Reagents

PET saatiin kaupallisista pulloista. Kaikki muut kemikaalit hankittiin mahdollisimman puhtaina Sigma-Aldrichilta, Carl Rothilta, Alfa Aesarilta tai Acrosilta, ellei toisin mainittu.

Ligandien ja substraattien synteesi

Kaikkien syntetisoitujen yhdisteiden tunnistettavuus ja puhtaus varmistettiin NMR:llä. 1H-spektrit mitattiin DMSO-d6:ssa Bruker Avance II 300 -laitteella, joka oli varustettu 5 mm:n PABBO BB-1H/D Z-GRD Z104275/0398 -anturipäällä 25-28 °C:ssa (kuva S7a-f). Mittausten kalibrointiin käytettiin tetrametyylisilaania.

Bishydroksietyylitereftalaatti (BHET): BHET syntetisoitiin PET-pullosta alkoholoimalla se etyleeniglykolin kanssa. Kaksikymmentä grammaa PET:tä ja 0,2 grammaa vedetöntä natriumasetaattia refluksoitiin 120 ml:ssa etyleeniglykolia 8 tunnin ajan ja jäähdytettiin sen jälkeen yön yli. Lisättiin 120 ml H2O:ta ja suodatettiin 4 °C:ssa. Tuote pestiin 20 ml:lla kylmää H2O:ta ja uutettiin useita kertoja kuumalla H2O:lla. BHET ilmestyi valkoisina neuloina (18 g (68 %), Mp 210-212 °C).

Bishydroksietyylitereftalihappoamidi (BHETA): BHETA syntetisoitiin PET:stä aminolyysillä 2-aminoetanolilla. Kaksikymmentä grammaa PET:tä ja 0,2 g vedetöntä natriumasetaattia refluksoitiin 120 ml:ssa etanoliamiinia 8 tunnin ajan ja jäähdytettiin sen jälkeen yön yli. Lisättiin 120 ml H2O:ta ja suodatettiin 4 °C:ssa. Tuote pestiin 20 ml:lla kylmää H2O:ta ja kiteytettiin uudelleen kahdesti 100 ml:lla kuumaa H2O:ta. BHETA ilmestyi vaaleanpunaisina neuloina (20 g (76 %), Mp 240-243 °C).

Dimetyylitereftalaatti (DMT): DMT syntetisoitiin esteröimällä tereftalaattikloridi metanolilla. 25 mmol tereftaloyylikloridia reagoitiin 30 ml:n metanolin kanssa RT:ssä, minkä jälkeen sitä refluksoitiin 3 h. Kun metanoli oli tislattu ja kuivattu 60 °C:ssa, saatiin 4,08 g (Mp 144-148 °C). Pesu 0,5 M KOH:lla ja vedellä ei muuttanut sulamispistettä.

Monohydroksietyylitereftalaatti (MHET): MHET syntetisoitiin BHET:stä osittaisella hydrolyysillä KOH:lla. 8,7 mmol BHET:tä reagoi 8,4 mmol KOH:n kanssa 18 ml:ssa MgSO4-kuivattua etyleeniglykolia 110-130 °C:ssa 2,5 tunnin ajan. 30 millilitraa H2O:ta lisättiin ja seos uutettiin kolme kertaa 5 ml:lla CHCl3:a. Vesifaasi säädettiin pH-arvoon 3 25-prosenttisella HCl:llä ja suodatettiin 4 °C:ssa. Kahden uuttovaiheen jälkeen 30 ml:lla kuumaa H2O:ta ja 4 °C:ssa tapahtuneen suodatuksen jälkeen sakka kuivattiin 60 °C:ssa (0,56 g (30 %), Mp 185-190 °C).

Monohydroksietyylitereftaliinihappoamidi (MHETA): MHETA syntetisoitiin syntetisoimalla tereftalyylikloridin osittainen amidointi etanoliamiinin kanssa. 150 mmol NaOH:ta ja 50 mmol etanoliamiinia 50 ml:ssa H2O:ta lisättiin pisaroittain 1 tunnin kuluessa 50 mmol tereftalyylikloridiin 50 ml:ssa H2O:ta 0 °C:ssa. Reaktiota jatkettiin vielä 2 tuntia 0 °C:ssa ja 2 tuntia takaisinvirtauksessa, minkä jälkeen reaktio suodatettiin kuumana. pH säädettiin 3:een 25 %:n HCl:llä. Saatu suspensio suodatettiin kylmänä ja suodos pestiin 20 ml:lla kylmää vettä. Tuote kiteytettiin uudelleen 100 ml:sta kuumaa H2O:ta, jolloin saatiin kiiltäviä kiteitä (2,4 g (23 %), Mp 209-212 °C).

