Reactivos

El PET se obtuvo de botellas comerciales. Todos los demás productos químicos se adquirieron con la máxima pureza en Sigma-Aldrich, Carl Roth, Alfa Aesar o Acros, si no se indicaba lo contrario.

Síntesis de ligandos y sustratos

La identidad y pureza de todos los compuestos sintetizados se verificó mediante RMN. Los espectros de 1H se midieron en DMSO-d6 en un Bruker Avance II 300 equipado con un cabezal de sonda PABBO BB-1H/D Z-GRD Z104275/0398 de 5 mm a 25-28 °C (Fig. S7a-f). Para la calibración de las mediciones se utilizó tetrametilsilano.

Tereftalato de hidroxietilo (BHET): El BHET se sintetizó a partir de una botella de PET mediante la alcoholización con etilenglicol. Veinte gramos de PET y 0,2 g de acetato de sodio anhidro se sometieron a reflujo en 120 mL de etilenglicol durante 8 horas y después se enfriaron durante la noche. Se añadieron 120 mL de H2O y se filtró a 4 °C. El producto se lavó con 20 mL de H2O frío y se extrajo varias veces con H2O caliente. El BHET apareció como agujas blancas (18 g (68%), Mp 210-212 °C).

Amida de ácido tereftálico hidroxilado (BHETA): El BHETA se sintetizó a partir del PET por aminólisis con 2-aminoetanol. Veinte gramos de PET y 0,2 g de acetato de sodio anhidro se sometieron a reflujo en 120 mL de etanolamina durante 8 horas y después se enfriaron durante la noche. Se añadieron 120 mL de H2O y se filtró a 4 °C. El producto se lavó con 20 mL de H2O frío y se recristalizó dos veces con 100 mL de H2O caliente. El BHETA apareció como agujas ligeramente rosadas (20 g (76%), Mp 240-243 °C).

Tereftalato de dimetilo (DMT): El DMT se sintetizó por esterificación del cloruro de tereftaloilo con metanol. Se hicieron reaccionar 25 mmol de cloruro de tereftaloilo con 30 mL de metanol a RT y se sometieron a reflujo durante 3 h. Tras destilar el metanol y secar a 60 °C, se obtuvieron 4,08 g (Mp 144-148 °C). El lavado con 0,5 M KOH y agua no cambió el punto de fusión.

Monohidroxietil tereftalato (MHET): El MHET se sintetizó a partir del BHET por hidrólisis parcial con KOH. Se hicieron reaccionar 8,7 mmol de BHET con 8,4 mmol de KOH en 18 mL de etilenglicol desecado con MgSO4 a 110-130 °C durante 2,5 h. Se añadieron 30 mililitros de H2O y la mezcla se extrajo tres veces con 5 mL de CHCl3. La fase acuosa se ajustó a pH 3 con HCl al 25% y se filtró a 4 °C. Después de dos pasos de extracción con 30 mL de H2O caliente y filtración a 4 °C, el precipitado se secó a 60 °C (0,56 g (30%), Mp 185-190 °C).

Monohidroxietil amida de ácido tereftálico (MHETA): El MHETA se sintetizó por amidación parcial del cloruro de tereftaloilo con etanolamina. Se añadieron gota a gota 150 mmol de NaOH y 50 mmol de etanolamina en 50 mL de H2O a 50 mmol de cloruro de tereftaloilo en 50 mL de H2O a 0 °C. La reacción se realizó durante otras 2 h a 0 °C y 2 h a reflujo, seguidas de filtración en caliente. El pH se ajustó a 3 con HCl al 25%. La suspensión obtenida se filtró en frío y el filtrado se lavó con 20 mL de agua fría. El producto se recristalizó de 100 mL de H2O caliente para dar cristales brillantes (2,4 g (23%), Mp 209-212 °C).

