- Ilmoitusten palautumisen yleisyys kokeellisessa evoluutiossa
- Aineenvaihduntavirtojen palautuminen ympäristösopeutumisissa
- Virtauksen palautus palauttaa suurelta osin alkuperäiset virtaukset
- Virtauksen palautuksen ylivoimaisuus alkuperäisestä ympäristöstä riippumatta
- Miksi fenotyyppinen palautuminen on yleisempää kuin vahvistuminen
- Fenotyyppinen palautuminen satunnaisissa aineenvaihduntaverkoissa
- Reversio on vähintään yhtä yleinen kuin vahvistuminen jopa ominaisuuksissa, joilla on huomattava TC
Ilmoitusten palautumisen yleisyys kokeellisessa evoluutiossa
Havaitsimme viisi tutkimusta, joissa suoritettiin kuusi erilaista sopeutumiskokeilua ja kerättiin analyysiimme sopivia transkriptomitietoja. Näihin kuuteen kokeeseen kuului 10 toistoa E. coli -kannasta, joka sopeutui korkealämpöiseen ympäristöön17, 6 toistoa toisesta E. coli -kannasta, joka sopeutui korkealämpöiseen ympäristöön18, 7 toistoa E. coli -kannasta, joka sopeutui glyseroliympäristöön16, 7 toistoa E.. coli-kannan (Saccharomyces cerevisiae) 7 replikaattia, jotka sopeutuvat laktaattiympäristöön16, 1 replikaatti kutakin 12:sta eri hiivakannasta (Saccharomyces cerevisiae), jotka sopeutuvat ksyluloosa-alustaan19, ja 2 replikaattia guppeja (Poecilia reticulata), jotka sopeutuvat vähäisen petoympäristöön15. Analysoimme yhteensä 44 sopeutumistapausta.
Kussakin tapauksessa transkriptomitiedot kerättiin vastaavasti organismeista alkuperäisessä ympäristössä (o alkuperäistä vaihetta varten), pian sen jälkeen, kun ne olivat altistuneet uudelle ympäristölle (p plastista vaihetta varten), ja kokeellisen evoluution päättyessä uudessa ympäristössä (a sopeutunutta vaihetta varten; kuva 1a). Huomattakoon, että o:n ja p:n välinen aika on niin lyhyt, että uuden alleelin ei odoteta saavuttaneen merkittävää frekvenssiä vaiheessa p vaikuttaakseen populaation keskimääräiseen fenotyyppiin. Kunkin geenin ilmentymistasoa käsitellään ominaisuutena. Olkoon geenin ilmentymistasot o-, p- ja a-vaiheissa vastaavasti Lo, Lp ja La. Kussakin kokeessa tunnistettiin ensin geenit, joiden ilmentymistasossa oli huomattavia PC:tä edellyttämällä, että PC = |Lp-Lo| on suurempi kuin ennalta asetettu raja-arvo. Tunnistimme myös geenit, joiden ekspressiotason GC oli huomattavan suuri, vaatimalla, että GC = |La-Lp| oli suurempi kuin sama ennalta asetettu raja-arvo. Niiden geenien osalta, joilla oli sekä huomattavia PC:tä että huomattavia GC:tä, kysyimme, ovatko nämä kaksi muutosta samansuuntaisia (eli vahvistuminen) vai vastakkaissuuntaisia (eli palautuminen; kuva 1b, c). Käytimme 20 prosenttia alkuperäisestä geeniekspressiotasosta (eli 0,2Lo) raja-arvona edellä mainitussa analyysissä. Ekspressiotason vahvistumista osoittavien geenien osuus (CRI) on pienempi kuin palautumista osoittavien geenien osuus (CRV) 42:ssa 44 sopeutumisesta, ja CRI:n ja CRV:n välinen ero on merkitsevä 40:ssä näistä 42:sta tapauksesta (nimellinen P < 0.05; kaksoissuuntainen binomitesti; Kuva 1d). Niistä kahdesta mukautuksesta, joiden CRI > CRV, niiden ero on merkitsevä vain yhdessä tapauksessa (kuva 1d). Ekspressiotason palautumisen yleinen ylivoima (eli 42 tapausta 44 tapauksesta) adaptaatiossa on tilastollisesti merkitsevä (P = 1,1 × 10-10, kaksoissuuntainen binomitesti). Sama suuntaus on ilmeinen, kun raja-arvoa muutetaan 0.05Lo:ksi (täydentävä kuva 1a) tai 0.5Lo:ksi (täydentävä kuva 2a), mikä viittaa siihen, että edellä mainittu havainto on kestävä raja-arvon valinnan suhteen. On selvää, että transkriptomiset tiedot eivät tue hypoteesia, jonka mukaan plastisuus yleensä helpottaa geneettistä sopeutumista.