Mono-4-nitrofenyylitereftalaatti (MpNPT): MpNPT syntetisoitiin esteröimällä tereftalaattikloridi 4-nitrofenolaatin kanssa. 50 mmol tereftaloyylikloridia ja 50 mmol natrium-4-nitrofenolaattia suspendoitiin 50 ml:aan dietyleetteriä ja reagoitiin 2 tunnin ajan 0 °C:ssa ja sitten RT:ssä yön yli. Lisättiin 2,5 g Na2CO3:a ja 4,5 g NaHCO3:a 50 ml:aan H2O:ta ja reagoitiin RT:ssä 10 h. pH säädettiin 8,5:een NaOH:lla. Liukenematon fraktio uutettiin edelleen yhteensä 2,5 g:lla Na2CO3:a ja 2,5 g:lla NaHCO3:a 100 ml:ssa H2O:ta ja pestiin, kunnes pH oli neutraali. MpNPT saostettiin HCl:llä pH:n ollessa 3 ja pestiin kahdesti 50 ml:lla 0,1 M HCl:ää, kunnes pH oli neutraali. MpNPT erotettiin kontaminoivasta bis-4-nitrofenyylitereftalaatista uuttamalla 100 mM NaPi:llä pH 7,4 ja happosaostamalla. Hyvin haalean keltainen liete kuivattiin 60 °C:ssa (Mp 202 °C).

Puhdistus sekä kiteytys ja rakenneliuos

I. sakaiensis PETaasi (aminohappojäämät 28-290) tilattiin Genscriptiltä (Piscataway, USA) koodonioptimoituna synteettisenä geeninä, joka sisälsi C-terminaalisen His6-tagin ja joka oli subklonoitu pET-21b:hen. Genscriptiltä tilattiin pUC19-vektoriin kloonattu koodonioptimoitu DNA-fragmentti, joka koodaa I. sakaiensis MHETaasia (aminohappojäämät 20-603), ja se subkloonattiin myöhemmin pColdII-ekspressioplasmidiin, jossa on N-terminaalinen His6-tag (TAKARA BIO, Inc, Otsu, Shiga, Japani) FastCloning-menetelmällä (Täydentävä kuva 11)30.

Proteiinin ilmentämistä varten E. coli Shuffle T7 -ekspressiosolut (New England Biolabs, Frankfurt, Saksa) transformoitiin plasmideilla ja valittiin lysogeeniliemeen (LB) agarlevyille, jotka sisälsivät 100 µgmL-1 ampisilliiniä. Yön yli 30 °C:ssa tapahtuneen kasvattamisen jälkeen yön yli -viljelmät inokuloitiin. Yliekspressiota varten käytettiin 1 L:n läpiviennitettyjä Erlenmeyer-pulloja, jotka sisälsivät 200 ml LB-alustaa, jota täydennettiin 100 µg ml-1 ampisilliinilla. Soluja kasvatettiin 33 °C:ssa ja 160 rpm:n ravistusnopeudella, kunnes optinen tiheys 600 nm:ssä (OD600) oli 1 ennen kuin lisättiin 1 mM isopropyyli β-d-1-tiogalaktopyranosidia (IPTG). Kun OD600 oli 2,5, lämpötila laskettiin 16 °C:een ja yliekspressiota jatkettiin yön yli. Solut kerättiin sentrifugoimalla 4 °C:ssa 10 000 × g:ssa 20 minuutin ajan ja säilytettiin -20 °C:ssa myöhempään käyttöön asti.