Mono-4-nitrofenil tereftalato (MpNPT): El MpNPT se sintetizó por esterificación del cloruro de tereftaloilo con el 4-nitrofenolato. Se suspendieron 50 mmol de cloruro de tereftaloilo y 50 mmol de 4-nitrofenolato de sodio en 50 mL de dietiléter y se hizo reaccionar durante 2 h a 0 °C, luego a RT durante la noche. Se añadieron 2,5 g de Na2CO3 y 4,5 g de NaHCO3 en 50 mL de H2O y se hizo reaccionar a RT durante 10 h. El pH se ajustó a 8,5 con NaOH. La fracción insoluble se extrajo de nuevo con un total de 2,5 g de Na2CO3 y 2,5 g de NaHCO3 en 100 mL de H2O y se lavó hasta alcanzar un pH neutro. El MpNPT se precipitó con HCl a pH 3 y se lavó dos veces con 50 mL de HCl 0,1 M y luego hasta un pH neutro. El MpNPT se separó del tereftalato de bis-4-nitrofenilo contaminante mediante extracción con NaPi 100 mM a pH 7,4 y precipitación ácida. El lodo amarillo muy tenue se secó a 60 °C (Mp 202 °C).

La purificación, así como la cristalización y la solución de la estructura

La PETasa de I. sakaiensis (residuos de aminoácidos 28-290) se pidió a Genscript (Piscataway, EE.UU.) como un gen sintético optimizado por codón que contenía una etiqueta His6 C-terminal subclonada en pET-21b. Se pidió a Genscript un fragmento de ADN optimizado por codones que codifica la MHETasa de I. sakaiensis (residuos de aminoácidos 20-603) clonado en un vector pUC19 y posteriormente subclonado en un plásmido de expresión pColdII con una etiqueta His6 N-terminal (TAKARA BIO, Inc, Otsu, Shiga, Japón) mediante FastCloning (Figura suplementaria 11)30.

Para la expresión de la proteína, se transformaron células E. coli Shuffle T7 express (New England Biolabs, Frankfurt, Alemania) con los plásmidos y se seleccionaron en placas de agar caldo de lisogenia (LB) con 100 µgmL-1 de ampicilina. Tras crecer toda la noche a 30 °C, se inocularon los cultivos nocturnos. Para la sobreexpresión, se utilizaron matraces Erlenmeyer de 1 L con 200 mL de medio LB suplementado con 100 µg mL-1 de ampicilina. Las células se cultivaron a 33 °C y a una velocidad de agitación de 160 rpm hasta alcanzar una densidad óptica a 600 nm (OD600) de 1 antes de añadir 1 mM de isopropil β-d-1-tiogalactopiranósido (IPTG). A una DO600 de 2,5, se bajó la temperatura a 16 °C y se continuó la sobreexpresión durante la noche. Las células se cosecharon por centrifugación a 4 °C, 10.000 × g durante 20 minutos y se almacenaron a -20 °C hasta su uso posterior.

Las células se disolvieron por sonicación en 50 mM TRIS-HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl, 10 mM imidazol y 1 mM Ditiotreitol (DTT) (tampón R). Los restos celulares se eliminaron por centrifugación. El extracto celular se cargó en una columna de flujo por gravedad con sefarosa Ni-NTA, se lavó con tampón R complementado con 20 mM de imidazol y se eluyó con tampón R complementado con 200 mM de imidazol (300 mM de imidazol en el caso de la PETasa). Las fracciones de proteínas se purificaron en una columna Superdex75 10/300 (GE Healthcare, Solingen, Alemania) con 20 mM TRIS pH 7,5, 150 mM NaCl, se concentraron a ~10 mg mL-1, se congelaron en N2 líquido y se almacenaron a -80 °C. Las concentraciones de proteínas se determinaron espectrofotométricamente utilizando ε280 = 102 955 M-1 cm-1 (ε280 = 97.455 M-1 cm-1 para el mutante W397A). La pureza de las muestras se estimó empleando el software GelAnalyzer (Versión 2010a).