Aineenvaihduntavirtojen palautuminen ympäristösopeutumisissa
Voittaaksemme arvioida edellä esitetyn havainnon yleispätevyyttä ja ymmärtääkseen sen taustalla olevan syyn laajensimme vertailuamme fenotyyppisen vahvistumisen ja palautumisen välillä aineenvaihduntavirtoihin (ks. Johdanto). Koska metabolisen analyysimme tarkoituksena ei ole mallintaa edellä mainittua kokeellista evoluutiota tai ekspressiomuutoksia, käytetyt parametrit eivät liity kokeelliseen evoluutioon. Erityisesti ennustimme laskennallisesti plastisia ja geneettisiä virtausmuutoksia ympäristöön sopeutumisen aikana käyttämällä iAF1260:ää, rekonstruoitua E. coli -metaboliaverkostoa23. Käytimme vuon tasapainoanalyysia (FBA) ennustamaan täysin sopeutuneiden organismien optimoituja virtoja alkuperäisessä (vaihe o) ja uudessa (vaihe a) ympäristössä olettaen, että luonnonvalinta maksimoi biomassan tuotantonopeuden, joka on kuntoilun korvike20. FBA-ennusteet vastaavat kohtuullisen hyvin kokeellisia mittaustuloksia ympäristöönsä sopeutuneille organismeille24,25,26,27,28,29, ja niitä käytetään yleisesti genotyypin, ympäristön ja fenotyypin välisten suhteiden tutkimisessa22,27,29,30,31,32,33,34,35,36,37. Ennustettaessa plastisen virtauksen muutoksia ympäristön muutosten yhteydessä (vaihe p) käytimme FBA:n sijasta metabolisen sopeutumisen minimointia (MOMA), koska MOMA kuvaa paremmin välitöntä virtausvastetta häiriöihin21 (ks. menetelmät). Käsittelimme aineenvaihduntaverkon kunkin reaktion virtausta ominaisuutena ja mallinsimme ympäristömuutoksia muuttamalla verkon käytettävissä olevaa hiililähdettä. iAF1260:ssä on 258 erillistä vaihtoreaktiota, joista kukin kuljettaa eri hiililähdettä. Siksi tarkastelimme 258 erilaista yhden hiililähteen ympäristöä.
Aloitimme analyysin käyttämällä glukoosia hiililähteenä alkuperäisessä ympäristössä, koska tämä ympäristö oli vertailukohtana iAF1260:n rakentamisessa23. Sen jälkeen tarkastelimme E. colin sopeutumista 257 uuteen ympäristöön, joissa kussakin oli erilainen yhden hiilen lähde. Havaitsimme, että nämä uudet ympäristöt jakautuvat luontevasti kahteen ryhmään MOMA:n ennustaman biomassan tuotantonopeuden suhteen, joka edustaa kuntoa vaiheessa p (fp) (täydentävä kuva 3). Toisessa ryhmässä fp < 10-4, mikä viittaa siihen, että E. coli ei todennäköisesti selviä näissä uusissa ympäristöissä. Siksi keskityimme jäljelle jääviin 50 uuteen ympäristöön, joiden fp > 10-4, joihin E. coli voi oletettavasti sopeutua (Täydentävä taulukko 1).
