Reagents

PET werd verkregen uit commerciële flessen. Alle andere chemicaliën werden gekocht op de hoogste zuiverheid van Sigma-Aldrich, Carl Roth, Alfa Aesar of Acros indien niet anders vermeld.

Synthese van liganden en substraten

Identiteit en zuiverheid van alle gesynthetiseerde verbindingen werd geverifieerd door NMR. 1H spectra werden gemeten in DMSO-d6 op een Bruker Avance II 300 uitgerust met een 5 mm PABBO BB-1H/D Z-GRD Z104275/0398 probehead bij 25-28 ° C (Fig. S7a-f). Voor de ijking van de metingen werd tetramethylsilaan gebruikt.

Bishydroxyethyltereftalaat (BHET): BHET werd gesynthetiseerd uit een PET-fles door alcoholyse met ethyleenglycol. Twintig gram PET en 0,2 gram watervrij natriumacetaat werden gedurende 8 uur in 120 mL ethyleenglycol gerefluxeerd en daarna ’s nachts afgekoeld. Er werd 120 ml H2O toegevoegd en er werd gefilterd bij 4 °C. Het product werd gewassen met 20 mL koud H2O en verschillende malen geëxtraheerd met warm H2O. BHET verscheen als witte naalden (18 g (68%), Mp 210-212 °C).

Bishydroxyethyltereftalaatzuuramide (BHETA): BHETA werd gesynthetiseerd uit PET door aminolyse met 2-amino-ethanol. Twintig gram PET en 0,2 g watervrij natriumacetaat werden gedurende 8 uur in 120 mL ethanolamine gerefluxeerd en daarna ’s nachts afgekoeld. Er werd 120 mL H2O toegevoegd en er werd gefiltreerd bij 4 °C. Het product werd gewassen met 20 mL koud H2O en tweemaal geherkristalliseerd met 100 mL warm H2O. BHETA verscheen als lichtroze naalden (20 g (76%), Mp 240-243 °C).

Dimethyltereftalaat (DMT): DMT werd gesynthetiseerd door verestering van terefthaloylchloride met methanol. 25 mmol terefthaloylchloride werd gereageerd met 30 mL methanol bij RT en vervolgens 3 uur gerefluxeerd. Na destillatie van de methanol en drogen bij 60 °C werd 4,08 g verkregen (Mp 144-148 °C). Wassen met 0,5 M KOH en water veranderde het smeltpunt niet.

Monohydroxyethyltereftalaat (MHET): MHET werd gesynthetiseerd uit BHET door gedeeltelijke hydrolyse met KOH. 8,7 mmol BHET werd gereageerd met 8,4 mmol KOH in 18 mL MgSO4-gedroogd ethyleenglycol bij 110-130 °C gedurende 2,5 uur. Dertig ml H2O werd toegevoegd en het mengsel werd driemaal geëxtraheerd met 5 mL CHCl3. De waterige fase werd op pH 3 gebracht met 25% HCl en gefiltreerd bij 4 °C. Na twee extractiestappen met 30 mL heet H2O en filtratie bij 4 °C werd het neerslag gedroogd bij 60 °C (0,56 g (30%), Mp 185-190 °C).

Monohydroxyethyltereftalaatzuuramide (MHETA): MHETA werd gesynthetiseerd door gedeeltelijke amidatie van terefthaloylchloride met ethanolamine. 150 mmol NaOH en 50 mmol ethanolamine in 50 mL H 2 O werden druppelsgewijs toegevoegd binnen 1 uur aan 50 mmol terefthaloylchloride in 50 mL H 2 O bij 0 ° C. De reactie werd uitgevoerd gedurende nog eens 2 uur bij 0 °C en 2 uur onder reflux, gevolgd door hete filtratie. De pH werd op 3 gebracht met 25% HCl. De verkregen suspensie werd koud gefilterd en het filtraat werd gewassen met 20 mL koud water. Het product werd geherkristalliseerd uit 100 mL heet H2O om glanzende kristallen te verkrijgen (2,4 g (23%), Mp 209-212 °C).

