Reagents
PET wurde aus handelsüblichen Flaschen gewonnen. Alle anderen Chemikalien wurden in höchster Reinheit von Sigma-Aldrich, Carl Roth, Alfa Aesar oder Acros bezogen, sofern nicht anders angegeben.
Synthese von Liganden und Substraten
Die Identität und Reinheit aller synthetisierten Verbindungen wurde mittels NMR überprüft. 1H-Spektren wurden in DMSO-d6 auf einem Bruker Avance II 300 mit einem 5 mm PABBO BB-1H/D Z-GRD Z104275/0398 Sondenkopf bei 25-28 °C gemessen (Abb. S7a-f). Für die Kalibrierung der Messungen wurde Tetramethylsilan verwendet.
Bishydroxyethylterephthalat (BHET): BHET wurde aus einer PET-Flasche durch Alkoholyse mit Ethylenglykol synthetisiert. Zwanzig Gramm PET und 0,2 g wasserfreies Natriumacetat wurden 8 Stunden lang in 120 mL Ethylenglykol refluxiert und anschließend über Nacht abgekühlt. Es wurden 120 mL H2O hinzugefügt und bei 4 °C filtriert. Das Produkt wurde mit 20 mL kaltem H2O gewaschen und mehrmals mit heißem H2O extrahiert. BHET erschien als weiße Nadeln (18 g (68 %), Mp 210-212 °C).
Bishydroxyethylterephthalsäureamid (BHETA): BHETA wurde aus PET durch Aminolyse mit 2-Aminoethanol synthetisiert. Zwanzig Gramm PET und 0,2 g wasserfreies Natriumacetat wurden 8 Stunden lang in 120 mL Ethanolamin refluxiert und anschließend über Nacht abgekühlt. Es wurden 120 mL H2O hinzugefügt und bei 4 °C filtriert. Das Produkt wurde mit 20 mL kaltem H2O gewaschen und zweimal mit 100 mL heißem H2O umkristallisiert. BHETA erschien als leicht rosa Nadeln (20 g (76 %), Mp 240-243 °C).
Dimethylterephthalat (DMT): DMT wurde durch Veresterung von Terephthaloylchlorid mit Methanol synthetisiert. 25 mmol Terephthaloylchlorid wurden mit 30 mL Methanol bei RT umgesetzt und anschließend 3 h refluxiert. Nach Abdestillieren des Methanols und Trocknen bei 60 °C wurden 4,08 g erhalten (Mp 144-148 °C). Das Waschen mit 0,5 M KOH und Wasser änderte den Schmelzpunkt nicht.
Monohydroxyethylterephthalat (MHET): MHET wurde aus BHET durch partielle Hydrolyse mit KOH synthetisiert. 8,7 mmol BHET wurden mit 8,4 mmol KOH in 18 mL MgSO4-getrocknetem Ethylenglykol bei 110-130 °C für 2,5 h umgesetzt. 30 Milliliter H2O wurden zugegeben und die Mischung dreimal mit 5 mL CHCl3 extrahiert. Die wässrige Phase wurde mit 25 % HCl auf pH 3 eingestellt und bei 4 °C filtriert. Nach zwei Extraktionsschritten mit 30 mL heißem H2O und Filtration bei 4 °C wurde der Niederschlag bei 60 °C getrocknet (0,56 g (30%), Mp 185-190 °C).
Monohydroxyethylterephthalsäureamid (MHETA): MHETA wurde durch partielle Amidierung von Terephthaloylchlorid mit Ethanolamin synthetisiert. 150 mmol NaOH und 50 mmol Ethanolamin in 50 mL H2O wurden innerhalb von 1 h tropfenweise zu 50 mmol Terephthaloylchlorid in 50 mL H2O bei 0 °C zugegeben. Die Reaktion wurde für weitere 2 h bei 0 °C und 2 h unter Rückfluss durchgeführt und anschließend heiß filtriert. Der pH-Wert wurde mit 25 % HCl auf 3 eingestellt. Die erhaltene Suspension wurde kalt filtriert und das Filtrat mit 20 mL kaltem Wasser gewaschen. Das Produkt wurde aus 100 mL heißem H2O umkristallisiert und ergab glänzende Kristalle (2,4 g (23%), Mp 209-212 °C).