Määritellessämme virtauksen vahvistumisen ja palautumisen ja käyttämällä transkriptomianalyysissä käytettyä raja-arvoa 0,2Lo, havaitsimme CRV:n olevan merkitsevästi CRI:tä suurempi (nimellinen P < 10-10, kaksoissuuntainen binomitesti) jokaisessa sopeutumisvaihtoehdossa. Sattumanvarainen todennäköisyys sille, että kaikissa 50 adaptaatiossa CRV > CRI on 1,8 × 10-15 (kaksinapainen binomitesti; kuva 2a), mikä viittaa siihen, että virtauksen palautuminen on yleisesti vallitsevaa. CRV:n keskiarvo on 30,2 % ja mediaani 30,5 %, kun taas CRI:n keskiarvo on vain 1,0 % ja mediaani 0,8 %. Edellä esitetty suuntaus säilyy, kun muutamme raja-arvoa 0,05Lo (täydentävä kuva 1b) tai 0,5Lo (täydentävä kuva 2b). Koska FBA- tai MOMA-ongelmalla voi olla useita ratkaisuja, reaktioiden järjestys stökiometrisessä matriisissa voi vaikuttaa ratkaisijan antamaan ratkaisuun. Kun kuitenkin sekoitimme satunnaisesti reaktioiden järjestystä iAF1260:ssä, yleinen kuvio CRV > CRI ei muuttunut (täydentävä kuva 4a). Koska MOMA:n vaatima kvadraattinen ohjelmointi on vaikeampi ratkaista kuin FBA:ssa käytetty lineaarinen ohjelmointi, CRV on voinut olla yliarvioitu CRI:hen verrattuna. Tämän mahdollisen ongelman korjaamiseksi suunnittelimme kvadraattiseen ohjelmointiin perustuvan MOMA:n nimeltä ”MOMA-b” ja käytimme sitä FBA:n sijasta ennustamaan virtauksia vaiheessa a (ks. menetelmät), mutta havaitsimme, että CRV ylittää edelleen CRI:n (täydentävä kuva 4b). Näin ollen tämä suuntaus ei ole tekninen artefakti, joka johtuu MOMA:n ja FBA:n välisestä ratkaisijan erosta.
Virtauksen kääntymisen ylivoimaisuus E. coli -bakteerin ympäristöön sopeutumisessa. a Niiden reaktioiden osuudet, joissa on vahvistavia (CRI) ja käänteisiä (CRV) virtauksen muutoksia, vastaavasti sopeutumisessa glukoosiympäristöstä kuhunkin 50:stä uudesta ympäristöstä. Kukin palkki edustaa sopeutumista uuteen ympäristöön. Vahvistavien ja kääntyvien reaktioiden osuuksien yhtäläisyys on testattu kaksoishäntäisellä binomitestillä. Kun CRV > CRI, P-arvot ilmoitetaan seuraavasti: *P < 0,05; **P < 10-10; ***P < 10-100; kun CRV < CRI, P-arvot merkitään seuraavasti: oP < 0,05; ooP < 10-10; oooP < 10-100. b Palautumisen luokittelu kolmeen kategoriaan sen perusteella, onko fenotyyppinen arvo alkuperäisessä ympäristössä alipalautunut, palautunut vai ylipalautunut. c Palautumisen kolmen luokan osuudet kussakin 50 sopeutumisessa. d Vahvistavien reaktioiden osuus suhteessa palauttavien reaktioiden osuuteen (CRI/CRV) E. colin sopeutumisissa vähintään 20 uuteen ympäristöön kustakin 41 tutkitusta alkuperäisestä ympäristöstä. CRI/CRV-suhteet kaikkien kunkin alkuperäisen ympäristön kaikkien sopeutumisten osalta esitetään laatikkokuviona, jossa laatikon alareuna edustaa ensimmäistä (qu1) ja yläreuna kolmatta (qu3) kvartiilia, laatikon sisäpuolella oleva vaakasuora viiva ilmaisee mediaania (md), ja viikset ulottuvat sisempien aitojen sisäpuolella oleviin äärimmäisimpiin arvoihin (md ± 1).5(qu3 – qu1), ja ympyrät edustavat sisäisten aitojen ulkopuolella olevia arvoja (outlierit)
Virtauksen palautus palauttaa suurelta osin alkuperäiset virtaukset
Virtauksen palautuksen ylivoimaisuus alkuperäisestä ympäristöstä riippumatta
