Prevalência de reversão de expressão na evolução experimental

Nós identificamos cinco estudos que conduziram seis diferentes experimentos de adaptação e coletamos dados transcriptométricos adequados à nossa análise. Estes seis experimentos incluíram 10 réplicas de E. coli adaptando-se a um ambiente de alta temperatura17, 6 réplicas de outra linhagem de E. coli adaptando-se a um ambiente de alta temperatura18, 7 réplicas de E. coli adaptando-se a um meio glicerol16, 7 réplicas de E. coli. coli adaptando-se a um meio de lactato16, 1 réplica de cada uma das 12 cepas diferentes de leveduras (Saccharomyces cerevisiae) adaptando-se a um meio de xilulose19, e 2 réplicas de guppies (Poecilia reticulata) adaptando-se a um ambiente de baixa predação15. No total, foram analisados 44 casos de adaptação.

Em cada caso, foram coletados dados de transcriptoma respectivamente para os organismos no ambiente original (o para o estágio original), logo após sua exposição ao novo ambiente (p para o estágio plástico), e na conclusão da evolução experimental no novo ambiente (a para o estágio adaptado; Fig. 1a). Note que o tempo entre o e p é tão curto que não se espera que nenhum alelo recém surgido tenha atingido uma frequência apreciável na fase p para impactar o fenótipo médio da população. O nível de expressão de cada gene é tratado como um traço. Que os níveis de expressão de um gene nos estágios o, p, e um estágio sejam Lo, Lp, e La, respectivamente. Em cada experimento, primeiro identificamos genes com PCs apreciáveis em nível de expressão, exigindo que PC = |Lp-Lo| seja maior que um corte pré-definido. Também identificamos genes com GC apreciáveis em nível de expressão ao exigir que GC = |La-Lp| seja maior do que o mesmo corte pré-definido. Para aqueles genes que mostram tanto PCs apreciáveis quanto GC apreciáveis, perguntamos se as duas mudanças estão na mesma direção (i.e., reforço) ou em direções opostas (i.e., reversão; Fig. 1b, c). Utilizamos 20% do nível de expressão gênica original (ou seja, 0,2Lo) como ponto de corte na análise acima. A fração de genes exibindo nível de reforço de expressão (LRC) é menor que a fração de genes exibindo reversão (CRV) em 42 das 44 adaptações, e a diferença entre LRC e CRV é significativa em 40 desses 42 casos (P< 0,05 nominal; teste binomial bicaudal; Fig. 1d). Dentre as duas adaptações com LRC > CRV, sua diferença é significativa em apenas um caso (Fig. 1d). A preponderância geral da reversão do nível de expressão (ou seja, 42 de 44 casos) na adaptação é estatisticamente significativa (P = 1,1 × 10-10, teste binomial bicaudal). A mesma tendência é evidente quando o corte é alterado para 0,05Lo (Fig. Suplementar 1a) ou 0,5Lo (Fig. Suplementar 2a), sugerindo que o achado acima é robusto para a escolha do corte. Claramente, os dados transcriptômicos não suportam a hipótese de que a plasticidade geralmente facilita a adaptação genética.

