Reagensek

A PET-et kereskedelmi palackokból nyertük. Minden más vegyszert a legnagyobb tisztaságban a Sigma-Aldrich, Carl Roth, Alfa Aesar vagy Acros cégektől vásároltunk, ha másképp nem szerepel.

Ligandok és szubsztrátok szintézise

A szintetizált vegyületek azonosságát és tisztaságát NMR segítségével ellenőriztük. Az 1H spektrumokat DMSO-d6-ban mértük egy 5 mm-es PABBO BB-1H/D Z-GRD Z104275/0398 szondafejjel felszerelt Bruker Avance II 300 készülékkel 25-28 °C-on (S7a-f ábra). A mérések kalibrálásához tetrametilszilánt használtunk.

Biszhidroxietil tereftalát (BHET): A BHET-et PET-palackból etilénglikollal végzett alkoholízis útján szintetizáltuk. Húsz gramm PET-et és 0,2 g vízmentes nátrium-acetátot 120 ml etilénglikolban 8 órán át refluxáltunk, majd egy éjszakán át hűtöttük. 120 ml H2O-t adtunk hozzá, majd 4 °C-on szűrést végeztünk. A terméket 20 mL hideg H2O-val mostuk, majd többször extraháltuk forró H2O-val. A BHET fehér tűként jelent meg (18 g (68%), Mp 210-212 °C).

Biszhidroxietil tereftálsavamid (BHETA): A BHETA-t PET-ből 2-aminoetanollal végzett aminolízissel szintetizáltuk. Húsz gramm PET-et és 0,2 g vízmentes nátrium-acetátot 120 ml etanol-aminban 8 órán át refluxáltunk, majd egy éjszakán át hűtöttük. 120 ml H2O-t adtunk hozzá, majd 4 °C-on szűrést végeztünk. A terméket 20 mL hideg H2O-val mostuk, majd kétszer 100 mL forró H2O-val átkristályosítottuk. A BHETA enyhén rózsaszínű tűként jelent meg (20 g (76%), Mp 240-243 °C).

Dimetil tereftalát (DMT): A DMT-t tereftalil-klorid és metanol észteresítésével szintetizáltuk. 25 mmol tereftaloil-kloridot 30 ml metanollal reagáltattunk RT-n, majd 3 órán át refluxáltuk. A metanol desztillálása és 60 °C-on történő szárítás után 4,08 g-ot kaptunk (Mp 144-148 °C). A 0,5 M KOH-val és vízzel történő mosás nem változtatta meg az olvadáspontot.

Monohidroxietil tereftalát (MHET): Az MHET-et BHET-ből szintetizáltuk KOH-val történő részleges hidrolízissel. 8,7 mmol BHET-et 8,4 mmol KOH-val reagáltattunk 18 mL MgSO4-száraz etilénglikolban 110-130 °C-on 2,5 órán keresztül. 30 milliliter H2O-t adtunk hozzá, majd az elegyet háromszor extraháltuk 5 mL CHCl3-mal. A vizes fázist 25%-os HCl-lel 3 pH-ra állítottuk be, majd 4 °C-on szűrtük. Két extrakciós lépés 30 ml forró H2O-val és 4 °C-on történő szűrés után a csapadékot 60 °C-on szárítottuk (0,56 g (30%), Mp 185-190 °C).

Monohidroxietil tereftálsavamid (MHETA): Az MHETA-t a tereftalil-klorid részleges amidálásával szintetizáltuk etanol-aminnal. 150 mmol NaOH-t és 50 mmol etanolamint 50 ml H2O-ban cseppenként adtunk 1 óra alatt 50 mmol tereftalil-kloridhoz 50 ml H2O-ban, 0 °C-on. A reakciót további 2 órán át 0 °C-on és 2 órán át reflux alatt végeztük, majd forró szűrést végeztünk. A pH-t 25%-os HCl-lel 3-ra állítottuk be. A kapott szuszpenziót hidegen szűrtük, és a szűrletet 20 mL hideg vízzel mostuk. A terméket 100 mL forró H2O-ból átkristályosítottuk, így fényes kristályokat kaptunk (2,4 g (23%), Mp 209-212 °C).