Mono-4-nitrophenylterephthalat (MpNPT): MpNPT wurde durch Veresterung von Terephthaloylchlorid mit 4-Nitrophenolat synthetisiert. 50 mmol Terephthaloylchlorid und 50 mmol Natrium-4-nitrophenolat wurden in 50 mL Diethylether suspendiert und 2 h lang bei 0 °C und dann über Nacht bei RT umgesetzt. 2,5 g Na2CO3 und 4,5 g NaHCO3 in 50 mL H2O wurden zugegeben und bei RT 10 h lang umgesetzt. Der pH-Wert wurde mit NaOH auf 8,5 eingestellt. Die unlösliche Fraktion wurde mit insgesamt 2,5 g Na2CO3 und 2,5 g NaHCO3 in 100 mL H2O extrahiert und anschließend bis zu einem neutralen pH-Wert gewaschen. MpNPT wurde mit HCl bei pH 3 ausgefällt und zweimal mit 50 mL 0,1 M HCl gewaschen, bis ein neutraler pH-Wert erreicht war. MpNPT wurde durch Extraktion mit 100 mM NaPi pH 7,4 und Säurefällung von kontaminierendem Bis-4-nitrophenylterephthalat getrennt. Die sehr schwach gelbe Aufschlämmung wurde bei 60 °C getrocknet (Mp 202 °C).
Die Reinigung sowie die Kristallisation und Strukturlösung
I. sakaiensis PETase (Aminosäurereste 28-290) wurde bei Genscript (Piscataway, USA) als kodon-optimiertes synthetisches Gen mit einem C-terminalen His6-Tag in pET-21b subkloniert. Ein kodon-optimiertes DNA-Fragment, das für I. sakaiensis MHETase (Aminosäurereste 20-603) kodiert, wurde bei Genscript in einen pUC19-Vektor kloniert und später in ein pColdII-Expressionsplasmid mit einem N-terminalen His6-Tag subkloniert (TAKARA BIO, Inc., Otsu, Shiga, Japan) durch FastCloning (ergänzende Abbildung 11)30.
Für die Proteinexpression wurden E. coli Shuffle T7-Expressionszellen (New England Biolabs, Frankfurt, Deutschland) mit den Plasmiden transformiert und auf Agarplatten mit Lysogenbouillon (LB) und 100 µgmL-1 Ampicillin selektiert. Nach dem Wachstum über Nacht bei 30 °C wurden die Kulturen über Nacht inokuliert. Für die Überexpression wurden 1-Liter-Erlenmeyerkolben mit 200 ml LB-Medium, ergänzt mit 100 µg mL-1 Ampicillin, verwendet. Die Zellen wurden bei 33 °C und 160 U/min Schüttelgeschwindigkeit bis zu einer optischen Dichte bei 600 nm (OD600) von 1 gezüchtet, bevor 1 mM Isopropyl-β-d-1-thiogalactopyranosid (IPTG) zugegeben wurde. Bei einer OD600 von 2,5 wurde die Temperatur auf 16 °C gesenkt und die Überexpression über Nacht fortgesetzt. Die Zellen wurden durch Zentrifugation bei 4 °C, 10.000 × g für 20 Minuten geerntet und bis zur weiteren Verwendung bei -20 °C gelagert.
