-1 s-1 dla d/dT = k2 , tj. k1 = 2,9 × 10-6 s-1 (rysunek uzupełniający 12). W 100 mM TRIS pH 7,5, również używanym do kinetyki enzymów, oznaczono k1 = 46 × 10-6 s-1 dla d/dT = k1. TRIS zwiększa więc szybkość hydrolizy ~10-krotnie w porównaniu do oczekiwanej szybkości reakcji z wodorotlenkiem przy pH 7,5.

Badania aktywności

Aktywność mierzono dla substratów MHET i BHET metodą HPLC, a dla MpNPT metodą spektrofotometryczną. Dla pomiarów HPLC, reakcje (100 µL) zatrzymywano przez dodanie równej objętości 160 mM NaPi (bufor fosforanu sodu) pH 2,5 z 20% (v/v) dimetylosulfotlenkiem (DMSO) i ogrzewanie do 80 °C przez 10 min. TPA, MHET i BHET zostały rozdzielone na Kinetex 5 µm EVO C18 100 Å, 150 × 4,6 mm (Phenomenex, Aschaffenburg, Niemcy) gradientem acetonitrylu i 0,1% (v/v) kwasu mrówkowego w wodzie w temperaturze 30 °C po wstrzyknięciu 10 µl próbki. Zawartość acetonitrylu zwiększano z 5 do 44% do minuty 12, a następnie do 70% w minucie 15, gdzie stosunek ten pozostawał stały przez 3 minuty. TPA, MHET i BHET wykrywano przy 240 nm, a kwantyfikację przeprowadzano przy użyciu krzywych kalibracyjnych.

W celu ilościowego określenia szybkości obrotu MHET i BHET, reakcje (100 µL) z 1 mM substratu w 40 mM NaPi pH 7,5 z 80 mM NaCl i 20% (v/v) DMSO inkubowano w 30 °C, po czym zatrzymywano i analizowano jak opisano powyżej. W przypadku MHET stosowano MHETazę w stężeniu 6 nM przez 30 min. W przypadku BHET, wstępny screening z wariantami MHETazy o stężeniu 6 nM lub 12 nM został zastosowany w celu zidentyfikowania potencjalnie aktywnych enzymów, które następnie analizowano w wyższych stężeniach. Około 100 nM wariantów było używanych przez 19,25 h, a 3 nM dzikiej MHetazy było dodawane do tych reakcji w celu pełnej konwersji utworzonego MHET do TPA, który był oznaczany ilościowo przez HPLC. Eksperyment powtórzono trzykrotnie.

Roztwory podstawowe MpNPT przygotowano w DMSO w stężeniach 10, 1 i 0,1 mM. Stężenia substratów wynosiły 0,1-1200 µM w 100 mM TRIS pH 7,5 lub 100 mM NaPi pH 7,5. Parametry kinetyczne są takie same w obu buforach. Reakcję w kuwecie o pojemności 400 µL rozpoczynano w temperaturze 25 °C poprzez dodanie enzymu do końcowego stężenia ok. 1 nM (warianty aktywne) do 500 nM (warianty nieaktywne). Zmianę absorpcji śledzono na spektrofotometrze Cary50 (Varian) przy długości fali 400 nm. Zmiany absorpcji zostały skorygowane o hydrolizę nieenzymatyczną (patrz poprzedni akapit). Szybkości początkowe (średnio dziesięć różnych kombinacji stężeń enzymu i substratu dla każdego wariantu) zostały wykorzystane do dopasowania Km i vmax zgodnie z kinetyką Michaelisa Mentena. KI dla konkurencyjnych inhibitorów mierzono w temperaturze 30 °C i obliczono według wzoru (1)

używając 4-8 różnych stężeń substratu (tj. MpNPT). Typ dziki i warianty S225A, 488A, W397A, F495A, F415A, S416A i R411Q były również mierzone w temperaturze 30 °C. Te parametry kinetyczne zostały znormalizowane do aktywności typu dzikiego w 25 °C.