Tutkittaessa havaintomme virtauksen palautuksen ylivoimaisuudesta yleispätevyyttä tarkastelimme myös sopeutumista muuhun kuin glukoosia sisältävään lähtöympäristöön. Monien alkuperäisympäristöjen osalta E. colin metabolinen verkosto pystyy kuitenkin sopeutumaan vain muutamaan uuteen ympäristöön. Keskityimme näin ollen 41 alkuperäisympäristöön (mukaan lukien aiemmin käytetty glukoosiympäristö), joista jokaisessa on yli 20 mukautuvaa (eli fp > 10-4) uutta ympäristöä (lisätaulukko 2). Laskimme jokaiselle näistä alkuperäisympäristöistä CRI/CRV-suhteen kullekin mukautuvalle uudelle ympäristölle ja havaitsimme sen olevan tyypillisesti alle 0,1 (kuva 2d). Tämän jälkeen laskimme CRI/CRV:n mediaanin kaikista mukautuvista uusista ympäristöistä kustakin alkuperäisestä ympäristöstä. Kaikkien 41 alkuperäisen ympäristön suurin CRI/CRV:n mediaani on 0,11 ja CRI/CRV:n mediaani on vain 0,02. Näin ollen alkuperäisestä ympäristöstä riippumatta virtauksen palautuminen on paljon yleisempää kuin vahvistuminen geneettisen sopeutumisen aikana uusiin ympäristöihin.
Miksi fenotyyppinen palautuminen on yleisempää kuin vahvistuminen
Havaintomme, jonka mukaan fenotyyppinen vahvistuminen ei ole ainoastaan ei enempää vaan itse asiassa paljon harvinaisempaa kuin palautuminen, on odottamaton ja vaatii siksi selitystä. Tämän suuntauksen havaitseminen sekä transkriptomi- että fluksomianalyyseissä viittaa yleiseen taustalla olevaan mekanismiin, jonka ehdotamme olevan PC > TC:n esiintyminen. Geometrisesti on ilmeistä, että kun PC > TC, GC:n on käännyttävä PC:hen (vasemmanpuoleinen ja keskimmäinen kaavio ylärivillä kuvassa 3a). Sitä vastoin, kun PC < TC, kääntäminen ja vahvistaminen ovat yhtä todennäköisiä, jos mitään muuta vinoutumaa ei ole (vasemmanpuoleinen ja keskimmäinen kaavio alarivillä kuvassa 3a). Olkoon todennäköisyys PC > TC q (> 0). CRI/CRV:n odotetaan olevan / = (1 – q)/(1 + q) < 1. Toisin sanoen, niin kauan kuin PC > TC muutamien ominaisuuksien kohdalla, käännyttämisen odotetaan olevan yleisempää kuin vahvistamisen (jos muuta harhaa ei ole).
Kuva 3
Syy fenotyyppisen palautumisen ylivoimaisuuteen sopeutumisessa. a Mallia havainnollistava kaavio. Ylempi osa osoittaa, että jos plastinen muutos (PC) on suurempi kuin kokonaismuutos (TC), geneettisen muutoksen (GC) on kumottava PC (vasen ja keskimmäinen kaavio). Yksi syy siihen, että PC > TC, on se, että vaiheissa o ja p olevien organismien välinen kuntoero on suurempi kuin vaiheiden o ja a välinen (oikea kaavio). Alempi osa osoittaa, että jos PC < TC, GC joko vahvistaa tai kääntää PC:n päinvastaiseksi (vasen ja keskimmäinen kaavio). Näin voi tapahtua, jos vaiheissa o ja p olevien organismien välinen kuntoero on pienempi kuin vaiheissa o ja a (oikea kaavio) tai jos fenotyyppi ei ole yhteydessä kuntoon. b Niiden geenien osuus, joiden ilmentymä PC > TC kunkin 44 kokeellisen evolutiivisen sopeutumisen aikana. c Niiden reaktioiden osuus, joilla on PC > TC kunkin E. coli -bakteerin metabolisen sopeutumisen aikana glukoosiympäristöstä 50 uuteen ympäristöön. d Metabolisen verkostoanalyysin ennustama kunto vaiheessa p ja kunto vaiheessa a suhteessa kuntoihin vaiheessa o kunkin c-kohdassa esitetyn 50 sopeutumisen osalta. Katkoviiva kuvaa kuntoa vaiheessa o. e Kaikkien virtausten keskimääräinen PC korreloi negatiivisesti suhteelliseen kuntoon vaiheessa p (fp) 50:ssä c:n sopeutumisessa. f TC:n keskiarvo kaikissa virtauksissa korreloi positiivisesti suhteellisen kunnon kanssa vaiheessa a (fa) 50 sopeutumisen joukossa c:ssä