Die Zellen wurden durch Beschallung in 50 mM TRIS-HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl, 10 mM Imidazol und 1 mM Dithiothreitol (DTT) (Puffer R) aufgeschlossen. Die Zelltrümmer wurden durch Zentrifugation entfernt. Der Zellextrakt wurde auf eine Schwerkraftflusssäule mit Ni-NTA-Sepharose geladen, mit Puffer R, ergänzt mit 20 mM Imidazol, gewaschen und mit Puffer R, ergänzt mit 200 mM Imidazol (300 mM Imidazol im Falle von PETase), eluiert. Die Proteinfraktionen wurden auf einer Superdex75 10/300-Säule (GE Healthcare, Solingen, Deutschland) mit 20 mM TRIS pH 7,5, 150 mM NaCl gereinigt, auf ~10 mg mL-1 konzentriert, in flüssigem N2 eingefroren und bei -80 °C gelagert. Die Proteinkonzentrationen wurden spektrophotometrisch mit ε280 = 102 955 M-1 cm-1 (ε280 = 97,455 M-1 cm-1 für die Mutante W397A) bestimmt. Die Reinheit der Proben wurde mit der Software GelAnalyzer (Version 2010a) geschätzt.
PETase wurde bei einer Konzentration von 10 mg mL-1 durch Dampfdiffusion im Sitzen (1 µL Protein plus 1 µL Reservoir) bei 20 °C kristallisiert. Typische PETase-Kristalle wuchsen bei 20 °C mit einer Reservoir-Lösung, die 0,1 M Natriumcitrat oder Natriumacetat pH 5,0, 15% (v/v) PEG8000 und 0,5 M Lithiumsulfat enthielt. MHETase kristallisierte bei einer Konzentration von 10 mg mL-1 durch Dampfdiffusion im Sitzen (1 µL Protein plus 1 µL Reservoir) bei 20 °C mit einem Reservoir, das 0,1 M HEPES, pH 7,5, 30 % (v/v) 2,4-MPD und 0,12 M Ammoniumsulfat (Raumgruppe P212121) oder 0,1 M MES, pH 6,5, 10 % (v/v) PEG8000 und 0,1 M Zinkacetat (Raumgruppe P1) enthält. Die mit MPD gezüchteten MHETase-Kristalle wurden in ihrer Reservoirlösung kryo-gekühlt. Der PETase-Kristall wurde mit 0,1 M Natriumacetat, pH 5,0, 10% (v/v) PEG8000, 15% (v/v) PEG400 und 0,5 M Lithiumsulfat kryo-geschützt. Der P1-MHETase-Kristall wurde mit 0,1 M TRIS, pH 8,5, 5% (v/v) PEG8000, 20% (v/v) PEG400 und 0,5 M Lithiumsulfat kryo-geschützt. Für die Derivatisierungsexperimente wurden die Kristalle 24 Stunden lang in der jeweiligen mit dem Liganden gesättigten Kryo-Schutzlösung inkubiert und anschließend in flüssigem Stickstoff eingefroren. MHETase-Beugungsdaten wurden bei 100 K an den Beamlines 14.1 und 14.2 des BESSY II-Speicherrings, Berlin, Deutschland, gesammelt31. PETase-Beugungsdaten wurden an der Beamline P13, PETRAIII, Hamburg, gesammelt32. Alle Beugungsdaten wurden mit XDS33,34 verarbeitet.
Die Struktur der PETase wurde durch molekulare Substitution unter Verwendung der Strukturkoordinaten der T. fusca Cutinase TfCut2 (PDB-Eintrag 4CG111,23) gelöst. Die Struktur von MHETase im Komplex mit MHETA wurde durch molekularen Ersatz mit Hilfe der MR-Pipeline MoRDa35 gelöst, die sechs Kopien eines Homologiemodells auf der Grundlage des PDB-Eintrags 6G21 (eine unveröffentlichte A. oryzae-Feruloyl-Esterase, AoFaeB-2; 26 % Identität mit MHETase mit einer Abfrageabdeckung von 87 %) platzierte. Die Strukturen wurden in mehreren Verfeinerungsrunden mit PHENIX.REFINE oder Refmac im Fall von PETase35,36 ergänzt, unterbrochen von einer manuellen Modellbildung mit COOT, die für MHETase37 sehr umfangreich war. Die Struktur der mit BA komplexierten MHETase wurde durch molekulare Ersetzung unter Verwendung der gesamten asymmetrischen Einheit der MHETA-Ko-Struktur als Suchmodell gelöst bzw. vervollständigt. Die MHETA- und BA-Liganden wurden in den letzten Phasen der Verfeinerung eindeutig in die jeweiligen Dichten eingeordnet. Die Struktur der ligandenfreien P1-MHETase wurde durch molekulare Ersetzung unter Verwendung von Strukturkoordinaten einer fertiggestellten MHETase-MHETA-Ko-Struktur ohne den Liganden gelöst. Die zehn Kopien der MHETase in der asymmetrischen Einheit wurden manuell oder mit PHENIX.AUTOBUILD erstellt und mit PHENIX.REFINE36 verfeinert.