Solut hajotettiin sonikoimalla 50 mM TRIS-HCl:ssä, pH 7,5, 150 mM NaCl:ssä, 10 mM imidatsolissa ja 1 mM ditiotiotreitolissa (DTT) (puskuri R). Solujätteet puhdistettiin sentrifugoimalla. Soluuute ladattiin Ni-NTA-sefaroosia sisältävään gravitaatiovirtauskolonniin, pestiin puskurilla R, jota oli täydennetty 20 mM imidatsolilla, ja eluoitiin puskurilla R, jota oli täydennetty 200 mM imidatsolilla (300 mM imidatsolia PETaasin tapauksessa). Proteiinifraktiot puhdistettiin Superdex75 10/300 -kolonnilla (GE Healthcare, Solingen, Saksa), jossa oli 20 mM TRIS pH 7,5, 150 mM NaCl, konsentroitiin ~10 mg ml-1:ksi, pikajäädytettiin nestemäisessä N2:ssa ja säilytettiin -80 °C:ssa. Proteiinipitoisuudet määritettiin spektrofotometrisesti käyttäen ε280 = 102 955 M-1 cm-1 (ε280 = 97 455 M-1 cm-1 mutantille W397A). Näytteiden puhtaus arvioitiin GelAnalyzer-ohjelmistolla (versio 2010a).

PETaasi kiteytettiin 10 mg mL-1 -pitoisuudessa istumapisaradiffuusiolla (1 µl proteiinia ja 1 µl säiliötä) 20 °C:ssa. Tyypilliset PETaasikiteet kasvoivat 20 °C:ssa säiliöliuoksessa, joka sisälsi 0,1 M natriumsitraattia tai natriumasetaattia pH 5,0, 15 % (v/v) PEG8000 ja 0,5 M litiumsulfaattia. MHETaasi kiteytyi 10 mg ml-1:n konsentraatiossa istumapisarahöyrydiffuusiolla (1 µl proteiinia ja 1 µl säiliötä) 20 °C:ssa säiliössä, joka sisälsi 0,1 M HEPES:ää, pH 7,5, 30 % (v/v) 2,4-MPD:tä ja 0,12 M ammoniumsulfaattia (tilaryhmä P212121) tai 0,1 M MES:ää, pH 6,5, 10 % (v/v) PEG8000:ta ja 0,1 M sinkkiasetaattia (tilaryhmä P1). MPD:llä kasvatetut MHETaasikiteet kryojäädytettiin varastoliuoksessa. PETaasikide kryosuojattiin 0,1 M natriumasetaatilla, pH 5,0, 10 % (v/v) PEG8000, 15 % (v/v) PEG400 ja 0,5 M litiumsulfaatilla. P1 MHETaasikide kryosuojattiin 0,1 M TRIS:llä, pH 8,5, 5 % (v/v) PEG8000:lla, 20 % (v/v) PEG400:lla ja 0,5 M litiumsulfaatilla. Derivointikokeita varten kiteitä inkuboitiin 24 tuntia vastaavassa kryosuojausliuoksessa, joka oli kyllästetty ligandilla, ja ne pakastettiin nestemäisessä typessä. MHETaasin diffraktiotiedot kerättiin 100 K:n lämpötilassa BESSY II -varastorenkaan sädelinjoilla 14.1 ja 14.2 Berliinissä, Saksassa31. PETaasin diffraktiotiedot kerättiin sädelinjalla P13, PETRAIII, Hampuri32. Kaikki diffraktiotiedot käsiteltiin XDS-ohjelmalla33,34.

PETaasin rakenne ratkaistiin molekyylikorvaamalla käyttäen T. fusca-kutinaasi TfCut2:n rakennekoordinaatteja (PDB-merkintä 4CG111,23). MHETA:n kanssa kompleksoituneen MHETaasin rakenne ratkaistiin molekyylikorvaamalla käyttäen MR-putkilinjaa MoRDa35, joka sijoitti kuusi kopiota homologisesta mallista, joka perustuu PDB-tietueeseen 6G21 (julkaisematon A. oryzae -feruloyyliesteraasi, AoFaeB-2; 26 %:n identiteetti MHETaasin kanssa ja 87 %:n kattavuus kyselyssä). Rakenteita täydennettiin useiden tarkennuskierrosten aikana PHENIX.REFINE- tai Refmac-ohjelmalla, kun kyseessä oli PETaasi35,36 , ja niiden välissä tehtiin manuaalinen mallinrakennus COOT-ohjelmalla, joka oli laaja MHETaasin37 osalta. BA:n kanssa kompleksoituneen MHETaasin rakenne ratkaistiin molekyylikorvaamalla käyttäen hakumallina koko MHETA-yhteisrakenteen epäsymmetristä yksikköä, ja se saatiin valmiiksi. MHETA- ja BA-ligandit sijoitettiin vastaaviin tiheyksiin yksiselitteisesti tarkennuksen loppuvaiheissa. P1-ligandista vapaan MHETaasin rakenne ratkaistiin molekyylikorvaamalla käyttäen lopullisen MHETaasi-MHETA-ko-rakenteen rakennekoordinaatteja, joista ligandi oli jätetty pois. Asymmetrisen yksikön kymmenen MHETaasi-kopiota rakennettiin manuaalisesti tai PHENIX.AUTOBUILD-ohjelmalla ja tarkennettiin PHENIX.REFINE36-ohjelmalla.