Reversão do fluxo metabólico em adaptações ambientais

Para avaliar a generalidade do achado acima e entender sua causa subjacente, expandimos a comparação entre o reforço fenotípico e a reversão aos fluxos metabólicos (ver Introdução). Como a nossa análise metabólica não se destina a modelar a evolução experimental ou mudanças de expressão acima, os parâmetros utilizados não estão relacionados com a evolução experimental. Especificamente, previmos computacionalmente alterações plásticas e de fluxo genético durante as adaptações ambientais usando iAF1260, a rede metabólica reconstruída de E. coli23. Utilizamos a análise de balanço de fluxo (FBA) para prever os fluxos otimizados de organismos totalmente adaptados nos ambientes original (estágio o) e novo (estágio a), respectivamente, sob a suposição de que a taxa de produção de biomassa, uma proxy para o fitness, é maximizada pela seleção natural20. As previsões de FBA correspondem razoavelmente bem às medidas experimentais para organismos adaptados aos seus ambientes24,25,26,27,28,29 e são comumente usadas no estudo das relações genótipo – ferro-ambiente -fenótipo22,27,29,30,31,32,33,34,35,36,37. Na previsão de mudanças de fluxo plástico em mudanças ambientais (estágio p), empregamos a minimização do ajuste metabólico (MOMA) ao invés do FBA, pois o MOMA recapitula melhor a resposta imediata do fluxo às perturbações21 (ver Métodos). Tratamos o fluxo de cada reação na rede metabólica como uma característica, e modelamos os deslocamentos ambientais alterando a fonte de carbono disponível para a rede. Existem 258 reacções de troca distintas no iAF1260, cada uma transportando uma fonte de carbono diferente. Portanto, examinamos 258 diferentes ambientes de fonte única de carbono.

Iniciamos a análise usando a glicose como fonte de carbono no ambiente original, pois este ambiente foi o benchmark na construção do iAF126023. Em seguida, consideramos as adaptações de E. coli a 257 novos ambientes, cada um com uma fonte única de carbono diferente. Verificamos que esses novos ambientes estão naturalmente separados em dois grupos na taxa de produção de biomassa prevista pelo MOMA, um proxy para a adequação no estágio p (fp) (Figura Complementar 3). Um grupo mostra fp < 10-4, sugerindo que é improvável que E. coli se sustente nestes novos ambientes. Focamos, portanto, os 50 novos ambientes restantes com fp > 10-4, aos quais E. coli pode presumivelmente se adaptar (Suplemento Tabela 1).

Definindo reforço e reversão de fluxo e usando o corte de 0,2Lo como na análise do transcriptoma, encontramos CRV significativamente maior que CRI (nominal P < 10-10, teste binomial de duas caudas) em cada adaptação. A probabilidade de que todas as 50 adaptações mostrem CRV > CRI é 1,8 × 10-15 (teste binomial bicaudal; Fig. 2a), sugerindo um predomínio geral de reversão de fluxo. A média e a mediana do VCR são de 30,2% e 30,5%, respectivamente, enquanto as para a LRC são de apenas 1,0% e 0,8%, respectivamente. A tendência acima se mantém quando alteramos o corte para 0,05Lo (Fig. 1b Suplementar) ou 0,5Lo (Fig. 2b Suplementar). Como um problema FBA ou MOMA pode ter múltiplas soluções, a ordem das reações na matriz estequiométrica pode afetar a solução específica fornecida pelo solucionador. Entretanto, quando embaralhamos aleatoriamente a ordem da reação em iAF1260, o padrão geral de CRV > CRI é inalterado (Suplemento Fig. 4a). Como a programação quadrática requerida pelo MOMA é mais difícil de resolver do que a programação linear usada em FBA, a CRV poderia ter sido superestimada em comparação com a CRI. Para corrigir este problema potencial, projetamos um MOMA quadrático baseado em programação chamado “MOMA-b” e o usamos ao invés de FBA para prever fluxos na etapa a (veja Métodos), mas descobrimos que a CRV ainda excede a CRI (Suplemento Fig. 4b). Assim, esta tendência não é um artefato técnico da diferença solver entre MOMA e FBA.

Reversão de fluxo restaura amplamente os fluxos originais

Predominância da reversão de fluxo independentemente do ambiente original

Para investigar a generalidade do nosso achado da predominância da reversão de fluxo, também examinamos adaptações com um ambiente original não glicosado. Para muitos ambientes originais, entretanto, apenas alguns ambientes novos são adaptáveis pela rede metabólica de E. coli. Assim, focalizamos 41 ambientes originais (incluindo o ambiente de glicose usado anteriormente) que tem mais de 20 adaptáveis (ou seja, fp > 10-4) novos ambientes (Tabela Complementar 2). Para cada um desses ambientes originais, calculamos a relação CRI/CRV para cada ambiente novo adaptável, e constatamos que ela é tipicamente inferior a 0,1 (Fig. 2d). Calculamos então a CRI/CRV mediana em todos os ambientes novos adaptáveis a partir de cada ambiente original. Nos 41 ambientes originais, a maior mediana da CRI/CRV é 0,11 e a mediana da CRI/CRV mediana é apenas 0,02. Assim, independentemente do ambiente original, a reversão de fluxo é muito mais prevalente do que o reforço durante as adaptações genéticas a novos ambientes.