Generierung von MHETase-Mutanten durch ortsgerichtete Mutagenese
Für die Erzeugung von Mutanten mit nur einer Stelle wurde entweder das Q5-Kit für ortsgerichtete Mutagenese (New England Biolabs) oder die QuikChange®-Methode verwendet. Im ersten Fall wurde das Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers verwendet. Bei der QuikChange®-Methode wurde eine Standard-PCR-Mischung (25 µL) bestehend aus 2,5 µL 10× Pfu-Puffer (Roboklon GmbH, Berlin, Deutschland), 0,5 µL gemischten Desoxynukleosidtriphosphaten (je 0,25 mM), Plasmid-DNA (~40 ng), 1,25 µL Vorwärts- und Rückwärtsprimer (10 µM; ergänzende Tabelle 4), 1 µL PfuPlus!-Polymerase (Roboklon GmbH) und 18,1 µL Reinstwasser verwendet. Zur Denaturierung wurde die Temperatur für 30 s auf 95 °C gehalten. Anschließend wurden 20 Zyklen mit 30 s Denaturierung bei 95 °C, 30 s Annealing bei 63 °C und 6 min Elongation bei 72 °C durchgeführt. In einem letzten Schritt wurde die finale Elongation bei 72 °C für 10 min durchgeführt. Nach der PCR wurde die Template-DNA mit DpnI (New England BioLabs) für 2 h bei 37 °C verdaut, bevor das Enzym für 10 min bei 80 °C inaktiviert wurde. E. coli TOP10-Zellen wurden mit den erhaltenen PCR-Produkten transformiert und auf LB-Agarplatten mit 100 µg mL-1 Ampicillin ausplattiert und über Nacht bei 37 °C gezüchtet. Die Nukleotidsequenz wurde durch Sequenzierung bei Eurofins (Ebersberg, Deutschland) bestätigt.
Autohydrolyse von MpNPT
Die Hydrolyse wurde spektrophotometrisch bei 400 nm und 30 °C verfolgt. Bei höheren pH-Werten, bei denen die Hydrolyse nahezu abgeschlossen ist, wurde ein exponentieller Zerfall ermittelt. Bei niedrigeren pH-Werten wurden die Zerfallskonstanten aus den anfänglichen Raten berechnet, wobei die Reinheit und die partielle Deprotonierung von 4-Nitrophenol berücksichtigt wurden (der erwartete Wert bei pH 7,5 beträgt 12.420 M-1 cm-1, berechnet mit ε405 nm = 18.000 M-1 cm-1 und pKa = 7,15 für 4-Nitrophenol)38. Der Absorptionsunterschied von 4-Nitrophenol bei 400 und 405 nm betrug weniger als 0,5 %. Die Autohydrolyse wurde von pH 7,5 bis 12,5 in 100 mM Phosphat- oder Boratpuffern und NaOH-Lösungen mit einer Geschwindigkeitskonstante von k2 = 9,2 M-1 s-1 für d/dT = k2 , d. h. k1 = 2,9 × 10-6 s-1 gemessen (ergänzende Abbildung 12). In 100 mM TRIS pH 7,5, das ebenfalls für die Enzymkinetik verwendet wurde, wurde k1 = 46 × 10-6 s-1 für d/dT = k1 bestimmt. TRIS erhöht somit die Hydrolyserate um das ~10-fache im Vergleich zur erwarteten Reaktionsrate mit Hydroxid bei pH 7,5.
