Réactifs
Le PET a été obtenu à partir de bouteilles commerciales. Tous les autres produits chimiques ont été achetés à la plus haute pureté auprès de Sigma-Aldrich, Carl Roth, Alfa Aesar ou Acros, sauf indication contraire.
Synthèse des ligands et des substrats
L’identité et la pureté de tous les composés synthétisés ont été vérifiées par RMN. Les spectres 1H ont été mesurés dans du DMSO-d6 sur un Bruker Avance II 300 équipé d’une tête de sonde PABBO BB-1H/D Z-GRD Z104275/0398 de 5 mm à 25-28 °C (Fig. S7a-f). Pour l’étalonnage des mesures, du tétraméthylsilane a été utilisé.
Téréphtalate de bisydroxyéthyle (BHET) : Le BHET a été synthétisé à partir d’une bouteille de PET par alcoolyse avec de l’éthylène glycol. Vingt grammes de PET et 0,2 g d’acétate de sodium anhydre ont été portés à reflux dans 120 mL d’éthylène glycol pendant 8 h, puis refroidis pendant une nuit. 120 mL de H2O ont été ajoutés et la filtration a été effectuée à 4 °C. Le produit a été lavé avec 20 mL d’eau froide et extrait plusieurs fois avec de l’eau chaude. Le BHET est apparu sous forme d’aiguilles blanches (18 g (68%), Mp 210-212 °C).
Amide d’acide bisydroxyéthyl téréphtalique (BHETA) : Le BHETA a été synthétisé à partir du PET par aminolyse avec du 2-amino éthanol. Vingt grammes de PET et 0,2 g d’acétate de sodium anhydre ont été portés à reflux dans 120 mL d’éthanolamine pendant 8 heures, puis refroidis pendant une nuit. 120 mL de H2O ont été ajoutés et la filtration a été effectuée à 4 °C. Le produit a été lavé avec 20 mL de H2O froid et recristallisé deux fois avec 100 mL de H2O chaud. Le BHETA est apparu sous forme d’aiguilles légèrement rosées (20 g (76%), Mp 240-243 °C).
Téréphtalate de diméthyle (DMT) : Le DMT a été synthétisé par estérification du chlorure de téréphtaloyle avec le méthanol. 25 mmol de chlorure de téréphtaloyle ont été mis en réaction avec 30 mL de méthanol à RT, puis portés à reflux pendant 3 h. Après distillation du méthanol et séchage à 60 °C, 4,08 g ont été obtenus (Mp 144-148 °C). Le lavage avec du KOH 0,5 M et de l’eau n’a pas modifié le point de fusion.
Téréphtalate de monohydroxyéthyle (MHET) : Le MHET a été synthétisé à partir du BHET par hydrolyse partielle avec du KOH. On a fait réagir 8,7 mmol de BHET avec 8,4 mmol de KOH dans 18 mL d’éthylène glycol séché au MgSO4 à 110-130 °C pendant 2,5 h. On a ajouté 30 millilitres de H2O et le mélange a été extrait trois fois avec 5 mL de CHCl3. La phase aqueuse a été ajustée à pH 3 avec 25% de HCl et filtrée à 4 °C. Après deux étapes d’extraction avec 30 mL de H2O chaud et une filtration à 4 °C, le précipité a été séché à 60 °C (0,56 g (30%), Mp 185-190 °C).
Amide de l’acide monohydroxyéthyl téréphtalique (MHETA) : Le MHETA a été synthétisé par amidation partielle du chlorure de téréphtaloyle avec l’éthanolamine. 150 mmol de NaOH et 50 mmol d’éthanolamine dans 50 mL de H2O ont été ajoutés goutte à goutte en 1 h à 50 mmol de chlorure de téréphtaloyle dans 50 mL de H2O à 0 °C. La réaction a été effectuée pendant 2 h supplémentaires à 0 °C et 2 h sous reflux, puis filtrée à chaud. Le pH a été ajusté à 3 avec 25% de HCl. La suspension obtenue a été filtrée à froid et le filtrat a été lavé avec 20 mL d’eau froide. Le produit a été recristallisé à partir de 100 mL de H2O chaud pour donner des cristaux brillants (2,4 g (23%), Mp 209-212 °C).