Etsiäksemme empiiristä todistusaineistoa edellä esitetylle selitykselle laskimme jokaisesta 44:stä kokeellisen evoluution tapauksesta niiden geenien osuuden, joiden ilmentymismuutokset täyttävät PC:n > TC:n tunnusluvun (kuva 3b). Fraktioiden keskiarvo on 0,51 ja mediaani 0,48. Lisäksi sen jälkeen, kun olemme poistaneet kaikki geenit, joiden osalta PC > TC, ei ole enää ylimääräistä palautumista (täydentävä kuva 5a), mikä osoittaa selityksemme riittävyyden. Vastaavasti laskimme niiden metabolisten reaktioiden osuuden, joissa on PC > TC E. colin metabolisen verkon sopeutumisessa glukoosiympäristöstä kuhunkin 50 uudesta ympäristöstä (kuva 3c). Fraktioiden keskiarvo on 0,85 ja mediaani 0,93. Vastaavasti sen jälkeen, kun poistettiin reaktiot, joissa esiintyi PC > TC, ei ole havaittavissa yleistä suuntausta, jonka mukaan 50 sopeutumisessa olisi enemmän palautumista kuin vahvistumista (täydentävä kuva 5b). Nämä transkriptomi- ja fluksomitulokset tukevat sitä, että palautumisen ylijäämä suhteessa vahvistumiseen on selitettävissä PC > TC:n esiintymisellä ei-vähäksyttävissä murto-osissa ominaisuuksista.
Miksi PC ylittää TC:n monien ominaisuuksien osalta? Todennäköinen syy on se, että PC:n avulla organismit voivat selviytyä äkillisestä ympäristömuutoksesta, mutta kunto on paljon heikompi kuin alkuperäisessä ympäristössä ja uuteen ympäristöön sopeutumisen jälkeen. Näin ollen organismien yleinen fysiologinen tila voi olla melko samanlainen alkuperäisessä ja uudessa ympäristössä sopeutuneiden vaiheiden välillä, mutta se on paljon erilainen matalan kelpoisuuden muovautumisvaiheessa heti ympäristömuutoksen jälkeen. Tämä saattaa selittää, miksi PC ylittää TC:n monien ominaisuuksien osalta riippumatta siitä, ovatko ominaisuuksien arvot organismin kelpoisuuden ja fysiologian syitä vai seurauksia.
Löysimme vahvaa näyttöä edellä mainitulle mallille metabolisen verkostoanalyysin avulla. Ensiksi, käyttämällä ennustettua biomassan tuotantonopeutta kuntoarvona, vertasimme E. colin kuntoa plastisessa vaiheessa (fp) ja uuteen ympäristöön sopeutumisen jälkeen (fa) suhteessa kuntoon alkuperäisessä glukoosiympäristössä kunkin 50 uuteen ympäristöön sopeutumisen kohdalla. Kaikissa tapauksissa fp < 1 (kuva 3d), mikä vahvistaa, että ympäristömuutokset aiheuttavat kunnon laskua ennen geneettistä sopeutumista. Havaitsimme, että fa on tyypillisesti lähellä 1, vaikka muutamassa uudessa ympäristössä se on paljon >1 (kuva 3d). Log10-asteikolla fp poikkeaa enemmän 1:stä kuin fa 43:ssa 50:stä sopeutumisesta (P = 1,0 × 10-7; yksisäikeinen binomitesti). Toiseksi, mallissamme oletetaan, että vuon muutosten ja kuntomuutosten välillä on yhteys22. Glukoosiympäristön 50 sopeutumisessa fp:n ja keskimääräisen PC:n välillä on vahva negatiivinen korrelaatio (Spearmanin ρ = -0.98, P < 10-300; kuva 3e). Fa:n ja keskimääräisen TC:n välillä on päinvastainen korrelaatio (ρ = 0,57, P = 1,1 × 10-5; kuva 3f). Yhdessä analyysimme osoittavat, että ensisijainen syy siihen, että fenotyyppinen palautuminen on yleisempää kuin vahvistuminen sopeutumisen aikana, on se, että kelpoisuuden ja siihen liittyvien fenotyyppien kannalta vaiheessa p olevat organismit eroavat enemmän kuin vaiheessa a olevat, kun niitä verrataan vaiheessa o oleviin organismeihin.
