Reagenser
PET blev fremstillet af kommercielle flasker. Alle andre kemikalier blev købt med den højeste renhed fra Sigma-Aldrich, Carl Roth, Alfa Aesar eller Acros, hvis ikke andet er angivet.
Syntese af ligander og substrater
Identitet og renhed af alle syntetiserede forbindelser blev verificeret ved NMR. 1H-spektre blev målt i DMSO-d6 på en Bruker Avance II 300 udstyret med et 5 mm PABBO BB-1H/D Z-GRD Z104275/0398 probehoved ved 25-28 °C (fig. S7a-f). Til kalibrering af målingerne blev der anvendt tetramethylsilan.
Bishydroxyethyl terephthalat (BHET): BHET blev syntetiseret fra en PET-flaske ved alkoholyse med ethylenglycol. Tyve gram PET og 0,2 g vandfri natriumacetat blev refluksbehandlet i 120 mL ethylenglycol i 8 timer og derefter afkølet natten over. Der blev tilsat 120 mL H2O, og der blev filtreret ved 4 °C. Produktet blev vasket med 20 mL koldt H2O og ekstraheret flere gange med varmt H2O. BHET fremkom som hvide nåle (18 g (68 %), Mp 210-212 °C).
Bishydroxyethylterephthalinsyreamid (BHETA): BHETA blev syntetiseret fra PET ved aminolyse med 2-amino ethanol. Tyve gram PET og 0,2 g vandfri natriumacetat blev refluksbehandlet i 120 mL ethanolamin i 8 timer og derefter afkølet natten over. Der blev tilsat 120 mL H2O, og der blev filtreret ved 4 °C. Produktet blev vasket med 20 mL koldt H2O og omkrystalliseret to gange med 100 mL varmt H2O. BHETA fremkom som let rosa nåle (20 g (76%), Mp 240-243 °C).
Dimethylterephthalat (DMT): DMT blev syntetiseret ved forestering af terephthaloylchlorid med methanol. 25 mmol terephthaloylchlorid blev reageret med 30 mL methanol ved RT og derefter refluxet i 3 timer. Efter destillation af methanol og tørring ved 60 °C blev der opnået 4,08 g (Mp 144-148 °C). Vask med 0,5 M KOH og vand ændrede ikke smeltepunktet.
Monohydroxyethylterephthalat (MHET): MHET blev syntetiseret fra BHET ved delvis hydrolyse med KOH. 8,7 mmol BHET blev reageret med 8,4 mmol KOH i 18 mL MgSO4-tørret ethylenglycol ved 110-130 °C i 2,5 timer. 30 milliliter H2O blev tilsat, og blandingen blev ekstraheret tre gange med 5 mL CHCl3. Den vandige fase blev justeret til pH 3 med 25 % HCl og filtreret ved 4 °C. Efter to ekstraktionstrin med 30 ml varmt H2O og filtrering ved 4 °C blev udfældningen tørret ved 60 °C (0,56 g (30 %), Mp 185-190 °C).
Monohydroxyethyl terephthalinsyreamid (MHETA): MHETA blev syntetiseret ved delvis amidering af terephthaloylchlorid med ethanolamin. 150 mmol NaOH og 50 mmol ethanolamin i 50 mL H2O blev tilsat dråbevis inden for 1 time til 50 mmol terephthaloylchlorid i 50 mL H2O ved 0 °C. Reaktionen blev udført i yderligere 2 timer ved 0 °C og 2 timer under reflux, efterfulgt af varm filtrering. pH blev justeret til 3 med 25 % HCl. Den opnåede suspension blev filtreret koldt, og filtratet blev vasket med 20 mL koldt vand. Produktet blev omkrystalliseret fra 100 mL varmt H2O til skinnende krystaller (2,4 g (23 %), Mp 209-212 °C).