Téréphtalate de mono-4-nitrophényle (MpNPT) : Le MpNPT a été synthétisé par estérification du chlorure de téréphtaloyle avec le 4-nitrophénolate. 50 mmol de chlorure de téréphtaloyle et 50 mmol de 4-nitrophénolate de sodium ont été mis en suspension dans 50 mL d’éther diéthylique et ont réagi pendant 2 h à 0 °C, puis à température ambiante pendant la nuit. 2,5 g de Na2CO3 et 4,5 g de NaHCO3 dans 50 ml de H2O ont été ajoutés et ont réagi à température ambiante pendant 10 h. Le pH a été ajusté à 8,5 avec NaOH. La fraction insoluble a été de nouveau extraite avec un total de 2,5 g de Na2CO3 et 2,5 g de NaHCO3 dans 100 mL de H2O, puis lavée jusqu’à obtenir un pH neutre. La MpNPT a été précipitée avec du HCl à pH 3 et lavée deux fois avec 50 mL de HCl 0,1 M, puis jusqu’à obtention d’un pH neutre. Le MpNPT a été séparé du téréphtalate de bis-4-nitrophényle contaminant par extraction avec du NaPi 100 mM à pH 7,4 et par précipitation acide. La bouillie jaune très pâle a été séchée à 60 °C (Mp 202 °C).
Purification ainsi que cristallisation et solution de structure
La PETase de I. sakaiensis (résidus d’acides aminés 28-290) a été commandée à Genscript (Piscataway, USA) comme gène synthétique optimisé pour le codon contenant une étiquette His6 C-terminale sous-clonée dans pET-21b. Un fragment d’ADN optimisé pour le codon codant pour la MHETase de I. sakaiensis (résidus d’acides aminés 20-603) cloné dans un vecteur pUC19 a été commandé auprès de Genscript, puis sous-cloné dans un plasmide d’expression pColdII avec une étiquette His6 N-terminale (TAKARA BIO, Inc, Otsu, Shiga, Japon) par FastCloning (figure supplémentaire 11)30.
Pour l’expression des protéines, des cellules d’expression E. coli Shuffle T7 (New England Biolabs, Francfort, Allemagne) ont été transformées avec les plasmides et sélectionnées sur des plaques de gélose de bouillon de lysogénie (LB) contenant 100 µgmL-1 d’ampicilline. Après une croissance d’une nuit à 30 °C, les cultures de nuit ont été inoculées. Pour la surexpression, on a utilisé des flacons Erlenmeyer à chicanes de 1 L contenant 200 mL de milieu LB complété par 100 µg mL-1 d’ampicilline. Les cellules ont été cultivées à 33 °C et à une vitesse d’agitation de 160 rpm jusqu’à une densité optique à 600 nm (OD600) de 1 avant l’ajout de 1 mM d’isopropyl β-d-1-thiogalactopyranoside (IPTG). À une OD600 de 2,5, la température a été abaissée à 16 °C et la surexpression a continué pendant la nuit. Les cellules ont été récoltées par centrifugation à 4 °C, 10 000 × g pendant 20 min et stockées à -20 °C jusqu’à utilisation ultérieure.
Les cellules ont été perturbées par sonication dans 50 mM TRIS-HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl, 10 mM imidazole et 1 mM Dithiothreitol (DTT) (tampon R). Les débris cellulaires ont été éliminés par centrifugation. L’extrait cellulaire a été chargé sur une colonne à écoulement gravitaire avec sépharose Ni-NTA, lavé avec du tampon R complété par 20 mM d’imidazole et élué avec du tampon R complété par 200 mM d’imidazole (300 mM d’imidazole dans le cas de la PETase). Les fractions protéiques ont été purifiées sur une colonne Superdex75 10/300 (GE Healthcare, Solingen, Allemagne) avec 20 mM TRIS pH 7.5, 150 mM NaCl, concentrées à ~10 mg mL-1, congelées au flash dans du N2 liquide et stockées à -80 °C. Les concentrations de protéines ont été déterminées par spectrophotométrie en utilisant ε280 = 102 955 M-1 cm-1 (ε280 = 97,455 M-1 cm-1 pour le mutant W397A). La pureté des échantillons a été estimée en employant le logiciel GelAnalyzer (version 2010a).