Mono-4-nitrofenil tereftalát (MpNPT): Az MpNPT-t tereftaloil-klorid és 4-nitrofenolát észteresítésével szintetizáltuk. 50 mmol tereftaloil-kloridot és 50 mmol nátrium-4-nitrofenolátot 50 ml dietil-éterben szuszpendáltunk, és 2 órán át 0 °C-on, majd egy éjszakán át RT-n reagáltattuk. Hozzáadtunk 2,5 g Na2CO3-t és 4,5 g NaHCO3-t 50 ml H2O-ban, és 10 órán át RT-n reagáltattuk. A pH-t NaOH-val 8,5-re állítottuk be. Az oldhatatlan frakciót tovább extraháltuk összesen 2,5 g Na2CO3-mal és 2,5 g NaHCO3-mal 100 mL H2O-ban, majd semleges pH-ig mostuk. Az MpNPT-t 3 pH-jú HCl-lal kicsaptuk, majd kétszer 50 mL 0,1 M HCl-lal mostuk, majd semleges pH-ig. Az MpNPT-t a szennyező bisz-4-nitrofenil-tereftaláttól 100 mM NaPi pH 7,4-es extrakcióval és savas kicsapással választottuk el. A nagyon halvány sárga iszapot 60 °C-on szárítottuk (Mp 202 °C).

Tisztítás, valamint kristályosítás és szerkezetmegoldás

Az I. sakaiensis PETázt (28-290 aminosavmaradványok) a Genscript-től (Piscataway, USA) rendeltük, mint a pET-21b-be szubklónozott, C-terminális His6-tagot tartalmazó, kodon-optimalizált szintetikus gént. Az I. sakaiensis MHETase-t (20-603 aminosavmaradványok) kódoló, pUC19 vektorba klónozott kodon-optimalizált DNS fragmentumot a Genscript-től rendeltük, majd később N-terminális His6-taggal ellátott pColdII expressziós plazmidba szubklónoztuk (TAKARA BIO, Inc, Otsu, Shiga, Japán) gyorsklónozással (11. kiegészítő ábra)30.

A fehérje expressziójához E. coli Shuffle T7 expressz sejteket (New England Biolabs, Frankfurt, Németország) transzformáltunk a plazmidokkal és 100 µgmL-1 ampicillint tartalmazó lizogénleves (LB) agar lemezeken szelektáltuk. Az egy éjszakán át tartó 30 °C-on történő növekedés után az éjszakai tenyészeteket beoltottuk. Az overexpresszióhoz 1 L-es, 200 ml 100 µg mL-1 ampicillinnel kiegészített LB táptalajt tartalmazó Erlenmeyer-lombikokat használtunk. A sejteket 33 °C-on és 160 rpm rázósebességen növesztettük, amíg a 600 nm-en mért optikai sűrűség (OD600) 1 nem lett, majd 1 mM izopropil β-d-1-tiogalaktopiranozidot (IPTG) adtunk hozzá. 2,5 OD600-nál a hőmérsékletet 16 °C-ra csökkentettük, és az overexpressziót egy éjszakán át folytattuk. A sejteket 4 °C-on, 10 000 × g-n 20 percig tartó centrifugálással szedtük le, és további felhasználásig -20 °C-on tároltuk.

A sejteket 50 mM TRIS-HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl, 10 mM imidazol és 1 mM ditiotreitol (DTT) (R puffer) szonikálásával bontottuk. A sejttörmeléket centrifugálással tisztítottuk. A sejtkivonatot Ni-NTA szefarózzal ellátott gravitációs áramlási oszlopra töltöttük, 20 mM imidazollal kiegészített R pufferrel mostuk, és 200 mM imidazollal (PETáz esetén 300 mM imidazollal) kiegészített R pufferrel eluáltuk. A fehérjefrakciókat Superdex75 10/300 oszlopon (GE Healthcare, Solingen, Németország) 20 mM TRIS pH 7,5, 150 mM NaCl mellett tisztítottuk, ~10 mg mL-1-re koncentráltuk, folyékony N2-ben gyorsfagyasztottuk és -80 °C-on tároltuk. A fehérjekoncentrációt spektrofotometriásan határoztuk meg ε280 = 102 955 M-1 cm-1 (ε280 = 97 455 M-1 cm-1 a W397A mutáns esetében). A minták tisztaságát a GelAnalyzer szoftver (2010a verzió) segítségével becsültük meg.