Mono-4-nitrophenylterephthalat (MpNPT): MpNPT blev syntetiseret ved forestering af terephthaloylchlorid med 4-nitrophenolat. 50 mmol terephthaloylchlorid og 50 mmol natrium-4-nitrophenolat blev suspenderet i 50 mL diethylether og reagerede i 2 timer ved 0 °C og derefter ved RT natten over. 2,5 g Na2CO3 og 4,5 g NaHCO3 i 50 mL H2O blev tilsat og reagerede ved RT i 10 timer. pH-værdien blev justeret til 8,5 med NaOH. Den uopløselige fraktion blev yderligere ekstraheret med i alt 2,5 g Na2CO3 og 2,5 g NaHCO3 i 100 mL H2O og derefter vasket, indtil pH-værdien blev neutral. MpNPT blev udfældet med HCl ved pH 3 og skyllet to gange med 50 mL 0,1 M HCl og derefter til en neutral pH-værdi. MpNPT blev adskilt fra forurenende bis-4-nitrophenylterephthalat ved ekstraktion med 100 mM NaPi pH 7,4 og syreudfældning. Den meget svagt gule opslæmning blev tørret ved 60 °C (Mp 202 °C).
Purifikation samt krystallisering og strukturopløsning
I. sakaiensis PETase (aminosyrerester 28-290) blev bestilt hos Genscript (Piscataway, USA) som et kodonoptimeret syntetisk gen indeholdende et C-terminalt His6-tag subklonet i pET-21b. Et kodon-optimeret DNA-fragment, der koder for I. sakaiensis MHETase (aminosyrerester 20-603), klonet i en pUC19-vektor, blev bestilt fra Genscript og senere subklonet i et pColdII-ekspressionsplasmid med et N-terminalt His6-tag (TAKARA BIO, Inc, Otsu, Shiga, Japan) ved FastCloning (Supplerende figur 11)30.
Til proteinekspression blev E. coli Shuffle T7-ekspresseceller (New England Biolabs, Frankfurt, Tyskland) transformeret med plasmiderne og udvalgt på lysogeny broth (LB) agarplader indeholdende 100 µgmL-1 ampicillin. Efter vækst natten over ved 30 °C blev overnatningskulturer inokuleret. Til overekspression blev der anvendt 1 L Erlenmeyer-kolber med baffler, der indeholdt 200 mL LB-medium suppleret med 100 µg mL-1 ampicillin. Cellerne blev dyrket ved 33 °C og 160 rpm rystningshastighed til en optisk tæthed ved 600 nm (OD600) på 1, før der blev tilsat 1 mM isopropyl β-d-1-thiogalactopyranosid (IPTG). Ved en OD600 på 2,5 blev temperaturen sænket til 16 °C, og overekspressionen fortsatte natten over. Cellerne blev høstet ved centrifugering ved 4 °C, 10 000 × g i 20 min og opbevaret ved -20 °C indtil videre brug.
Cellerne blev opløst ved sonicering i 50 mM TRIS-HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl, 10 mM imidazol og 1 mM Dithiothreitol (DTT) (buffer R). Celleaffald blev renset ved centrifugering. Celleekstraktet blev indlæst på en gravitationsstrømskolonne med Ni-NTA-sefarose, vasket med buffer R suppleret med 20 mM imidazol og elueret med buffer R suppleret med 200 mM imidazol (300 mM imidazol i tilfælde af PETase). Proteinfraktionerne blev renset på en Superdex75 10/300-kolonne (GE Healthcare, Solingen, Tyskland) med 20 mM TRIS pH 7,5, 150 mM NaCl, koncentreret til ~10 mg mL-1, lynfrosset i flydende N2 og opbevaret ved -80 °C. Proteinkoncentrationerne blev bestemt spektrofotometrisk ved hjælp af ε280 = 102 955 M-1 cm-1 (ε280 = 97,455 M-1 cm-1 for mutant W397A). Prøvernes renhed blev vurderet ved hjælp af GelAnalyzer-softwaren (version 2010a).