MHETaasi-mutanttien luominen paikkaohjatulla mutageneesillä

Yksittäisten mutanttien luomiseen käytettiin joko Q5-paikkaohjatun mutageneesin pakettia (”site-directed mutagenesis kit”) (New England Biolabs) tai QuikChange®-menetelmää. Ensimmäisessä tapauksessa kittiä käytettiin valmistajan ohjeiden mukaisesti. QuikChange®-menetelmässä käytettiin PCR-standardiseosta (25 µl), joka koostui 2,5 µl 10 × Pfu-puskurista (Roboklon GmbH, Berliini, Saksa), 0,5 µl sekoitetuista deoksinukleosiditrifosfaateista (0,25 mM kumpikin), plasmidi-DNA:sta (~40 ng), 1,25 µl eteen- ja taaksepäin suuntautuvasta alukkeesta (10 µm; lisätaulukko 4), 1 µl PfuPlus!-polymeraasista (Roboklon GmbH) ja 18,1 µl erittäin puhdasta vettä. Denaturointia varten lämpötilaa pidettiin 95 °C:ssa 30 sekunnin ajan. Tämän jälkeen tehtiin 20 sykliä, joissa denaturoitiin 30 sekunnin ajan 95 °C:ssa, hehkutettiin 30 sekunnin ajan 63 °C:ssa ja elongoitiin 6 minuutin ajan 72 °C:ssa. Viimeisessä vaiheessa suoritettiin viimeinen elonaatio 72 °C:ssa 10 minuutin ajan. PCR:n jälkeen templaatti-DNA:ta digestoitiin DpnI:llä (New England BioLabs) 2 tunnin ajan 37 °C:ssa ennen kuin entsyymi inaktivoitiin 80 °C:ssa 10 minuutin ajan. E. coli TOP10 -soluja transformoitiin saaduilla PCR-tuotteilla, ja ne istutettiin LB-agarlevyille, jotka sisälsivät 100 µg ml-1 ampisilliiniä, ja niitä kasvatettiin yön yli 37 °C:ssa. Nukleotidisekvenssi vahvistettiin sekvensoimalla Eurofinsissa (Ebersberg, Saksa).

MpNPT:n autohydrolyysi

Hydrolyysiä seurattiin spektrofotometrisesti 400 nm:ssä 30 °C:ssa. Korkeammilla pH-arvoilla, joissa hydrolyysi menee lähes loppuun, sovitettiin eksponentiaalinen hajoaminen. Matalammilla pH-arvoilla hajoamisvakiot laskettiin alkunopeuksista ottaen huomioon 4-nitrofenolin puhtaus ja osittainen deprotonoituminen (odotettu arvo pH-arvolla 7,5 on 12 420 M-1 cm-1 laskettuna, kun ε405 nm = 18 000 M-1 cm-1 ja 4-nitrofenolin pKa = 7,15)38. 4-nitrofenolin absorption ero 400 ja 405 nm:ssä oli alle 0,5 %. Autohydrolyysi mitattiin pH:sta 7,5-12,5 100 mM:n fosfaatti- tai boraattipuskureissa ja NaOH-liuoksissa nopeusvakion ollessa k2 = 9,2 M-1 s-1, kun d/dT = k2 eli k1 = 2,9 × 10-6 s-1 (lisäkuva 12). 100 mM TRIS pH 7,5:ssä, jota käytettiin myös entsyymin kinetiikassa, määritettiin k1 = 46 × 10-6 s-1, kun d/dT = k1. TRIS lisää siis hydrolyysinopeutta ~10-kertaiseksi verrattuna odotettuun reaktionopeuteen hydroksidin kanssa pH 7,5:ssä.