A PETáz kristályosítása 10 mg mL-1 koncentrációban ülő csepp gőzdiffúzióval történt (1 µl fehérje plusz 1 µl rezervoár) 20 °C-on. A PETáz tipikus kristályai 20 °C-on növekedtek 0,1 M nátrium-citrátot vagy nátrium-acetátot pH 5,0, 15% (v/v) PEG8000 és 0,5 M lítium-szulfátot tartalmazó rezervoároldattal. A MHETáz 10 mg mL-1 koncentrációban ülő csepp gőzdiffúzióval (1 µl fehérje plusz 1 µl rezervoár) 20 °C-on kristályosodott 20 °C-on, 0,1 M HEPES, pH 7,5, 30% (v/v) 2,4-MPD és 0,12 M ammónium-szulfát (P212121 tércsoport) vagy 0,1 M MES, pH 6,5, 10% (v/v) PEG8000 és 0,1 M cink-acetát (P1 tércsoport) rezervoárral. Az MPD-vel növesztett MHETáz-kristályokat a tárolóoldatukban kriohűtöttük. A PETáz-kristályt 0,1 M nátrium-acetát, pH 5,0, 10% (v/v) PEG8000, 15% (v/v) PEG400 és 0,5 M lítium-szulfát segítségével krio-védtük. A P1 MHETáz kristályt 0,1 M TRIS, pH 8,5, 5% (v/v) PEG8000, 20% (v/v) PEG400 és 0,5 M lítium-szulfát segítségével krio-védtük. A derivatizálási kísérletekhez a kristályokat 24 órán át inkubáltuk a megfelelő ligandummal telített krio-védő oldatban, majd folyékony nitrogénben gyorsfagyasztottuk. A MHETáz diffrakciós adatokat 100 K-en gyűjtöttük a berlini BESSY II tárológyűrű 14.1 és 14.2 sugárvonalain31. A PETáz diffrakciós adatokat a hamburgi PETRAIII P13 sugárvonalán gyűjtöttük32. Minden diffrakciós adatot XDS33,34 segítségével dolgoztunk fel.

A PETáz szerkezetét molekuláris helyettesítéssel oldottuk meg a T. fusca cutinase TfCut2 (PDB-bejegyzés 4CG111,23) szerkezeti koordinátáinak felhasználásával. Az MHETA-val komplexbe kapcsolt MHETáz szerkezetét molekuláris helyettesítéssel oldottuk meg a MoRDa35 MR pipeline segítségével, amely a PDB 6G21 bejegyzésen alapuló homológiamodell hat példányát helyezte el (egy nem publikált A. oryzae feruloilészteráz, AoFaeB-2; 26%-os azonosság a MHETázzal, 87%-os lekérdezési lefedettséggel). A szerkezeteket a PHENIX.REFINE vagy a PETase35,36 esetében a Refmac segítségével történő többszöri finomítás során egészítettük ki, amit a COOT segítségével történő kézi modellépítés szakított meg, ami a MHETase37 esetében kiterjedt volt. A BA-val komplexált MHETáz szerkezetét molekuláris helyettesítéssel oldottuk meg, keresési modellként a MHETA ko-struktúra teljes aszimmetrikus egységét alkalmazva, illetve kiegészítve. Az MHETA és a BA ligandumok a finomítás végső fázisaiban egyértelműen a megfelelő sűrűségekbe kerültek. A P1 ligandummentes MHETáz szerkezetét molekuláris helyettesítéssel oldottuk meg a ligandumot elhagyó véglegesített MHETáz-MHETA ko-struktúra szerkezeti koordinátáit alkalmazva. Az aszimmetrikus egységben lévő tíz MHETáz-kópiát kézzel vagy a PHENIX.AUTOBUILD segítségével építettük fel és a PHENIX.REFINE36 segítségével finomítottuk.

MHETáz mutánsok előállítása hely-irányított mutagenezissel

Az egyhelyű mutánsok létrehozásához vagy a Q5 hely-irányított mutagenezis-kitet (New England Biolabs), vagy a QuikChange® módszert használtuk. Az első esetben a kitet a gyártó utasításai szerint használtuk. A QuikChange® módszer esetében egy standard PCR-keveréket (25 µl) használtunk, amely 2,5 µl 10× Pfu pufferből (Roboklon GmbH, Berlin, Németország), 0,5 µl kevert dezoxinukleozid-trifoszfátból (egyenként 0,25 mM), plazmid DNS-ből (~40 ng), 1,25 µl előre- és fordított primerekből (10 µM; 4. kiegészítő táblázat), 1 µl PfuPlus! polimerázból (Roboklon GmbH) és 18,1 µl ultratiszta vízből állt. A denaturáláshoz a hőmérsékletet 30 másodpercig 95 °C-on tartottuk. Ezt követően 20 ciklust végeztünk: 30 másodperc denaturálás 95 °C-on, 30 másodperc lágyítás 63 °C-on és 6 perc elongáció 72 °C-on. Az utolsó lépésben a végső elongációt 72 °C-on 10 percig végeztük. A PCR után a templát DNS-t DpnI-vel (New England BioLabs) emésztettük 2 órán keresztül 37 °C-on, majd az enzimet 10 percig 80 °C-on inaktiváltuk. A kapott PCR-termékekkel E. coli TOP10 sejteket transzformáltunk, majd 100 µg ml-1 ampicillint tartalmazó LB agar lemezekre ültettük, és egy éjszakán át 37 °C-on növesztettük. A nukleotidszekvenciát az Eurofins (Ebersberg, Németország) szekvenálással erősítette meg.