La PETasa se cristalizó a una concentración de 10 mg mL-1 mediante difusión de vapor en gota sentada (1 µL de proteína más 1 µL de depósito) a 20 °C. Los cristales típicos de PETasa crecieron a 20 °C con una solución de depósito que contenía citrato de sodio o acetato de sodio 0,1 M, pH 5,0, 15% (v/v) de PEG8000 y sulfato de litio 0,5 M. La MHETasa cristalizó a una concentración de 10 mg mL-1 por difusión de vapor de gota sentada (1 µL de proteína más 1 µL de depósito) a 20 °C con un depósito que contenía HEPES 0,1 M, pH 7,5, 30% (v/v) de 2,4-MPD y sulfato de amonio 0,12 M (grupo espacial P212121) o MES 0,1 M, pH 6,5, 10% (v/v) de PEG8000 y acetato de zinc 0,1 M (grupo espacial P1). Los cristales de MHETasa cultivados con MPD se criogenizaron en su solución de reserva. El cristal de PETasa se crioprotegió con acetato de sodio 0,1 M, pH 5,0, 10% (v/v) de PEG8000, 15% (v/v) de PEG400 y 0,5 M de sulfato de litio. El cristal de MHETasa P1 se crioprotegió con TRIS 0,1 M, pH 8,5, 5% (v/v) de PEG8000, 20% (v/v) de PEG400 y 0,5 M de sulfato de litio. Para los experimentos de derivatización, los cristales se incubaron durante 24 horas en la respectiva solución crioprotectora saturada con el ligando y se congelaron en nitrógeno líquido. Los datos de difracción de la MHETasa se recogieron a 100 K en las líneas de luz 14.1 y 14.2 del anillo de almacenamiento BESSY II, Berlín, Alemania31. Los datos de difracción de la PETasa se recogieron en la línea de luz P13, PETRAIII, Hamburgo32. Todos los datos de difracción se procesaron con XDS33,34.

La estructura de la PETasa se resolvió mediante sustitución molecular empleando las coordenadas estructurales de la cutinasa TfCut2 de T. fusca (entrada PDB 4CG111,23). La estructura de la MHETasa complejada con MHETA se resolvió por sustitución molecular empleando el pipeline de RM MoRDa35, que colocó seis copias de un modelo de homología basado en la entrada 6G21 de PDB (una feruloil esterasa inédita de A. oryzae, AoFaeB-2; 26% de identidad con la MHETasa con una cobertura de consulta del 87%). Las estructuras se complementaron durante varias rondas de refinamiento con PHENIX.REFINE o Refmac en el caso de la PETasa35,36 intercalando la construcción manual del modelo con COOT, que fue extensa para la MHETasa37. La estructura de la MHETasa complejada con BA se resolvió mediante sustitución molecular empleando toda la unidad asimétrica de la coestructura del MHETA como modelo de búsqueda y se completó, respectivamente. Los ligandos MHETA y BA se colocaron en las respectivas densidades de forma inequívoca en las etapas finales del refinamiento. La estructura de la MHETasa sin ligando P1 se resolvió por sustitución molecular empleando las coordenadas de la estructura de una coestructura MHETasa-MHETA finalizada omitiendo el ligando. Las diez copias de la MHETasa en la unidad asimétrica se construyeron manualmente o mediante PHENIX.AUTOBUILD y se refinaron con PHENIX.REFINE36.

Generación de mutantes de la MHETasa mediante mutagénesis dirigida al sitio

Para la creación de mutantes de un solo sitio, se utilizó el kit de mutagénesis dirigida al sitio Q5 (New England Biolabs) o el método QuikChange®. En el primer caso, el kit se utilizó según las instrucciones del fabricante. En el caso del método QuikChange®, se utilizó una mezcla de PCR estándar (25 µl) compuesta por 2,5 µl de tampón Pfu 10× (Roboklon GmbH, Berlín, Alemania), 0,5 µl de desoxinucleósidos trifosfatos mezclados (0,25 mM cada uno), ADN plasmídico (~40 ng), 1,25 µl de cebadores directos e inversos (10 µM; Tabla Suplementaria 4), 1 µl de PfuPlus! polimerasa (Roboklon GmbH) y 18,1 µl de agua ultrapura. Para la desnaturalización se mantuvo la temperatura a 95 °C durante 30 s. Después se realizaron 20 ciclos de desnaturalización de 30 s a 95 °C, recocido durante 30 s a 63 °C y elongación durante 6 min a 72 °C. En un último paso se realizó la elongación final a 72 °C durante 10 min. Tras la PCR, el ADN molde se digirió con DpnI (New England BioLabs) durante 2 h a 37 °C antes de inactivar la enzima a 80 °C durante 10 min. Las células E. coli TOP10 se transformaron con los productos de PCR obtenidos y se sembraron en placas de agar LB con 100 µg mL-1 de ampicilina y se cultivaron durante la noche a 37 °C. La secuencia de nucleótidos se confirmó mediante secuenciación en Eurofins (Ebersberg, Alemania).