Aktiivisuustestit

Aktiivisuus mitattiin substraattien MHET ja BHET osalta HPLC:llä ja MpNPT:n osalta spektrofotometrialla. HPLC-mittausta varten reaktiot (100 µl) pysäytettiin lisäämällä sama määrä 160 mM NaPi:tä (natriumfosfaattipuskuria) pH 2,5:een, johon oli lisätty 20 % (v/v) dimetyylisulfoksidia (DMSO), ja lämmittämällä 80 °C:een 10 minuutin ajan. TPA, MHET ja BHET erotettiin Kinetex 5 µm EVO C18 100 Å, 150 × 4,6 mm:n Kinetex 5 µm EVO C18 100 Å, 150 × 4,6 mm:n Kinetex-analysaattorilla (Phenomenex, Aschaffenburg, Saksa), jossa käytettiin gradienttia, joka koostui asetonitriilistä ja 0,1-prosenttisesta (v/v) muurahaishaposta vedessä, 30 °C:n lämpötilassa, sen jälkeen, kun oli ensin ruiskutettu 10 µl näytettä. Asetonitriilipitoisuutta nostettiin 5 prosentista 44 prosenttiin minuuttiin 12 asti ja sitten 70 prosenttiin minuutissa 15, jolloin suhde pysyi vakiona 3 minuutin ajan. TPA, MHET ja BHET detektoitiin 240 nm:ssä ja kvantifiointi toteutettiin kalibrointikäyrien avulla.

MHET:n ja BHET:n liikevaihtonopeuksien kvantifioimiseksi reaktioita (100 µl), joissa oli 1 mM substraattia 40 mM NaPi:ssä pH 7,5:ssä 40 mM NaPi:ssä, jossa oli 80 mM NaCl:tä ja 20 %:n (v/v) DMSO:ta, inkuboitiin 30 °C:n lämpötiloissa, minkä jälkeen reaktiot pysäytettiin ja ne analysoitiin edellä kuvatulla tavalla. MHETaasia käytettiin 6 nM:n pitoisuutena 30 minuutin ajan MHET:n tapauksessa. BHET:n osalta käytettiin esiseulontaa 6 nM:n tai 12 nM:n MHETaasi-muunnoksilla potentiaalisesti aktiivisten entsyymien tunnistamiseksi, jotka analysoitiin sen jälkeen korkeammilla pitoisuuksilla. Noin 100 nM variantteja käytettiin 19,25 tunnin ajan, ja näihin reaktioihin lisättiin 3 nM villityyppistä MHETaasia, jotta muodostunut MHET muuntuisi kokonaan TPA:ksi, joka kvantifioitiin HPLC:llä. Koe toistettiin kolme kertaa.

MpNPT:n kantaliuokset valmistettiin DMSO:ssa pitoisuuksina 10, 1 ja 0,1 mM. Substraattipitoisuudet olivat 0,1-1200 µM 100 mM TRIS pH 7,5:ssä tai 100 mM NaPi pH 7,5:ssä. Kineettiset parametrit ovat samat molemmissa puskureissa. Reaktio 400 µl:n kyvetissä aloitettiin 25 °C:ssa lisäämällä entsyymiä loppupitoisuuteen, joka oli noin 1 nM (aktiiviset muunnokset) tai 500 nM (inaktiiviset muunnokset). Absorptiomuutosta seurattiin Cary50-spektrofotometrillä (Varian) 400 nm:ssä. Absorptiomuutokset korjattiin ei-entsymaattisen hydrolyysin osalta (ks. edellinen kohta). Alkuperäisiä nopeuksia (keskimäärin kymmenen eri entsyymi- ja substraattikonsentraatioiden yhdistelmää kullekin muunnokselle) käytettiin Km:n ja vmax:n sovittamiseen Michaelis-Menten-kinetiikan mukaisesti. Kilpailevien inhibiittorien KI mitattiin 30 °C:ssa, ja ne on laskettu yhtälön (1)