Az MpNPT autohidrolízise

A hidrolízist spektrofotometriásan követtük 400 nm-en, 30 °C-on. Magasabb pH-értékeknél, ahol a hidrolízis majdnem befejeződik, exponenciális bomlást illesztettünk. Alacsonyabb pH-értékeknél a bomlási állandókat a kezdeti sebességekből számították ki, figyelembe véve a tisztaságot és a 4-nitrofenol részleges deprotonálódását (a várható érték pH 7,5-nél 12 420 M-1 cm-1, amelyet ε405 nm = 18 000 M-1 cm-1 és pKa = 7,15 a 4-nitrofenol esetében számítottak ki)38 . A 4-nitrofenol abszorpciós különbsége 400 és 405 nm-en kevesebb mint 0,5% volt. Az autohidrolízist pH 7,5 és 12,5 között mértük 100 mM foszfát- vagy borátpufferekben és NaOH-oldatokban, k2 = 9,2 M-1 s-1 sebességállandóval d/dT = k2 , azaz k1 = 2,9 × 10-6 s-1 esetén (12. kiegészítő ábra). Az enzimkinetikához szintén használt 100 mM TRIS pH 7,5-ben k1 = 46 × 10-6 s-1 értéket határoztunk meg d/dT = k1 esetén. A TRIS tehát ~10-szeresére növeli a hidrolízis sebességét a 7,5 pH-jú hidroxiddal várt reakciósebességhez képest.

Aktivitásvizsgálatok

Az aktivitást az MHET és BHET szubsztrátok esetében HPLC-vel, az MpNPT esetében pedig spektrofotometriával mértük. A HPLC-méréshez a reakciókat (100 µl) azonos térfogatú 160 mM NaPi (nátrium-foszfát puffer) pH 2,5 és 20% (v/v) dimetil-szulfoxid (DMSO) hozzáadásával és 10 percig 80 °C-ra történő melegítéssel állítottuk le. A TPA-t, MHET-et és BHET-et Kinetex 5 µm EVO C18 100 Å, 150 × 4,6 mm-es (Phenomenex, Aschaffenburg, Németország) 5 µm-es EVO C18 100 Å, 150 × 4,6 mm-es (Phenomenex, Aschaffenburg, Németország) készülékben 10 µl minta injektálása után 30 °C-on acetonitril és 0,1% (v/v) hangyasav vízben gradienssel választottuk szét. Az acetonitrilt 5-ről 44%-ra emeltük a 12. percig, majd a 15. percben 70%-ra, ahol az arány 3 percig állandó maradt. A TPA-t, az MHET-et és a BHET-et 240 nm-en detektáltuk, és a mennyiségi meghatározást kalibrációs görbék segítségével valósítottuk meg.

Az MHET és a BHET forgalmi sebességének számszerűsítéséhez a 40 mM NaPi pH 7,5-ben, 80 mM NaCl-lal és 20% (v/v) DMSO-val 1 mM szubsztrátot tartalmazó reakciókat (100 µL) 30 °C-on inkubáltuk, majd leállítottuk és a fent leírtak szerint elemeztük. Az MHETáz esetében 6 nM-t használtunk 30 percig. A BHET esetében 6 nM vagy 12 nM MHETáz-változatokkal végzett előszűrést alkalmaztunk a potenciálisan aktív enzimek azonosítására, amelyeket ezt követően magasabb koncentrációban elemeztünk. A variánsokból körülbelül 100 nM-ot használtunk 19,25 órán keresztül, és 3 nM vad típusú MHETázt adtunk ezekhez a reakciókhoz a képződött MHET teljes átalakításához TPA-vá, amelyet HPLC-vel számszerűsítettünk. A kísérletet háromszor ismételtük meg.

MpNPT törzsoldatokat készítettünk DMSO-ban 10, 1 és 0,1 mM koncentrációban. A szubsztrátkoncentrációk 0,1-1200 µM voltak 100 mM TRIS pH 7,5-ben vagy 100 mM NaPi pH 7,5-ben. A kinetikai paraméterek mindkét pufferben azonosak. A reakciót a 400 µL-es küvettában 25 °C-on indítottuk el az enzim hozzáadásával kb. 1 nM (aktív változatok) és 500 nM (inaktív változatok) közötti végső koncentrációig. Az abszorpció változását Cary50 spektrofotométeren (Varian) követtük 400 nm-en. Az abszorpciós változásokat korrigáltuk a nem enzimatikus hidrolízisre (lásd az előző bekezdést). A kezdeti sebességeket (átlagosan tíz különböző enzim- és szubsztrátkoncentráció-kombináció minden egyes variáns esetében) használtuk a Km és vmax illesztéséhez a Michaelis-Menten-kinetika szerint. A kompetitív inhibitorok KI értékeit 30 °C-on mértük, és az (1)