Fenotyyppinen palautuminen satunnaisissa aineenvaihduntaverkoissa
Geenien ilmentymistason PC:t ja GC:t sopeutumisen aikana riippuvat vastaavasti säätelyverkostosta ja metabolisesta verkostosta kyseisessä lajissa. Koska nämä verkostot ovat tulosta miljardien vuosien evoluutiosta, herää kysymys, johtuuko fenotyyppisen palautumisen vallitsevuus tutkittavan lajin evoluutiohistoriasta, erityisesti ympäristöistä, joihin laji ja sen esi-isät ovat valikoituneet menneisyydessä, vai minkä tahansa funktionaalisen järjestelmän luontaisesta ominaisuudesta. Vastataksemme tähän kysymykseen sovelsimme samaa analyysia 500 funktionaaliseen satunnaiseen metaboliseen verkkoon, jotka oli aiemmin luotu22. Nämä verkostot muodostettiin iAF1260:stä vaihtamalla sen reaktioita satunnaisesti valittuihin reaktioihin Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes38:n kaikkien metabolisten reaktioiden universumista, kunhan verkoston FBA-ennustettu kunto glukoosiympäristössä on nollasta poikkeava jokaisen reaktiovaihdon yhteydessä39.
Vähintään 20 uutta ympäristöä, joihin iAF1260 voi sopeutua (glukoosiympäristöstä), sopeutuu vähintään 20:een 500 satunnaisverkostosta. Analysoimme siis satunnaisverkkojen sopeutumista kuhunkin näistä 20 uudesta ympäristöstä, kun glukoosiympäristö on alkuperäinen ympäristö. Kunkin uuden ympäristön osalta kaikkien tähän ympäristöön sopeutuvien satunnaisverkkojen CRV:n mediaani on yleensä noin 0,1 (laatikkodiagrammit kuvassa 4a), ja CRV:n mediaanin mediaani on 0,11. Sitä vastoin kaikkien satunnaisverkkojen CRI:n mediaani uudessa ympäristössä on yleensä alle 0,01 (kuvan 4b ruutukuvio), ja CRI:n mediaanin mediaani on 0,0033. CRI/CRV-suhteen mediaani satunnaisverkoissa uudessa ympäristössä on yleensä alle 0,05 (kuvan 4c ruutupiirros), ja CRI/CRV:n mediaanin mediaani on 0,0033. On selvää, että virtauksen palautumisen ylivoimaisuus on ilmeistä myös toiminnallisissa satunnaisverkoissa, mikä viittaa siihen, että tämä ominaisuus on luontainen kaikille toiminnallisille aineenvaihdunnallisille verkoille eikä niinkään tietyn evoluutiohistorian tuote. Mekanistinen selitys tälle ominaisuudelle todellisissa organismeissa (kuva 3) pätee myös tässä tutkituissa satunnaisissa metabolisissa verkoissa. Erityisesti niiden reaktioiden osuus, joissa PC > TC, on huomattava (kuva 4d) ja fp on useimmiten pienempi kuin 1 (kuva 4e). Lisäksi fp poikkeaa yleensä enemmän 1:stä kuin fa log10-asteikolla, koska |log10fp|-|log10fa| on suurelta osin positiivinen (kuva 4f).