Aktivitätsuntersuchungen
Die Aktivität wurde für die Substrate MHET und BHET mittels HPLC und für MpNPT mittels Spektrophotometrie gemessen. Für die HPLC-Messung wurden die Reaktionen (100 µL) durch Zugabe eines gleichen Volumens von 160 mM NaPi (Natriumphosphatpuffer) pH 2,5 mit 20% (v/v) Dimethylsulfoxid (DMSO) und Erhitzen auf 80 °C für 10 min gestoppt. TPA, MHET und BHET wurden auf einem Kinetex 5 µm EVO C18 100 Å, 150 × 4,6 mm (Phenomenex, Aschaffenburg, Deutschland) mit einem Gradienten aus Acetonitril und 0,1 % (v/v) Ameisensäure in Wasser bei 30 °C nach Injektion von 10 µL Probe getrennt. Die Acetonitrilkonzentration wurde von 5 auf 44 % bis Minute 12 und dann auf 70 % bis Minute 15 erhöht, wobei das Verhältnis für 3 Minuten konstant blieb. TPA, MHET und BHET wurden bei 240 nm nachgewiesen, und die Quantifizierung erfolgte anhand von Kalibrierungskurven.
Zur Quantifizierung der Umsatzraten von MHET und BHET wurden Reaktionen (100 µL) mit 1 mM des Substrats in 40 mM NaPi pH 7,5 mit 80 mM NaCl und 20% (v/v) DMSO bei 30 °C inkubiert, bevor sie gestoppt und wie oben beschrieben analysiert wurden. Für MHET wurde eine MHETase-Dosis von 6 nM für 30 Minuten verwendet. Für BHET wurde ein Vorscreening mit 6 nM oder 12 nM MHETase-Varianten durchgeführt, um potenziell aktive Enzyme zu identifizieren, die anschließend in höheren Konzentrationen analysiert wurden. Etwa 100 nM der Varianten wurden für 19,25 h verwendet, und 3 nM Wildtyp-MHETase wurde zu diesen Reaktionen hinzugefügt, um die vollständige Umwandlung der gebildeten MHET in TPA zu erreichen, das mittels HPLC quantifiziert wurde. Der Versuch wurde dreimal wiederholt.
MpNPT-Stammlösungen wurden in DMSO in Konzentrationen von 10, 1 und 0,1 mM hergestellt. Die Substratkonzentrationen betrugen 0,1-1200 µM in 100 mM TRIS pH 7,5 oder 100 mM NaPi pH 7,5. Die kinetischen Parameter sind in beiden Puffern gleich. Die Reaktion in der 400 µL-Küvette wurde bei 25 °C durch Zugabe des Enzyms in einer Endkonzentration von ca. 1 nM (aktive Varianten) bis 500 nM (inaktive Varianten) gestartet. Die Absorptionsänderung wurde mit einem Cary50-Spektrophotometer (Varian) bei 400 nm verfolgt. Die Absorptionsänderungen wurden um die nicht-enzymatische Hydrolyse korrigiert (siehe vorheriger Absatz). Die Anfangsraten (im Durchschnitt zehn verschiedene Kombinationen von Enzym- und Substratkonzentrationen für jede Variante) wurden für die Anpassung von Km und vmax gemäß der Michaelis-Menten-Kinetik verwendet. KI für kompetitive Inhibitoren wurden bei 30 °C gemessen und mit Gl. (1)
unter Verwendung von 4-8 verschiedenen Substrat (d.h. MpNPT) Konzentrationen. Der Wildtyp und die Varianten S225A, 488A, W397A, F495A, F415A, S416A und R411Q wurden ebenfalls bei 30 °C gemessen. Diese kinetischen Parameter wurden auf die Wildtyp-Aktivitäten bei 25 °C normalisiert.