Por que a reversão fenotípica é mais frequente do que o reforço

A nossa descoberta de que o reforço fenotípico não só não é mais como na verdade é muito menos comum do que a reversão é inesperada e por isso exige uma explicação. A observação desta tendência tanto em análises transcriptómicas como fluxómicas sugere um mecanismo geral subjacente, que propomos é a ocorrência de PC > TC. Geometricamente, é óbvio que quando PC > TC, o GC deve reverter o PC (os diagramas esquerdo e médio na linha superior na Fig. 3a). Em contraste, quando PC < TC, a reversão e o reforço são igualmente prováveis se não existir outro viés (os diagramas esquerdo e médio na linha inferior na Fig. 3a). Deixe a probabilidade de PC > TC ser q (> 0). CRI/CRV deve ser / = (1 – q)/(1 + q) < 1. Em outras palavras, desde que PC > TC para alguns traços, espera-se que a reversão seja mais frequente que o reforço (sob nenhum outro viés).

Para buscar evidências empíricas para a explicação acima, para cada um dos 44 casos de evolução experimental, calculamos a fração de genes cujas mudanças de expressão satisfazem PC > TC (Fig. 3b). A média e a mediana das frações são 0,51 e 0,48, respectivamente. Além disso, após removermos todos os genes para os quais PC > TC, não há mais um excesso de reversão (Fig. 5a suplementar), indicando a suficiência da nossa explicação. Da mesma forma, calculamos a fração das reações metabólicas mostrando PC > TC na adaptação da rede metabólica E. coli do ambiente glicêmico para cada um dos 50 novos ambientes (Fig. 3c). A média e a mediana das frações são 0,85 e 0,93, respectivamente. Da mesma forma, após a remoção das reações mostrando PC > TC, não há tendência geral de maior reversão do que o reforço nas 50 adaptações (Fig. 5b Suplementar). Estes resultados transcriptoma e fluxome suportam que o excesso de reversão relativo ao reforço é explicável pela ocorrência de PC > TC para fracções de traços não negligenciáveis.

Por que é que o PC excede a TC para muitos traços? Uma razão provável é que os PCs permitem que os organismos sobrevivam a uma mudança ambiental súbita, mas a aptidão física é muito reduzida em comparação com a do ambiente original, bem como após a adaptação ao novo ambiente. Assim, o estado fisiológico geral dos organismos pode ser bastante semelhante entre os estágios adaptados no ambiente original e no novo ambiente, mas é muito diferente no estágio plástico de baixa aptidão logo após a mudança ambiental. Isto pode explicar porque o PC excede o TC para muitas características, independentemente de os valores das características serem causas ou consequências da aptidão e fisiologia do organismo.