Autohidrólisis de MpNPT

La hidrólisis se siguió espectrofotométricamente a 400 nm a 30 °C. A valores de pH más altos, en los que la hidrólisis llega casi a su fin, se ajustó un decaimiento exponencial. A valores de pH más bajos, las constantes de decaimiento se calcularon a partir de las tasas iniciales teniendo en cuenta la pureza y la desprotonación parcial del 4-nitrofenol (el valor esperado a pH 7,5 es de 12.420 M-1 cm-1 calculado con ε405 nm = 18.000 M-1 cm-1 y pKa = 7,15 para el 4-nitrofenol)38. La diferencia de absorción del 4-nitrofenol a 400 y 405 nm fue inferior al 0,5%. La autohidrólisis se midió de pH 7,5 a 12,5 en tampones de fosfato o borato 100 mM y soluciones de NaOH con una constante de velocidad de k2 = 9,2 M-1 s-1 para d/dT = k2 , es decir, k1 = 2,9 × 10-6 s-1 (Figura suplementaria 12). En 100 mM de TRIS pH 7,5, también utilizado para la cinética enzimática, se determinó k1 = 46 × 10-6 s-1 para d/dT = k1. Por tanto, el TRIS aumenta la velocidad de hidrólisis ~10 veces en comparación con la velocidad de reacción esperada con hidróxido a pH 7,5.

Pruebas de actividad

Se midió la actividad para los sustratos MHET y BHET por HPLC y para MpNPT por espectrofotometría. Para la medición por HPLC, las reacciones (100 µL) se detuvieron mediante la adición de un volumen igual de NaPi (tampón fosfato sódico) 160 mM, pH 2,5, con 20% (v/v) de dimetilsulfóxido (DMSO) y el calentamiento a 80 °C durante 10 min. El TPA, el MHET y el BHET se separaron en un Kinetex 5 µm EVO C18 100 Å, 150 × 4,6 mm (Phenomenex, Aschaffenburg, Alemania) con un gradiente de acetonitrilo y ácido fórmico al 0,1% (v/v) en agua a 30 °C tras la inyección de 10 µl de muestra. El acetonitrilo se incrementó del 5 al 44% hasta el minuto 12 y luego al 70% en el minuto 15, donde la proporción se mantuvo constante durante 3 minutos. El TPA, la MHET y la BHET se detectaron a 240 nm y la cuantificación se realizó mediante el uso de curvas de calibración.

Para cuantificar las tasas de recambio de la MHET y la BHET, las reacciones (100 µL) con 1 mM del sustrato en 40 mM de NaPi pH 7,5 con 80 mM de NaCl y 20% (v/v) de DMSO se incubaron a 30 °C antes de que se detuvieran y analizaran como se ha descrito anteriormente. La MHETasa se utilizó a 6 nM durante 30 minutos en el caso de la MHET. En el caso de la BHET, se utilizó una preselección con variantes de la MHETasa de 6 nM o 12 nM para identificar enzimas potencialmente activas que se analizaron posteriormente a concentraciones más altas. Se utilizaron alrededor de 100 nM de las variantes durante 19,25 h y se añadieron 3 nM de MHETasa de tipo salvaje a estas reacciones para la conversión completa del MHET formado en TPA que se cuantificó mediante HPLC. El experimento se repitió tres veces.

Se prepararon soluciones madre de MpNPT en DMSO a concentraciones de 10, 1 y 0,1 mM. Las concentraciones de sustrato fueron de 0,1-1200 µM en 100 mM TRIS pH 7,5 o 100 mM NaPi pH 7,5. Los parámetros cinéticos son los mismos en ambos tampones. La reacción en la cubeta de 400 µL se inició a 25 °C mediante la adición de la enzima a una concentración final de aproximadamente 1 nM (variantes activas) hasta 500 nM (variantes inactivas). El cambio de absorción se siguió en un espectrofotómetro Cary50 (Varian) a 400 nm. Los cambios de absorción se corrigieron para tener en cuenta la hidrólisis no enzimática (véase el párrafo anterior). Las tasas iniciales (una media de diez combinaciones diferentes de concentraciones de enzima y sustrato para cada variante) se utilizaron para ajustar Km y vmax según la cinética de Michaelis Menten. Los KI para los inhibidores competitivos se midieron a 30 °C y se calculan con la Ec. (1)