Mono-4-nitrophenyl terephthalate (MpNPT): MpNPT werd gesynthetiseerd door verestering van terefthaloylchloride met 4-nitrofenolaat. 50 mmol terefthaloylchloride en 50 mmol natrium-4-nitrofenolaat werden gesuspendeerd in 50 ml diethylether en reageerden gedurende 2 uur bij 0 °C en vervolgens overnacht bij RT. 2,5 g Na2CO3 en 4,5 g NaHCO3 in 50 mL H2O werden toegevoegd en reageerden bij kamertemperatuur gedurende 10 h. De pH werd met NaOH op 8,5 gebracht. De onoplosbare fractie werd verder geëxtraheerd met in totaal 2,5 g Na2CO3 en 2,5 g NaHCO3 in 100 mL H 2 O en vervolgens gewassen tot een neutrale pH. MpNPT werd neergeslagen met HCl bij pH 3 en tweemaal gewassen met 50 mL 0,1 M HCl en vervolgens tot een neutrale pH. MpNPT werd gescheiden van verontreinigend bis-4-nitrofenyltereftalaat door extractie met 100 mM NaPi pH 7,4 en zure precipitatie. De zeer vage gele slurry werd gedroogd bij 60 °C (Mp 202 °C).

Zowel de zuivering als de kristallisatie en structuuroplossing

I. sakaiensis PETase (aminozuurresiduen 28-290) werd besteld bij Genscript (Piscataway, VS) als een codon-geoptimaliseerd synthetisch gen dat een C-terminaal His6-tag bevat, gesubkloneerd in pET-21b. Een codon-geoptimaliseerd DNA-fragment coderend I. sakaiensis MHETase (aminozuur residuen 20-603) gekloond in een pUC19 vector werd besteld bij Genscript en later gesubkloneerd in een pColdII expressie plasmide met een N-terminale His6-tag (TAKARA BIO, Inc, Otsu, Shiga, Japan) door FastCloning (Supplementary Figuur 11)30.

Voor eiwitexpressie werden E. coli Shuffle T7 express cellen (New England Biolabs, Frankfurt, Duitsland) getransformeerd met de plasmiden en geselecteerd op lysogeny bouillon (LB) agar platen met 100 µgmL-1 ampicilline. Na een nacht bij 30 °C te hebben gegroeid, werden nachtculturen geënt. Voor overexpressie werden 1 L gebaffelde Erlenmeyer-flessen met 200 ml LB-medium, aangevuld met 100 µg mL-1 ampicilline, gebruikt. De cellen werden gekweekt bij 33 °C en 160 omwentelingen per minuut schudsnelheid tot een optische dichtheid bij 600 nm (OD600) van 1 voordat 1 mM isopropyl β-d-1-thiogalactopyranoside (IPTG) werd toegevoegd. Bij een OD600 van 2,5 werd de temperatuur verlaagd tot 16 °C en werd de overexpressie ’s nachts voortgezet. De cellen werden geoogst door centrifugatie bij 4 °C, 10.000 × g gedurende 20 min en bij -20 °C bewaard tot verder gebruik.

Cellen werden door sonicatie ontregeld in 50 mM TRIS-HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl, 10 mM imidazol en 1 mM Dithiothreitol (DTT) (buffer R). Celdébris werd verwijderd door centrifugatie. Het celextract werd geladen op een zwaartekrachtstroomkolom met Ni-NTA sepharose, gewassen met buffer R aangevuld met 20 mM imidazool en geëlueerd met buffer R aangevuld met 200 mM imidazool (300 mM imidazool in het geval van PETase). Eiwitfracties werden gezuiverd op een Superdex75 10/300-kolom (GE Healthcare, Solingen, Duitsland) met 20 mM TRIS pH 7,5, 150 mM NaCl, geconcentreerd tot ~ 10 mg ml-1, flash-bevroren in vloeibare N 2 en opgeslagen bij -80 ° C. Eiwitconcentraties werden spectrofotometrisch bepaald met ε280 = 102.955 M-1 cm-1 (ε280 = 97.455 M-1 cm-1 voor mutant W397A). De zuiverheid van de monsters werd geschat met behulp van de GelAnalyzer-software (versie 2010a).