PETase blev krystalliseret i en koncentration på 10 mg mL-1 ved hjælp af dampdiffusion ved siddende dråber (1 µL protein plus 1 µL reservoir) ved 20 °C. Typiske PETase-krystaller voksede ved 20 °C med en reservoiropløsning indeholdende 0,1 M natriumcitrat eller natriumacetat pH 5,0, 15 % (v/v) PEG8000 og 0,5 M lithiumsulfat. MHETase krystalliserede ved en koncentration på 10 mg mL-1 ved siddende dråbedampdiffusion (1 µL protein plus 1 µL reservoir) ved 20 °C med et reservoir indeholdende 0,1 M HEPES, pH 7,5, 30 % (v/v) 2,4-MPD og 0,12 M ammoniumsulfat (pladsgruppe P212121) eller 0,1 M MES, pH 6,5, 10 % (v/v) PEG8000 og 0,1 M zinkacetat (pladsgruppe P1). MHETase-krystaller, der blev dyrket med MPD, blev kryokølet i deres reservoiropløsning. PETase-krystallen blev kryobeskyttet med 0,1 M natriumacetat, pH 5,0, 10 % (v/v) PEG8000, 15 % (v/v) PEG400 og 0,5 M lithiumsulfat. P1 MHETase-krystallen blev kryo-beskyttet med 0,1 M TRIS, pH 8,5, 5 % (v/v) PEG8000, 20 % (v/v) PEG400 og 0,5 M lithiumsulfat. Til derivatiseringseksperimenter blev krystaller inkuberet i 24 timer i den respektive kryo-beskyttelsesmiddelopløsning mættet med liganden og lynfrosset i flydende nitrogen. MHETase-diffraktionsdata blev indsamlet ved 100 K på beamlines 14.1 og 14.2 i BESSY II-lagringsringen i Berlin, Tyskland31. PETase-diffraktionsdata blev indsamlet ved stråle linje P13, PETRAIII, Hamburg32. Alle diffraktionsdata blev behandlet med XDS33,34.
Strukturen af PETase blev løst ved molekylær udskiftning ved hjælp af strukturkoordinaterne af T. fusca cutinase TfCut2 (PDB entry 4CG111,23). Strukturen af MHETase komplekset med MHETA blev løst ved molekylær udskiftning ved hjælp af MR-pipeline MoRDa35, som placerede seks kopier af en homologimodel baseret på PDB-post 6G21 (en upubliceret A. oryzae feruloyl esterase, AoFaeB-2; 26% identitet med MHETase med en forespørgselsdækning på 87%). Strukturerne blev suppleret under flere runder af raffinering med PHENIX.REFINE eller Refmac i tilfælde af PETase35,36 , afbrudt af manuel modelopbygning med COOT, som var omfattende for MHETase37. Strukturen af MHETase komplekseret med BA blev løst ved molekylær udskiftning ved hjælp af hele den asymmetriske enhed i MHETA-kostrukturen som henholdsvis søgemodel og afsluttet. MHETA- og BA-ligandene blev placeret i de respektive tætheder entydigt i de sidste faser af forfiningen. Strukturen af den P1-ligandfrie MHETase blev løst ved molekylær udskiftning ved hjælp af strukturkoordinater fra en færdiggjort MHETase-MHETA-kostruktur uden ligand. De ti kopier af MHETase i den asymmetriske enhed blev bygget manuelt eller ved hjælp af PHENIX.AUTOBUILD og raffineret med PHENIX.REFINE36.
Generering af MHETase-mutanter ved site-directed mutagenese
Til fremstilling af enkeltstedsmutanter blev enten Q5 site-directed mutagenese-kittet (New England Biolabs) eller QuikChange®-metoden anvendt. I det første tilfælde blev sættet anvendt i henhold til producentens anvisninger. I tilfælde af QuikChange®-metoden blev der anvendt en standard PCR-blanding (25 µL) bestående af 2,5 µL 10× Pfu-buffer (Roboklon GmbH, Berlin, Tyskland), 0,5 µL blandede deoxynukleosidtriphosphater (0,25 mM hver), plasmid-DNA (~40 ng), 1,25 µL fremadrettede og omvendte primere (10 µM; supplerende tabel 4), 1 µL PfuPlus! polymerase (Roboklon GmbH) og 18,1 µL ultrarent vand. Til denaturering blev temperaturen holdt på 95 °C i 30 s. Derefter blev der udført 20 cyklusser med 30 s denaturering ved 95 °C, annealing i 30 s ved 63 °C og elongation i 6 min ved 72 °C. I et sidste trin blev den endelige elongation udført ved 72 °C i 10 min. Efter PCR blev skabelon-DNA’et fordøjet med DpnI (New England BioLabs) i 2 timer ved 37 °C, inden enzymet blev inaktiveret ved 80 °C i 10 minutter. E. coli TOP10-celler blev transformeret med de opnåede PCR-produkter og udplateret på LB-agarplader indeholdende 100 µg mL-1 ampicillin og dyrket natten over ved 37 °C. Nukleotidsekvensen blev bekræftet ved sekventering hos Eurofins (Ebersberg, Tyskland).