Encontramos fortes evidências para o modelo acima através da análise da rede metabólica. Primeiro, usando a taxa de produção prevista de biomassa como proxy para a aptidão física, comparamos a aptidão física da E. coli na fase plástica (fp) e aquela após a adaptação a um novo ambiente (fa), em relação à do ambiente de glicose original, para cada uma das adaptações aos 50 novos ambientes. Em todos os casos, fp < 1 (Fig. 3d), confirmando que as mudanças ambientais causam quedas na aptidão física antes da adaptação genética. Descobrimos que fa é tipicamente próximo de 1, embora em alguns ambientes novos seja muito >1 (Fig. 3d). Numa escala log10, fp é mais diferente de 1 do que fa em 43 das 50 adaptações (P = 1,0 × 10-7; teste binomial de uma cauda). Em segundo lugar, nosso modelo assume uma associação entre mudanças de fluxo e mudanças de condicionamento físico22. Nas 50 adaptações do ambiente glicêmico, há uma forte correlação negativa entre fp e PC médio (Spearman’s ρ = -0.98, P < 10-300; Fig. 3e). Existe uma correlação oposta entre fa e TC média (ρ = 0,57, P = 1,1 × 10-5; Fig. 3f). Juntas, nossas análises demonstram que a principal razão para uma maior freqüência de reversão fenotípica do que o reforço durante a adaptação é que em termos de aptidão e fenótipos associados, os organismos no estágio p são mais diferentes daqueles no estágio a, quando comparados com aqueles no estágio o.

Reversão fenotípica em redes metabólicas aleatórias

Os PCs e GC em nível de expressão gênica e fluxo metabólico durante as adaptações dependem, respectivamente, da rede regulatória e da rede metabólica das espécies em questão. Como estas redes resultam de milhares de milhões de anos de evolução, é de perguntar se a predominância da reversão fenotípica é atribuível à história evolutiva das espécies estudadas, especialmente dos ambientes em que as espécies e seus ancestrais foram selecionados no passado, ou uma propriedade intrínseca de qualquer sistema funcional. Para abordar esta questão, aplicamos a mesma análise a 500 redes metabólicas funcionais aleatórias previamente geradas22. Estas redes foram construídas a partir do iAF1260, trocando suas reações com reações escolhidas aleatoriamente do universo de todas as reações metabólicas na Enciclopédia de Genes e Genomas de Kyoto38, desde que a rede tenha uma aptidão não zero no ambiente de glicose em cada troca de reação39,

Apenas 20 novos ambientes aos quais o iAF1260 pode se adaptar (do ambiente de glicose) são adaptáveis por pelo menos 20 das 500 redes aleatórias. Assim, analisamos as adaptações das redes aleatórias a cada um desses 20 novos ambientes, sendo o ambiente de glicose o ambiente original. Para cada novo ambiente, a mediana do CRV de todas as redes aleatórias que podem se adaptar a este ambiente é geralmente em torno de 0,1 (gráficos da figura 4a), sendo a mediana do CRV mediano de 0,11. Em contraste, a mediana do CRV de todas as redes aleatórias para um novo ambiente é geralmente inferior a 0,01 (gráficos da Fig. 4b), com a mediana do CRV mediano sendo de 0,0033. A razão mediana da CRI/CRV através de redes aleatórias para um novo ambiente é geralmente inferior a 0,05 (quadro na Fig. 4c), com a mediana da CRI/CRV mediana sendo 0,0033. Claramente, a predominância da reversão de fluxo também é evidente nas redes aleatórias funcionais, sugerindo que esta propriedade é intrínseca a qualquer rede metabólica funcional, e não um produto de históricos evolutivos particulares. De fato, a explicação mecanicista para esta propriedade em organismos reais (Fig. 3) está presente nas redes metabólicas aleatórias aqui examinadas. Especificamente, a fração de reações exibindo PC > TC é substancial (Fig. 4d) e fp é na maioria das vezes inferior a 1 (Fig. 4e). Além disso, fp é geralmente mais diferente de 1 do que fa em uma escala log10, porque |log10fp|-|log10fa| é amplamente positivo (Fig. 4f).