PETase werd gekristalliseerd bij een concentratie van 10 mg ml-1 door zittend druppeldampdiffusie (1 µL eiwit plus 1 µL reservoir) bij 20 °C. Typische PETase-kristallen groeiden bij 20 °C met een reservoiroplossing die 0,1 M natriumcitraat of natriumacetaat pH 5,0, 15% (v/v) PEG8000 en 0,5 M lithiumsulfaat bevatte. MHETase gekristalliseerd bij een concentratie van 10 mg mL-1 door zittende druppel damp diffusie (1 µL eiwit plus 1 µL reservoir) bij 20 ° C met een reservoir dat 0,1 M HEPES, pH 7,5, 30% (v / v) 2,4-MPD en 0,12 M ammoniumsulfaat (ruimte groep P212121) of 0,1 M MES, pH 6,5, 10% (v / v) PEG8000 en 0,1 M zink-acetaat (ruimte groep P1). Met MPD gekweekte MHETase-kristallen werden in hun reservoiroplossing gekryokoeld. Het PETase-kristal werd cryo-beschermd met 0,1 M natriumacetaat, pH 5,0, 10% (v/v) PEG8000, 15% (v/v) PEG400 en 0,5 M lithiumsulfaat. Het P1 MHETase-kristal werd cryo-beschermd met 0,1 M TRIS, pH 8,5, 5% (v/v) PEG8000, 20% (v/v) PEG400 en 0,5 M lithiumsulfaat. Voor derivatisering experimenten, werden kristallen geïncubeerd gedurende 24 uur in de respectieve cryo-beschermende oplossing verzadigd met het ligand en flash-bevroren in vloeibare stikstof. MHETase-diffractiegegevens werden verzameld bij 100 K bij bundellijnen 14.1 en 14.2 van de BESSY II-opslagring, Berlijn, Duitsland31. De PETase-diffractiegegevens zijn verzameld bij bundellijn P13, PETRAIII, Hamburg32. Alle diffractiegegevens werden verwerkt met XDS33,34.

De structuur van PETase werd opgelost door moleculaire vervanging met gebruikmaking van de structuurcoördinaten van T. fusca cutinase TfCut2 (PDB entry 4CG111,23). De structuur van MHETase gecomplexeerd met MHETA werd opgelost door moleculaire vervanging met behulp van de MR pijplijn MoRDa35, die zes kopieën van een homologie model op basis van PDB item 6G21 (een ongepubliceerde A. oryzae feruloyl esterase, AoFaeB-2; 26% identiteit naar MHETase met een query dekking van 87%) geplaatst. Structuren werden aangevuld tijdens verschillende rondes van verfijning met PHENIX.REFINE of Refmac in het geval van PETase35,36 onderbroken door handmatige modelbouw met COOT die uitgebreid voor MHETase37. De structuur van MHETase gecomplexeerd met BA werd opgelost door moleculaire vervanging met behulp van de gehele asymmetrische eenheid van de MHETA co-structuur als een zoekmodel en respectievelijk voltooid. De MHETA- en BA-liganden werden in de laatste stadia van de verfijning ondubbelzinnig in de respectieve dichtheden geplaatst. De structuur van de P1 ligand-vrije MHETase werd opgelost door moleculaire vervanging met behulp van structuurcoördinaten van een afgeronde MHETase-MHETA co-structuur waarin het ligand was weggelaten. De tien kopieën van MHETase in de asymmetrische eenheid werden handmatig of met PHENIX.AUTOBUILD opgebouwd en met PHENIX.REFINE36.

Generatie van MHETase-mutanten door gerichte mutagenese

Voor het creëren van mutanten op één plaats werd ofwel de Q5 gerichte mutagenese-kit (New England Biolabs) of de QuikChange®-methode gebruikt. In het eerste geval is de kit gebruikt volgens de instructies van de fabrikant. Bij de QuikChange®-methode werd een standaard PCR-mengsel (25 µL) gebruikt, bestaande uit 2,5 µL 10× Pfu-buffer (Roboklon GmbH, Berlijn, Duitsland), 0,5 µL gemengde deoxynucleosidetrifosfaten (0,25 mM elk), plasmide-DNA (~40 ng), 1,25 µL voorwaartse en achterwaartse primers (10 µM; aanvullende tabel 4), 1 µL PfuPlus! polymerase (Roboklon GmbH) en 18,1 µL ultrapuur water. Voor de denaturatie werd de temperatuur gedurende 30 s op 95 °C gehouden. Daarna werden 20 cycli van 30 s denaturatie bij 95 °C, 30 s annealing bij 63 °C en 6 min elongatie bij 72 °C uitgevoerd. In een laatste stap vond de laatste elongatie plaats bij 72 °C gedurende 10 minuten. Na de PCR werd het template-DNA gedurende 2 uur bij 37 °C gedigesteerd met DpnI (New England BioLabs) voordat het enzym gedurende 10 minuten bij 80 °C werd geïnactiveerd. E. coli TOP10 cellen werden getransformeerd met de verkregen PCR producten en uitgezet op LB agar platen met 100 µg mL-1 ampicilline en overnacht gekweekt bij 37 °C. De nucleotidevolgorde werd bevestigd door sequencing bij Eurofins (Ebersberg, Duitsland).