La PETase a été cristallisée à une concentration de 10 mg mL-1 par diffusion de vapeur en gouttes assises (1 µL de protéine plus 1 µL de réservoir) à 20 °C. Des cristaux typiques de PETase se sont développés à 20 °C avec une solution réservoir contenant du citrate de sodium ou de l’acétate de sodium 0,1 M pH 5,0, 15 % (v/v) de PEG8000 et 0,5 M de sulfate de lithium. Cristaux de MHETase cristallisés à une concentration de 10 mg mL-1 par diffusion de vapeur en gouttes assises (1 µL de protéine plus 1 µL de réservoir) à 20 °C avec un réservoir contenant 0,1 M HEPES, pH 7,5, 30% (v/v) de 2,4-MPD et 0,12 M de sulfate d’ammonium (groupe spatial P212121) ou 0,1 M MES, pH 6,5, 10% (v/v) de PEG8000 et 0,1 M d’acétate de zinc (groupe spatial P1). Les cristaux de MHETase cultivés avec MPD ont été cryo-refroidis dans leur solution réservoir. Le cristal de PETase a été cryoprotégé avec de l’acétate de sodium 0,1 M, pH 5,0, 10% (v/v) de PEG8000, 15% (v/v) de PEG400 et 0,5 M de sulfate de lithium. Le cristal de MHETase P1 a été cryoprotégé avec du TRIS 0,1 M, pH 8,5, 5% (v/v) PEG8000, 20% (v/v) PEG400 et 0,5 M sulfate de lithium. Pour les expériences de dérivatisation, les cristaux ont été incubés pendant 24 heures dans la solution cryoprotectrice respective saturée avec le ligand et congelés dans l’azote liquide. Les données de diffraction de la MHETase ont été recueillies à 100 K sur les lignes de faisceaux 14.1 et 14.2 de l’anneau de stockage BESSY II, Berlin, Allemagne31. Les données de diffraction de la PETase ont été recueillies à la ligne de faisceau P13, PETRAIII, Hambourg32. Toutes les données de diffraction ont été traitées avec XDS33,34.
La structure de la PETase a été résolue par remplacement moléculaire en employant les coordonnées structurelles de la cutinase TfCut2 de T. fusca (entrée PDB 4CG111,23). La structure de la MHETase complexée à MHETA a été résolue par remplacement moléculaire en utilisant le pipeline MR MoRDa35, qui a placé six copies d’un modèle d’homologie basé sur l’entrée PDB 6G21 (une feruloyl estérase A. oryzae non publiée, AoFaeB-2 ; 26% d’identité avec la MHETase avec une couverture de requête de 87%). Les structures ont été complétées au cours de plusieurs cycles de raffinement avec PHENIX.REFINE ou Refmac dans le cas de la PETase35,36, entrecoupés par la construction manuelle d’un modèle avec COOT, qui a été étendue pour la MHETase37. La structure de la MHETase complexée à l’AB a été résolue par remplacement moléculaire en utilisant l’unité asymétrique entière de la co-structure MHETA comme modèle de recherche et a été complétée, respectivement. Les ligands MHETA et BA ont été placés dans les densités respectives sans ambiguïté lors des étapes finales du raffinement. La structure de la MHETase sans ligand P1 a été résolue par remplacement moléculaire en utilisant les coordonnées de structure d’une co-structure MHETase-MHETA finalisée sans ligand. Les dix copies de MHETase dans l’unité asymétrique ont été construites manuellement ou par PHENIX.AUTOBUILD et raffinées avec PHENIX.REFINE36.
Génération de mutants de MHETase par mutagenèse dirigée par site
Pour la création de mutants à site unique, le kit de mutagenèse dirigée par site Q5 (New England Biolabs) ou la méthode QuikChange® ont été utilisés. Dans le premier cas, le kit a été utilisé selon les instructions du fabricant. Dans le cas de la méthode QuikChange®, un mélange PCR standard (25 µL) composé de 2,5 µL de tampon Pfu 10× (Roboklon GmbH, Berlin, Allemagne), 0,5 µL de mélange de désoxynucléosides triphosphates (0,25 mM chacun), d’ADN plasmidique (~40 ng), 1,25 µL d’amorces directes et inverses (10 µM ; Tableau supplémentaire 4), 1 µL de polymérase PfuPlus ! (Roboklon GmbH) et 18,1 µL d’eau ultrapure a été utilisé. Pour la dénaturation, la température a été maintenue à 95 °C pendant 30 s. Ensuite, 20 cycles de dénaturation de 30 s à 95 °C, d’annelage pendant 30 s à 63 °C et d’élongation pendant 6 min à 72 °C ont été effectués. Dans une dernière étape, l’élongation finale a été réalisée à 72 °C pendant 10 minutes. Après la PCR, l’ADN matrice a été digéré avec DpnI (New England BioLabs) pendant 2 h à 37 °C avant que l’enzyme ne soit inactivée à 80 °C pendant 10 min. Les cellules E. coli TOP10 ont été transformées avec les produits PCR obtenus et placées sur des plaques de gélose LB contenant 100 µg mL-1 d’ampicilline et cultivées pendant la nuit à 37 °C. La séquence nucléotidique a été confirmée par séquençage chez Eurofins (Ebersberg, Allemagne).