Autohydrolyse af MpNPT
Hydrolysen blev fulgt spektrofotometrisk ved 400 nm ved 30 °C. Ved højere pH-værdier, hvor hydrolysen nærmer sig sin afslutning, blev der tilpasset et eksponentiel henfald. Ved lavere pH-værdier blev henfaldskonstanterne beregnet ud fra de oprindelige hastigheder under hensyntagen til renheden og den delvise deprotonering af 4-nitrophenol (den forventede værdi ved pH 7,5 er 12 420 M-1 cm-1 , beregnet med ε405 nm = 18 000 M-1 cm-1 og pKa = 7,15 for 4-nitrophenol)38. Absorptionsforskellen for 4-nitrophenol ved 400 og 405 nm var mindre end 0,5 %. Autohydrolyse blev målt fra pH 7,5 til 12,5 i 100 mM fosfat- eller boratbuffere og NaOH-opløsninger med en hastighedskonstant på k2 = 9,2 M-1 s-1 for d/dT = k2 , dvs. k1 = 2,9 × 10-6 s-1 (Supplerende figur 12). I 100 mM TRIS pH 7,5, der også blev anvendt til enzymkinetik, blev k1 = 46 × 10-6 s-1 for d/dT = k1 bestemt. TRIS øger således hydrolysehastigheden ~10 gange i forhold til den forventede reaktionshastighed med hydroxid ved pH 7,5.
Aktivitetstest
Aktiviteten blev målt for substraterne MHET og BHET ved HPLC og for MpNPT ved spektrofotometri. Til HPLC-målingerne blev reaktionerne (100 µL) stoppet ved tilsætning af en lige stor mængde 160 mM NaPi (natriumphosphatbuffer) pH 2,5 med 20 % (v/v) dimethylsulfoxid (DMSO) og opvarmning til 80 °C i 10 minutter. TPA, MHET og BHET blev separeret på en Kinetex 5 µm EVO C18 100 Å, 150 × 4,6 mm (Phenomenex, Aschaffenburg, Tyskland) med en gradient af acetonitril og 0,1 % (v/v) myresyre i vand ved 30 °C efter injektion af 10 µL prøve. Acetonitril blev øget fra 5 til 44 % indtil minut 12 og derefter til 70 % i minut 15, hvor forholdet forblev konstant i 3 minutter. TPA, MHET og BHET blev detekteret ved 240 nm, og kvantificering blev realiseret ved brug af kalibreringskurver.
For at kvantificere omsætningshastighederne for MHET og BHET blev reaktioner (100 µL) med 1 mM af substratet i 40 mM NaPi pH 7,5 med 80 mM NaCl og 20% (v/v) DMSO inkuberet ved 30 °C, inden de blev stoppet og analyseret som beskrevet ovenfor. MHETase blev anvendt ved 6 nM i 30 min i tilfælde af MHET. For BHET blev der anvendt en prescreening med 6 nM eller 12 nM MHETase-varianter til at identificere potentielt aktive enzymer, som efterfølgende blev analyseret ved højere koncentrationer. Omkring 100 nM af varianterne blev anvendt i 19,25 timer, og 3 nM wild-type MHETase blev tilsat til disse reaktioner med henblik på fuld konvertering af det dannede MHET til TPA, som blev kvantificeret via HPLC. Forsøget blev gentaget tre gange.