Do pomiaru aktywności esterazy feruloilowej i chlorogenowej testowano cztery substraty: ester metylowy kwasu kumarowego (Coum-ME), ester metylowy kwasu kofeinowego (Caff-ME), kwas chlorogenowy (Chlorogen) i ester metylowy kwasu p-hydroksy-hydroksy benzoesowego (pHB-ME). Zmierzono widma UV-Vis przy użyciu 10 μM estru i wolnego kwasu i obliczono Δε (Supplementary Fig. 10). Hydrolizę mierzono jak dla MpNPT, ale z 10-35 nM enzymu, 100 µM substratu i przy 335 nm (Coum-ME, Δε = -6100 M-1 cm-1), 350 nm (Caff-ME, Δε = -5700 M-1 cm-1), 350 nm (Chlorogen, Δε = -7400 M-1 cm-1) i 280 nm (pHB-ME, Δε = -3900 M-1 cm-1).

Różnicowa fluorymetria skaningowa

Do analizy wiązania ligandów do MHETazy wykorzystano DSF. Eksperymenty przeprowadzono przy użyciu aparatu Prometheus NT.48 (NanoTemper, Monachium, Niemcy). Urządzenie posiada stałą długość fali wzbudzenia 285 nm oraz długość fali emisji 330 i 350 nm. MHETaza (wt) była zawsze stosowana w stężeniu 100 µgmL-1 w roztworze końcowym. Końcowe stężenia buforów wynosiły 100 mM TRIS pH 7.5, 150 mM NaCl z lub bez 20% DMSO. Używano kapilar o wysokiej czułości dostarczonych przez firmę NanoTemper. Zakres temperatur od 20 do ≥80 °C był skanowany z prędkością 0.5 K na minutę. Ligandy przygotowywano w roztworach podstawowych o stężeniu 21,7 mM i rozcieńczano do końcowego stężenia 10 mM. Roztwór nasycony (z 0 lub 42,5% DMSO) był używany jako zapas, jeśli związki nie rozpuszczały się całkowicie. Dla związków utrudniających wiarygodne pomiary metodą absorpcji (4-nitrofenol, 4-nitrotiofenol, kwas 2-hydroksybenzoesowy) lub fluorescencji (BHET) badano również stężenia końcowe 1 mM. Wartości Tm są podawane zgodnie z oprogramowaniem Prometheus (maksimum nachylenia dla stosunku I330 nm/I350 nm). Eksperyment wykonano jako pojedynczy pomiar.

Przyrównanie sekwencji i drzewo filogenetyczne

Wyszukiwania homologii białek dla białek podobnych do MHETase wykonano za pomocą narzędzia NCBI do wyszukiwania podstawowego lokalnego wyrównania (BLAST) w bazie danych ESTHER (http://bioweb.ensam.inra.fr/ESTHER/general?what=blast) przy użyciu bazy danych Block_X.pep22,39. Wielokrotne wyrównanie sekwencji wykonano metodą Muscle alignment przy użyciu programu MEGA740. Historię ewolucyjną wnioskowano metodą największego prawdopodobieństwa (Maximum Likelihood) w oparciu o model oparty na macierzy JTT41. Pokazano drzewo o najwyższym logicznym prawdopodobieństwie (-19,562.87). Początkowe drzewo(a) dla poszukiwań heurystycznych uzyskano automatycznie poprzez zastosowanie algorytmów Neighbor-Join i BioNJ do macierzy odległości parami oszacowanych za pomocą modelu JTT, a następnie wybranie topologii o najwyższej wartości log likelihood. Analizie poddano 32 sekwencje aminokwasowe. Wszystkie pozycje zawierające luki i brakujące dane zostały wyeliminowane. Łącznie w ostatecznym zbiorze danych znalazło się 376 pozycji. Analizy ewolucyjne przeprowadzono w programie MEGA740.

.