Intrigualmente, porém, para 19 dos 20 novos ambientes, o CRV na rede metabólica de E. coli excede o CRV mediano nas redes aleatórias (Fig. 4a). Uma tendência similar, mas menos óbvia, se mantém para a LRC (Fig. 4b). Para 16 dos 20 novos ambientes, o CRI/CRV da E. coli é menor que a mediana do CRI/CRV das redes aleatórias (P = 0,012, teste binomial de duas caudas; Fig. 4c). Assim, embora tanto a rede metabólica de E. coli quanto as redes aleatórias apresentem uma predominância de reversão de fluxo, este fenômeno é mais pronunciado na E. coli. mecanisticamente, esta disparidade é explicável pelo menos qualitativamente pelo nosso modelo na secção anterior. Especificamente, para 15 dos 20 novos ambientes, a fração das reações de E. coli com PC > TC excede a fração mediana correspondente em redes aleatórias (P = 0,021, teste binomial de uma cauda; Fig. 4d). Para todos os 20 novos ambientes, fp de E. coli é inferior à fp mediana das redes aleatórias (P = 9,5 × 10-7, teste binomial unidirecional; Fig. 4e). Para 19 dos 20 novos ambientes, |log10 fp| – |log10 fa| para E. coli é maior que a mediana correspondente das redes aleatórias (P = 2,0 × 10-5, teste binomial de uma cauda; Fig. 4f). Mas, porque é que fp de E. coli é menor que o das redes aleatórias? Uma explicação potencial é que a composição e estrutura da rede metabólica de E. coli tem sido evolutivamente otimizada para o crescimento no ambiente glicêmico e/ou ambientes relacionados, enquanto o mesmo não é verdade para as redes aleatórias, que só eram necessárias para serem viáveis no ambiente glicêmico. Como resultado, quando a glicose é substituída por uma nova fonte de carbono em um novo ambiente, a adequação da E. coli cai substancialmente, mas as das redes aleatórias podem cair apenas suavemente. Embora a aptidão absoluta no estágio plástico possa ser maior para E. coli do que para as redes aleatórias, espera-se que a aptidão relativa, que é fp, seja menor para E. coli do que para as redes aleatórias. Assim, a maior prevalência de reversão de fluxo em relação ao reforço em E. coli do que as redes aleatórias é provavelmente um subproduto de uma seleção mais forte de E. coli em comparação com as redes aleatórias no ambiente original utilizado em nossa análise de adaptação.

Reversão é pelo menos tão comum quanto o reforço mesmo para traços com TC apreciável

Nas análises anteriores de transcriptomas (Fig. 1d) e fluxomas (Fig. 2a), consideramos todos os traços que exibem PCs e GC apreciáveis. Em estudos comparativos e evolutivos, contudo, os fenótipos na fase p são tipicamente inacessíveis. Como resultado, os biólogos comparativos e evolutivos geralmente se concentram em traços cujos valores fenotípicos diferem entre os estágios o e a, apesar de que os outros traços também poderiam ter experimentado mudanças adaptativas (dos valores no estágio p para aqueles no estágio a). Para estudar se os nossos achados anteriores se aplicam aos traços que são objeto da maioria dos biólogos comparativos e evolutivos, focalizamos um subconjunto de traços acima analisados que satisfazem a condição de TC > 0,2Lo. Dos 44 casos de evolução experimental, 33 apresentaram CRV > CRI (P = 0,0013, teste binomial bicaudal), em 30 dos quais CRV excede significativamente o CRI (P< 0,05; teste binomial bicaudal; Fig. 5a). Das 50 adaptações ambientais da rede metabólica de E. coli originárias do ambiente glicêmico, três casos tiveram igual número de reversão e reforço do fluxo. Dos 47 casos restantes, 22 apresentaram maior reversão que reforço, enquanto 25 apresentaram o oposto (P = 0,77, teste binomial bicaudal; Fig. 5b). Quando a LRC é significativamente diferente da VRC, 15 casos mostraram VRC < LRC enquanto 11 mostraram o oposto (P = 0,70, teste binomial bicaudal; Fig. 5b). Assim, mesmo entre traços com TC > 0,2Lo, não há evidências para um reforço significativamente maior do que a reversão. De notar, na análise metabólica acima referida, em média 139 reacções satisfeitas TC > 0,2Lo por adaptação. Como todas as mudanças de fluxo observadas na maximização da aptidão física são necessárias e por definição são benéficas, mesmo a adaptação a uma simples mudança de fonte de carbono aparentemente envolve muito mais do que algumas reações.