Autohydrolyse de MpNPT
L’hydrolyse a été suivie par spectrophotométrie à 400 nm à 30 °C. À des valeurs de pH plus élevées, où l’hydrolyse va presque jusqu’à la fin, une décroissance exponentielle a été ajustée. Aux valeurs de pH inférieures, les constantes de décroissance ont été calculées à partir des taux initiaux en tenant compte de la pureté et de la déprotonation partielle du 4-nitrophénol (la valeur attendue à pH 7,5 est de 12 420 M-1 cm-1 calculée avec ε405 nm = 18 000 M-1 cm-1 et pKa = 7,15 pour le 4-nitrophénol)38. La différence d’absorption du 4-nitrophénol à 400 et 405 nm était inférieure à 0,5 %. L’autohydrolyse a été mesurée de pH 7,5 à 12,5 dans des tampons phosphate ou borate 100 mM et des solutions de NaOH avec une constante de vitesse de k2 = 9,2 M-1 s-1 pour d/dT = k2 , c’est-à-dire k1 = 2,9 × 10-6 s-1 (figure supplémentaire 12). Dans 100 mM TRIS pH 7,5, également utilisé pour la cinétique enzymatique, on a déterminé k1 = 46 × 10-6 s-1 pour d/dT = k1. Le TRIS augmente donc la vitesse d’hydrolyse ~10 fois par rapport à la vitesse de réaction attendue avec l’hydroxyde à pH 7,5.
Tests d’activité
L’activité a été mesurée pour les substrats MHET et BHET par HPLC et pour MpNPT par spectrophotométrie. Pour la mesure par HPLC, les réactions (100 µL) ont été arrêtées par l’ajout d’un volume égal de 160 mM NaPi (tampon phosphate de sodium) pH 2,5 avec 20% (v/v) de diméthylsulfoxyde (DMSO) et chauffage à 80 °C pendant 10 min. Le TPA, le MHET et le BHET ont été séparés sur un Kinetex 5 µm EVO C18 100 Å, 150 × 4,6 mm (Phenomenex, Aschaffenburg, Allemagne) avec un gradient d’acétonitrile et d’acide formique à 0,1% (v/v) dans l’eau à 30 °C après injection de 10 µL d’échantillon. L’acétonitrile a été augmenté de 5 à 44% jusqu’à la minute 12, puis à 70% à la minute 15 où le ratio est resté constant pendant 3 min. Le TPA, le MHET et le BHET ont été détectés à 240 nm et la quantification a été réalisée par l’utilisation de courbes d’étalonnage.
Pour quantifier les taux de renouvellement du MHET et du BHET, des réactions (100 µL) avec 1 mM du substrat dans 40 mM NaPi pH 7,5 avec 80 mM NaCl et 20% (v/v) DMSO ont été incubées à 30 °C avant d’être arrêtées et analysées comme décrit ci-dessus. La MHETase a été utilisée à 6 nM pendant 30 min dans le cas de la MHET. Pour la THA, une présélection avec des variantes de la MHETase à 6 nM ou 12 nM a été utilisée pour identifier les enzymes potentiellement actives qui ont ensuite été analysées à des concentrations plus élevées. Environ 100 nM des variants ont été utilisés pendant 19,25 h et 3 nM de MHETase de type sauvage ont été ajoutés à ces réactions pour la conversion complète du MHET formé en TPA qui a été quantifié par HPLC. L’expérience a été répétée trois fois.