Autohydrolyse van MpNPT

Hydrolyse werd spectrofotometrisch gevolgd bij 400 nm bij 30 °C. Bij hogere pH-waarden, waar de hydrolyse bijna voltooid is, werd een exponentieel verval gepast. Bij lagere pH-waarden werden vervalconstanten berekend uit de beginsnelheden, rekening houdend met de zuiverheid en de partiële deprotonatie van 4-nitrofenol (de verwachte waarde bij pH 7,5 is 12.420 M-1 cm-1 berekend met ε405 nm = 18.000 M-1 cm-1 en pKa = 7,15 voor 4-nitrofenol)38. Het verschil in absorptie van 4-nitrofenol bij 400 en 405 nm was minder dan 0,5%. Autohydrolyse werd gemeten van pH 7,5 tot 12,5 in 100 mM fosfaat- of boraatbuffers en NaOH-oplossingen met een snelheidsconstante van k2 = 9,2 M-1 s-1 voor d/dT = k2 , d.w.z. k1 = 2,9 × 10-6 s-1 (supplementaire figuur 12). In 100 mM TRIS pH 7,5, ook gebruikt voor de kinetiek van het enzym, werd k1 = 46 × 10-6 s-1 voor d/dT = k1 bepaald. TRIS verhoogt dus de hydrolyse-snelheid ~10-voudig ten opzichte van de verwachte reactiesnelheid met hydroxide bij pH 7,5.

Activiteitstests

De activiteit werd gemeten voor de substraten MHET en BHET met HPLC en voor MpNPT met spectrofotometrie. Voor de HPLC-meting werden de reacties (100 µL) gestopt door toevoeging van een gelijk volume 160 mM NaPi (natriumfosfaatbuffer) pH 2,5 met 20% (v/v) dimethylsulfoxide (DMSO) en verhitting tot 80 °C gedurende 10 min. TPA, MHET en BHET werden gescheiden op een Kinetex 5 µm EVO C18 100 Å, 150 × 4,6 mm (Phenomenex, Aschaffenburg, Duitsland) met een gradiënt van acetonitril en 0,1% (v/v) mierenzuur in water bij 30 °C na injectie van 10 µL monster. Acetonitril werd opgevoerd van 5 tot 44% tot minuut 12 en vervolgens tot 70% in minuut 15, waar de verhouding 3 min. constant bleef. TPA, MHET en BHET werden gedetecteerd bij 240 nm en de kwantificering geschiedde met behulp van ijkcurves.

Om de omloopsnelheden van MHET en BHET te kwantificeren werden reacties (100 µL) met 1 mM van het substraat in 40 mM NaPi pH 7,5 met 80 mM NaCl en 20% (v/v) DMSO geïncubeerd bij 30 °C voordat ze werden gestopt en geanalyseerd zoals hierboven beschreven. MHETase werd gebruikt bij 6 nM gedurende 30 min in het geval van MHET. Voor BHET werd een voorscreening met 6 nM of 12 nM MHETase-varianten gebruikt om potentieel actieve enzymen te identificeren, die vervolgens bij hogere concentraties werden geanalyseerd. Ongeveer 100 nM van de varianten werden gedurende 19,25 u gebruikt en 3 nM wild-type MHETase werd aan deze reacties toegevoegd voor de volledige omzetting van het gevormde MHET in TPA, dat via HPLC werd gekwantificeerd. Het experiment werd driemaal herhaald.

MpNPT-stamoplossingen werden bereid in DMSO in concentraties van 10, 1 en 0,1 mM. De substraatconcentraties waren 0,1-1200 µM in 100 mM TRIS pH 7,5 of 100 mM NaPi pH 7,5. De kinetische parameters zijn in beide buffers dezelfde. De reactie in de 400 µL cuvet werd gestart bij 25 °C door toevoeging van het enzym tot een eindconcentratie van ca. 1 nM (actieve varianten) tot 500 nM (inactieve varianten). Absorptieverandering werd gevolgd op een Cary50 spectrofotometer (Varian) bij 400 nm. Absorptieveranderingen werden gecorrigeerd voor niet-enzymatische hydrolyse (zie vorige paragraaf). De beginsnelheden (gemiddeld tien verschillende combinaties van enzym- en substraatconcentraties voor elke variant) werden gebruikt voor de aanpassing van Km en vmax volgens de kinetiek van Michaelis Menten. KI voor competitieve remmers werden gemeten bij 30 °C en worden berekend met Eq. (1)