Virtauksen palautumisen ylivoimaisuus satunnaisissa aineenvaihdunnallisissa verkoissa. Niiden reaktioiden osuudet, joissa on havaittavissa flux reversion (CRV) (a), niiden reaktioiden osuudet, joissa on havaittavissa flux reinforcement (CRI) (b), CRI/CRV-suhteet (c), niiden reaktioiden osuus, joissa on havaittavissa PC > TC (d), fp (e) ja |log10fp| – |log10fa| (f) satunnaisten verkostojen sopeutumisessa glukoosiympäristöstä kuhunkin 20:stä uudesta tutkitusta ympäristöstä. Kunkin uuden ympäristön osalta eri satunnaisverkoista estimoidut arvot on esitetty laatikkokuviona, ja symbolit on selitetty kuvan 2d legendassa. Vastaavat arvot E. coli iAF1260 -verkolle on esitetty punaisilla vinoneliöillä
Huomionarvoista on kuitenkin se, että 20:stä uudesta ympäristöstä 19:ssä E. coli -metaboliaverkon CRV ylittää satunnaisverkkojen CRV:n mediaanin (Kuva 4a). Samanlainen mutta vähemmän selvä suuntaus koskee CRI:tä (kuva 4b). E. colin CRI/CRV on 16:ssa 20:stä uudesta ympäristöstä pienempi kuin satunnaisverkkojen CRI/CRV:n mediaani (P = 0,012, kaksinapainen binomitesti; kuva 4c). Näin ollen, vaikka sekä E. colin aineenvaihdunnallisessa verkossa että satunnaisverkoissa on vallitsevana flux reversion -ilmiö, tämä ilmiö on voimakkaampi E. colissa. Mekanistisesti tämä ero on selitettävissä ainakin kvalitatiivisesti edellisessä jaksossa esitetyllä mallillamme. Tarkemmin sanottuna 20 uudesta ympäristöstä 15:ssä E. coli -reaktioiden osuus, joissa PC > TC, ylittää satunnaisverkoissa vastaavan mediaaniosuuden (P = 0,021, yksisäikeinen binomitesti; kuva 4d). Kaikissa 20 uudessa ympäristössä E. colin fp on pienempi kuin satunnaisverkkojen fp:n mediaani (P = 9,5 × 10-7, yksisäikeinen binomitesti; kuva 4e). 20 uudesta ympäristöstä 19:ssä E. coli – E. coli -bakteerin |log10 fp| – |log10 fa| on suurempi kuin vastaava mediaaniarvo satunnaisverkoissa (P = 2,0 × 10-5, yksisäikeinen binomitesti; kuva 4f). Mutta miksi E. colin fp on pienempi kuin satunnaisverkkojen? Yksi mahdollinen selitys on, että E. colin metabolisen verkoston koostumus ja rakenne on evolutiivisesti optimoitu kasvuun glukoosiympäristössä ja/tai siihen liittyvissä ympäristöissä, kun taas sama ei päde satunnaisverkostoihin, joiden edellytettiin olevan elinkelpoisia vain glukoosiympäristössä. Kun glukoosi korvataan uudessa ympäristössä uudella hiililähteellä, E. colin kunto laskee huomattavasti, mutta satunnaisverkostojen kunto saattaa laskea vain vähän. Vaikka absoluuttinen kunto muovivaiheessa voi hyvinkin olla E. colilla korkeampi kuin satunnaisverkoilla, suhteellisen kunnon, joka on fp, odotetaan olevan E. colilla alhaisempi kuin satunnaisverkoilla. Siten fluksin palautumisen suurempi yleisyys suhteessa vahvistumiseen E. colilla kuin satunnaisverkoilla on todennäköisesti sivutuote E. colin voimakkaammasta valikoitumisesta satunnaisverkkoihin verrattuna alkuperäisessä ympäristössä, jota käytimme sopeutumisanalyysissämme.