Des solutions mères de MpNPT ont été préparées dans du DMSO à des concentrations de 10, 1 et 0,1 mM. Les concentrations de substrat étaient de 0,1-1200 µM dans 100 mM TRIS pH 7,5 ou 100 mM NaPi pH 7,5. Les paramètres cinétiques sont les mêmes dans les deux tampons. La réaction dans la cuvette de 400 µL a été lancée à 25 °C par l’addition de l’enzyme à une concentration finale d’environ 1 nM (variantes actives) jusqu’à 500 nM (variantes inactives). Le changement d’absorption a été suivi sur un spectrophotomètre Cary50 (Varian) à 400 nm. Les changements d’absorption ont été corrigés pour l’hydrolyse non enzymatique (voir paragraphe précédent). Les vitesses initiales (en moyenne dix combinaisons différentes de concentrations d’enzyme et de substrat pour chaque variante) ont été utilisées pour ajuster le Km et le vmax selon la cinétique de Michaelis-Menten. Les KI des inhibiteurs compétitifs ont été mesurés à 30 °C et sont calculés avec l’équation (1)
en utilisant 4-8 concentrations différentes de substrat (c’est-à-dire MpNPT). Le type sauvage et les variants S225A, 488A, W397A, F495A, F415A, S416A et R411Q ont également été mesurés à 30 °C. Ces paramètres cinétiques ont été normalisés sur les activités de type sauvage à 25 °C.
Pour mesurer l’activité féruloyl et chlorogénate estérase, quatre substrats ont été testés : l’ester méthylique de l’acide coumarique (Coum-ME), l’ester méthylique de l’acide caféique (Caff-ME), l’acide chlorogénique (Chlorogen) et l’ester méthylique de l’acide p-hydroxy-hydroxy benzoïque (pHB-ME). Les spectres UV-Vis utilisant 10 μM de l’ester et de l’acide libre ont été mesurés et les Δε calculés (figure supplémentaire 10). L’hydrolyse a été mesurée comme pour la MpNPT, mais avec 10-35 nM d’enzyme, 100 µM de substrat et à 335 nm (Coum-ME, Δε = -6100 M-1 cm-1), 350 nm (Caff-ME, Δε = -5700 M-1 cm-1), 350 nm (Chlorogen, Δε = -7400 M-1 cm-1) et 280 nm (pHB-ME, Δε = -3900 M-1 cm-1).
Fluorimétrie à balayage différentiel
Pour l’analyse de la liaison des ligands à la MHETase, la FSN a été utilisée. Les expériences ont été menées avec un Prometheus NT.48 (NanoTemper, Munich, Allemagne). L’appareil a une longueur d’onde d’excitation fixe de 285 nm et des longueurs d’onde d’émission de 330 et 350 nm. La MHETase (wt) a toujours été utilisée à 100 µgmL-1 dans la solution finale. Les concentrations finales des tampons étaient de 100 mM TRIS pH 7,5, 150 mM NaCl avec ou sans 20% de DMSO. Des capillaires à haute sensibilité tels que fournis par NanoTemper ont été utilisés. La plage de température de 20 à ≥80 °C a été balayée à 0,5 K par minute. Les ligands ont été préparés dans des solutions mères 21,7 mM et dilués à une concentration finale de 10 mM. La solution saturée (avec 0 ou 42,5% de DMSO) a été utilisée comme stock, si les composés ne se dissolvaient pas complètement. Pour les composés empêchant des mesures fiables par absorption (4-nitrophénol, 4-nitrothiophénol, acide 2-hydroxybenzoïque) ou par fluorescence (BHET), des concentrations finales de 1 mM ont également été testées. Les valeurs de Tm sont rapportées telles que fournies par le logiciel Prometheus (maximum de la pente pour le rapport I330 nm/I350 nm). L’expérience a été réalisée en une seule mesure.
Alignement de séquence et arbre phylogénétique
Les recherches d’homologie protéique pour les protéines de type MHETase ont été effectuées avec l’outil de recherche d’alignement local de base du NCBI (BLAST) dans la base de données ESTHER (http://bioweb.ensam.inra.fr/ESTHER/general?what=blast) en utilisant la base de données Block_X.pep22,39. L’alignement de séquences multiples a été effectué par alignement musculaire en utilisant MEGA740. L’histoire évolutive a été déduite en utilisant la méthode du maximum de vraisemblance basée sur le modèle matriciel JTT41. L’arbre présentant la plus forte vraisemblance logarithmique (-19 562,87) est présenté. Le ou les arbres initiaux pour la recherche heuristique ont été obtenus automatiquement en appliquant les algorithmes Neighbor-Join et BioNJ à une matrice de distances par paires estimées à l’aide d’un modèle JTT, puis en sélectionnant la topologie présentant la valeur de vraisemblance logarithmique supérieure. L’analyse a porté sur 32 séquences d’acides aminés. Toutes les positions contenant des lacunes et des données manquantes ont été éliminées. Il y avait un total de 376 positions dans l’ensemble de données final. Les analyses évolutives ont été effectuées dans MEGA740.