utilizando 4-8 concentraciones diferentes de sustrato (es decir, MpNPT). También se midieron el tipo salvaje y las variantes S225A, 488A, W397A, F495A, F415A, S416A y R411Q a 30 °C. Estos parámetros cinéticos se normalizaron con respecto a las actividades de tipo salvaje a 25 °C.

Para medir la actividad de la feruloil y la clorogenato esterasa se probaron cuatro sustratos: éster metílico del ácido cumárico (Coum-ME), éster metílico del ácido cafeico (Caff-ME), ácido clorogénico (Chlorogen) y éster metílico del ácido p-hidroxi-benzoico (pHB-ME). Se midieron los espectros UV-Vis utilizando 10 μM del éster y del ácido libre y se calculó el Δε (Fig. 10 suplementaria). La hidrólisis se midió como para el MpNPT, pero con 10-35 nM de enzima, 100 µM de sustrato y a 335 nm (Coum-ME, Δε = -6100 M-1 cm-1), 350 nm (Caff-ME, Δε = -5700 M-1 cm-1), 350 nm (Chlorogen, Δε = -7400 M-1 cm-1) y 280 nm (pHB-ME, Δε = -3900 M-1 cm-1).

Fluorimetría de barrido diferencial

Para el análisis de la unión del ligando a la MHETasa, se utilizó la DSF. Los experimentos se realizaron con un Prometheus NT.48 (NanoTemper, Munich, Alemania). El dispositivo tiene una longitud de onda de excitación fija de 285 nm y longitudes de onda de emisión de 330 y 350 nm. La MHETasa (en peso) se utilizó siempre a 100 µgmL-1 en la solución final. Las concentraciones finales del tampón fueron 100 mM TRIS pH 7,5, 150 mM NaCl con o sin 20% de DMSO. Se utilizaron capilares de alta sensibilidad proporcionados por NanoTemper. El rango de temperatura de 20 a ≥80 °C se exploró a 0,5 K por minuto. Los ligandos se prepararon en soluciones madre de 21,7 mM y se diluyeron hasta una concentración final de 10 mM. La solución saturada (con 0 o 42,5% de DMSO) se utilizó como stock, si los compuestos no se disolvían completamente. En el caso de los compuestos que dificultan las mediciones fiables por absorción (4-nitrofenol, 4-nitrotiofenol, ácido 2-hidroxibenzoico) o por fluorescencia (BHET) también se probaron concentraciones finales de 1 mM. Los valores de Tm se indican tal como los proporciona el software Prometheus (máximo de la pendiente para la relación I330 nm/I350 nm). El experimento se realizó como una única medida.

Alineación de secuencias y árbol filogenético

Las búsquedas de homología de proteínas similares a la MHETasa se realizaron con la herramienta de búsqueda de alineación local básica del NCBI (BLAST) en la base de datos ESTHER (http://bioweb.ensam.inra.fr/ESTHER/general?what=blast) utilizando la base de datos Block_X.pep22,39. La alineación de secuencias múltiples se realizó mediante Muscle alignment utilizando MEGA740. La historia evolutiva se infirió utilizando el método de Máxima Verosimilitud basado en el modelo basado en la matriz JTT41. Se muestra el árbol con la mayor probabilidad logarítmica (-19.562,87). El (los) árbol(es) inicial(es) para la búsqueda heurística se obtuvo(n) automáticamente aplicando los algoritmos Neighbor-Join y BioNJ a una matriz de distancias entre pares estimada mediante un modelo JTT, y seleccionando después la topología con un valor de probabilidad logarítmica superior. El análisis incluyó 32 secuencias de aminoácidos. Se eliminaron todas las posiciones que contenían huecos y datos perdidos. El conjunto de datos final contaba con un total de 376 posiciones. Los análisis evolutivos se realizaron en MEGA740.