MpNPT-stamopløsninger blev fremstillet i DMSO i koncentrationer på 10, 1 og 0,1 mM. Substratkoncentrationerne var 0,1-1200 µM i 100 mM TRIS pH 7,5 eller 100 mM NaPi pH 7,5. De kinetiske parametre er de samme i begge buffere. Reaktionen i 400 µL-kuvetten blev startet ved 25 °C ved tilsætning af enzymet til en slutkoncentration på ca. 1 nM (aktive varianter) op til 500 nM (inaktive varianter). Absorptionsændringen blev fulgt på et Cary50-spektrofotometer (Varian) ved 400 nm. Absorptionsændringer blev korrigeret for ikke-enzymatisk hydrolyse (se foregående afsnit). De indledende hastigheder (i gennemsnit ti forskellige kombinationer af enzym- og substratkoncentrationer for hver variant) blev anvendt til tilpasning af Km og vmax i henhold til Michaelis-Menten-kinetikken. KI for kompetitive inhibitorer blev målt ved 30 °C og er beregnet med Eq. (1)
ved anvendelse af 4-8 forskellige substratkoncentrationer (dvs. MpNPT). Wild type og varianter S225A, 488A, W397A, F495A, F415A, S416A og R411Q blev også målt ved 30 °C. Disse kinetiske parametre blev normaliseret på wildtypeaktiviteter ved 25 °C.
Til måling af feruloyl- og chlorogenatesteraseaktivitet blev der testet fire substrater: cumarsyremethylester (Coum-ME), koffeinsyremethylester (Caff-ME), chlorogensyre (Chlorogen) og p-hydroxy-hydroxybenzoesyremethylester (pHB-ME). UV-Vis-spektre med 10 μM af esteren og den frie syre blev målt, og Δε blev beregnet (supplerende fig. 10). Hydrolysen blev målt som for MpNPT, men med 10-35 nM enzym, 100 µM substrat og ved 335 nm (Coum-ME, Δε = -6100 M-1 cm-1), 350 nm (Caff-ME, Δε = -5700 M-1 cm-1), 350 nm (Chlorogen, Δε = -7400 M-1 cm-1) og 280 nm (pHB-ME, Δε = -3900 M-1 cm-1).
Differential scanning fluorimetry
Til analyse af ligandbinding til MHETase blev der anvendt DSF. Eksperimenterne blev udført med en Prometheus NT.48 (NanoTemper, München, Tyskland). Enheden har en fast excitationsbølgelængde på 285 nm og emissionsbølgelængder på 330 og 350 nm. MHETase (wt) blev altid anvendt med 100 µgmL-1 i den endelige opløsning. De endelige bufferkoncentrationer var 100 mM TRIS pH 7,5, 150 mM NaCl med eller uden 20 % DMSO. Der blev anvendt kapillærer med høj følsomhed som leveret af NanoTemper. Temperaturområdet 20 til ≥80 °C blev scannet med 0,5 K pr. minut. Liganderne blev fremstillet i 21,7 mM stamopløsninger og fortyndet til 10 mM endelig koncentration. Den mættede opløsning (med 0 eller 42,5 % DMSO) blev anvendt som lager, hvis forbindelserne ikke opløstes helt. For forbindelser, der hindrer pålidelige målinger ved absorption (4-nitrophenol, 4-nitrothiophenol, 2-hydroxybenzoesyre) eller fluorescens (BHET), blev der også afprøvet 1 mM slutkoncentrationer. Tm-værdierne er angivet som angivet af Prometheus-softwaren (maksimum af hældningen for forholdet I330 nm/I350 nm). Forsøget blev udført som en enkelt måling.
Sekvensudligning og fylogenetisk træ
Proteinhomologisøgninger for MHETase-lignende proteiner blev udført med NCBI’s grundlæggende lokale udligningssøgningsværktøj (BLAST) i ESTHER-databasen (http://bioweb.ensam.inra.fr/ESTHER/general?what=blast) ved hjælp af Block_X.pep-databasen22,39. Multiple sekvenstilpasning blev udført ved hjælp af Muscle alignment med MEGA740. Den evolutionære historie blev udledt ved hjælp af Maximum Likelihood-metoden baseret på den JTT-matrixbaserede model41. Træet med den højeste log sandsynlighed (-19.562,87) er vist. De(t) indledende træ(er) til den heuristiske søgning blev opnået automatisk ved at anvende algoritmerne Neighbor-Join og BioNJ på en matrix af parvise afstande, der er estimeret ved hjælp af en JTT-model, og derefter vælge den topologi med den højeste log sandsynlighedsværdi. Analysen omfattede 32 aminosyresekvenser. Alle positioner, der indeholdt huller og manglende data, blev elimineret. Der var i alt 376 positioner i det endelige datasæt. Evolutionære analyser blev udført i MEGA740.