Für die Messung der Feruloyl- und Chlorogenatesterase-Aktivität wurden vier Substrate getestet: Cumarsäuremethylester (Coum-ME), Kaffeesäuremethylester (Caff-ME), Chlorogensäure (Chlorogen) und p-Hydroxy-Hydroxybenzoesäuremethylester (pHB-ME). UV-Vis-Spektren mit 10 μM des Esters und der freien Säure wurden gemessen und Δε berechnet (ergänzende Abb. 10). Die Hydrolyse wurde wie für MpNPT gemessen, jedoch mit 10-35 nM Enzym, 100 µM Substrat und bei 335 nm (Coum-ME, Δε = -6100 M-1 cm-1), 350 nm (Caff-ME, Δε = -5700 M-1 cm-1), 350 nm (Chlorogen, Δε = -7400 M-1 cm-1) und 280 nm (pHB-ME, Δε = -3900 M-1 cm-1).
Differential Scanning Fluorimetry
Für die Analyse der Ligandenbindung an MHETase wurde die DSF verwendet. Die Experimente wurden mit einem Prometheus NT.48 (NanoTemper, München, Deutschland) durchgeführt. Das Gerät hat eine feste Anregungswellenlänge von 285 nm und Emissionswellenlängen von 330 und 350 nm. MHETase (wt) wurde immer in einer Konzentration von 100 µgmL-1 in der Endlösung verwendet. Die endgültigen Pufferkonzentrationen waren 100 mM TRIS pH 7,5, 150 mM NaCl mit oder ohne 20% DMSO. Es wurden hochempfindliche Kapillaren, wie sie von NanoTemper angeboten werden, verwendet. Der Temperaturbereich von 20 bis ≥80 °C wurde mit 0,5 K pro Minute gescannt. Die Liganden wurden in 21,7 mM Stammlösungen hergestellt und auf 10 mM Endkonzentration verdünnt. Die gesättigte Lösung (mit 0 oder 42,5% DMSO) wurde als Stammlösung verwendet, wenn sich die Verbindungen nicht vollständig auflösten. Für Verbindungen, die zuverlässige Messungen durch Absorption (4-Nitrophenol, 4-Nitrothiophenol, 2-Hydroxybenzoesäure) oder Fluoreszenz (BHET) behindern, wurden auch 1 mM Endkonzentrationen getestet. Die Tm-Werte werden wie von der Prometheus-Software angegeben (Maximum der Steigung für das Verhältnis I330 nm/I350 nm). Das Experiment wurde als Einzelmessung durchgeführt.
Sequenzabgleich und phylogenetischer Baum
Proteinhomologiesuchen für MHETase-ähnliche Proteine wurden mit dem NCBI Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) in der ESTHER-Datenbank (http://bioweb.ensam.inra.fr/ESTHER/general?what=blast) unter Verwendung der Block_X.pep-Datenbank22,39 durchgeführt. Das Multiple Sequence Alignment wurde durch Muscle Alignment mit MEGA740 durchgeführt. Die Evolutionsgeschichte wurde mit Hilfe der Maximum-Likelihood-Methode auf der Grundlage des JTT-Matrixmodells abgeleitet41. Der Baum mit der höchsten logarithmischen Wahrscheinlichkeit (-19.562,87) ist dargestellt. Die Ausgangsbäume für die heuristische Suche wurden automatisch ermittelt, indem die Algorithmen Neighbor-Join und BioNJ auf eine Matrix paarweiser Abstände angewandt wurden, die anhand eines JTT-Modells geschätzt wurden, und dann die Topologie mit dem höchsten log Likelihood-Wert ausgewählt wurde. Die Analyse umfasste 32 Aminosäuresequenzen. Alle Positionen mit Lücken und fehlenden Daten wurden eliminiert. Der endgültige Datensatz enthielt insgesamt 376 Positionen. Die Evolutionsanalysen wurden in MEGA740.
durchgeführt.