Reversio on vähintään yhtä yleinen kuin vahvistuminen jopa ominaisuuksissa, joilla on huomattava TC
Edellä olevissa transkriptomianalyyseissä (kuva 1d) ja fluksomianalyyseissä (kuva 2 a) otimme huomioon kaikki ominaisuudet, joilla on havaittavissa havaittavissa olevat PC:t ja GC:t. Vertailevissa ja evoluutiotutkimuksissa vaiheessa p olevat fenotyypit ovat kuitenkin tyypillisesti saavuttamattomissa. Tämän vuoksi vertailevat ja evoluutiobiologit keskittyvät yleensä ominaisuuksiin, joiden fenotyyppiset arvot eroavat vaiheiden o ja a välillä, huolimatta siitä, että myös muut ominaisuudet ovat voineet kokea adaptiivisia muutoksia (vaiheen p arvoista vaiheen a arvoihin). Tutkiaksemme, soveltuvatko edellä esitetyt havaintomme ominaisuuksiin, jotka ovat useimpien vertailevien ja evoluutiobiologien aiheena, keskitymme edellä analysoitujen ominaisuuksien osajoukkoon, joka täyttää ehdon TC > 0,2Lo. Kokeellisen evoluution 44 tapauksesta 33:ssa havaittiin CRV > CRI (P = 0,0013, kaksinapainen binomitesti), joista 30:ssä CRV ylittää CRI:n merkitsevästi (nimellinen P < 0,05; kaksinapainen binomitesti; kuva 5a). Glukoosiympäristöstä peräisin olevista E. coli -metaboliaverkoston 50 ympäristöadaptaatiosta kolmessa tapauksessa oli yhtä monta virtauksen palautumista ja vahvistumista. Jäljelle jäävistä 47 tapauksesta 22:ssa oli enemmän palautumista kuin vahvistumista, kun taas 25:ssä oli päinvastoin (P = 0,77, kaksoishäntäinen binomitesti; kuva 5b). Kun CRI eroaa merkitsevästi CRV:stä, 15 tapauksessa CRV < CRI, kun taas 11 tapauksessa CRV < CRI oli päinvastainen (P = 0,70, kaksinapainen binomitesti; kuva 5b). Näin ollen jopa niiden ominaisuuksien joukossa, joissa TC > 0,2Lo, ei ole näyttöä siitä, että vahvistuminen olisi merkittävästi enemmän kuin kääntyminen. Huomionarvoista on, että edellä mainitussa metabolisessa analyysissä keskimäärin 139 reaktiota täytti TC > 0.2Lo per sopeutuminen. Koska kaikki kelpoisuuden maksimoinnissa havaitut virtausmuutokset ovat välttämättömiä ja siten määritelmällisesti hyödyllisiä, jopa sopeutuminen yksinkertaiseen hiililähteen muutokseen käsittää ilmeisesti paljon enemmän kuin muutaman reaktion.
Vahvistavien piirteiden osuus (CRI) ei ole sopeutumisissa yhtään suurempi kuin käänteisten piirteiden osuus (CRV) silloinkin, kun kokonaismuutos ylittää asetetun raja-arvon. Ominaisuudet, jotka täyttävät |La – Lo| > 0.2Lo, |Lp – Lo| > 0.2Lo ja |La – Lp| > 0.2Lo, luokitellaan vahvistaviin ja kääntäviin ominaisuuksiin sen perusteella, ovatko geneettiset ja plastiset muutokset samansuuntaisia vai vastakkaissuuntaisia. a Niiden geenien osuudet, joiden ilmentymismuutokset ovat vahvistavia ja joiden ilmentymismuutokset ovat käänteentekeviä, vastaavassa suhteessa kokeellisessa evoluutiossa. Organismit sekä uudet ympäristöt, joihin organismit sopeutuivat, on merkitty. Kukin palkki edustaa yhtä sopeutumista. b Niiden reaktioiden fraktiot, joissa on ennustettu vahvistavia ja käänteisiä vuonmuutoksia E. colin sopeutumisessa 50 uuteen ympäristöön glukoosiympäristöstä. Molemmissa paneeleissa vahvistavien ja käänteisten reaktioiden osuuksien yhtäläisyys on testattu kaksoishäntäisellä binomitestillä. Kun CRV > CRI, P-arvot ilmoitetaan seuraavasti: *Kun CRV < CRI, P-arvot merkitään seuraavasti: oP < 0,05; ooP < 0,05; ooP < 10-10; oooP < 10-10; oooP < 10-100
.