Prävalenz der Expressionsreversion in der experimentellen Evolution

Wir haben fünf Studien identifiziert, die sechs verschiedene Anpassungsexperimente durchgeführt und Transkriptomdaten gesammelt haben, die sich für unsere Analyse eignen. Zu diesen sechs Experimenten gehörten 10 Wiederholungen von E. coli, die sich an eine Hochtemperaturumgebung anpassten17, 6 Wiederholungen eines anderen E. coli-Stamms, der sich an eine Hochtemperaturumgebung anpasste18, 7 Wiederholungen von E. coli, die sich an ein Glycerinmedium anpassten16, 7 Wiederholungen von E. coli, die sich an ein Laktatmedium anpassen16, je 1 Wiederholung von 12 verschiedenen Hefestämmen (Saccharomyces cerevisiae), die sich an ein Xylulosemedium anpassen19, und 2 Wiederholungen von Guppys (Poecilia reticulata), die sich an eine Umgebung mit geringer Prädation anpassen15. Insgesamt analysierten wir 44 Fälle von Anpassung.

In jedem Fall wurden Transkriptomdaten für die Organismen in der ursprünglichen Umgebung (o für das ursprüngliche Stadium), kurz nach ihrer Exposition in der neuen Umgebung (p für das plastische Stadium) und am Ende der experimentellen Entwicklung in der neuen Umgebung (a für das angepasste Stadium; Abb. 1a) gesammelt. Man beachte, dass die Zeit zwischen o und p so kurz ist, dass kein neu entstandenes Allel im Stadium p eine nennenswerte Häufigkeit erreicht haben dürfte, um den durchschnittlichen Phänotyp der Population zu beeinflussen. Das Expressionsniveau eines jeden Gens wird als Merkmal behandelt. Die Expressionsniveaus eines Gens in den Stadien o, p und a seien Lo, Lp bzw. La. In jedem Experiment haben wir zunächst Gene mit nennenswerten PC im Expressionsniveau identifiziert, indem wir verlangten, dass PC = |Lp-Lo| größer als ein vorgegebener Grenzwert ist. Wir identifizierten auch Gene mit nennenswerten GCs im Expressionsniveau, indem wir verlangten, dass GC = |La-Lp| größer als der gleiche voreingestellte Grenzwert ist. Bei den Genen, die sowohl nennenswerte PC als auch nennenswerte GC aufweisen, fragen wir, ob die beiden Veränderungen in dieselbe Richtung (d. h. Verstärkung) oder in entgegengesetzte Richtungen (d. h. Umkehrung; Abb. 1b, c) gehen. Als Grenzwert für die obige Analyse wurden 20 % des ursprünglichen Genexpressionsniveaus (d. h. 0,2Lo) verwendet. Der Anteil der Gene, die eine Verstärkung des Expressionsniveaus aufweisen (CRI), ist in 42 der 44 Anpassungen kleiner als der Anteil der Gene, die eine Umkehrung aufweisen (CRV), und der Unterschied zwischen CRI und CRV ist in 40 dieser 42 Fälle signifikant (nominaler P < 0,05; zweiseitiger Binomialtest; Abb. 1d). Bei den beiden Anpassungen mit CRI > CRV ist der Unterschied nur in einem Fall signifikant (Abb. 1d). Das allgemeine Überwiegen der Umkehrung des Expressionsniveaus (d. h. 42 von 44 Fällen) bei der Anpassung ist statistisch signifikant (P = 1,1 × 10-10, zweiseitiger Binomialtest). Derselbe Trend zeigt sich, wenn der Cutoff auf 0,05Lo (ergänzende Abb. 1a) oder 0,5Lo (ergänzende Abb. 2a) geändert wird, was darauf hindeutet, dass das obige Ergebnis robust gegenüber der Wahl des Cutoffs ist. Die transkriptomischen Daten unterstützen eindeutig nicht die Hypothese, dass Plastizität im Allgemeinen die genetische Anpassung erleichtert.

Metabolische Flussumkehr bei Umweltanpassungen

Um die Allgemeingültigkeit des obigen Ergebnisses zu bewerten und die zugrundeliegende Ursache zu verstehen, haben wir den Vergleich zwischen phänotypischer Verstärkung und Umkehr auf metabolische Flüsse ausgeweitet (siehe Einleitung). Da unsere Stoffwechselanalyse nicht dazu gedacht ist, die oben beschriebene experimentelle Entwicklung oder Expressionsänderungen zu modellieren, stehen die verwendeten Parameter in keinem Zusammenhang mit der experimentellen Entwicklung. Konkret haben wir mit Hilfe von iAF1260, dem rekonstruierten E. coli-Stoffwechselnetz23 , die Veränderungen der plastischen und genetischen Flüsse während der Umweltanpassung rechnerisch vorhergesagt. Mit Hilfe der Flux-Balance-Analyse (FBA) sagten wir die optimierten Flüsse vollständig angepasster Organismen in der ursprünglichen (Stadium o) bzw. der neuen (Stadium a) Umgebung voraus, wobei wir davon ausgingen, dass die Biomasseproduktionsrate, die stellvertretend für die Fitness steht, durch natürliche Selektion maximiert wird20. FBA-Vorhersagen stimmen recht gut mit experimentellen Messungen für Organismen überein, die an ihre Umwelt angepasst sind24,25,26,27,28,29 und werden häufig bei der Untersuchung von Genotyp-Umwelt-Phänotyp-Beziehungen verwendet22,27,29,30,31,32,33,34,35,36,37. Bei der Vorhersage von Veränderungen des plastischen Flusses bei Umweltveränderungen (Stufe p) verwendeten wir die Minimierung der metabolischen Anpassung (MOMA) anstelle der FBA, da MOMA die unmittelbare Flussreaktion auf Störungen besser wiedergibt21 (siehe Methoden). Wir behandelten den Fluss jeder Reaktion im Stoffwechselnetzwerk als Eigenschaft und modellierten Umweltveränderungen durch Veränderung der dem Netzwerk zur Verfügung stehenden Kohlenstoffquelle. In iAF1260 gibt es 258 verschiedene Austauschreaktionen, die jeweils eine andere Kohlenstoffquelle transportieren. Wir untersuchten daher 258 verschiedene Umgebungen mit einer einzigen Kohlenstoffquelle.

Wir begannen die Analyse mit Glukose als Kohlenstoffquelle in der ursprünglichen Umgebung, da diese Umgebung der Maßstab für die Konstruktion von iAF1260 war23. Anschließend haben wir die Anpassungen von E. coli an 257 neue Umgebungen mit jeweils einer anderen Kohlenstoffquelle untersucht. Wir fanden heraus, dass diese neuen Umgebungen bei der von MOMA vorhergesagten Biomasseproduktionsrate, einem Näherungswert für die Fitness im Stadium p (fp), auf natürliche Weise in zwei Gruppen unterteilt sind (ergänzende Abb. 3). Eine Gruppe zeigt fp < 10-4, was darauf hindeutet, dass E. coli in diesen neuen Umgebungen wahrscheinlich nicht überleben wird. Wir konzentrierten uns daher auf die verbleibenden 50 neuen Umgebungen mit fp > 10-4, an die sich E. coli vermutlich anpassen kann (ergänzende Tabelle 1).

Bei der Definition von Flussverstärkung und Reversion und der Verwendung des Grenzwerts von 0,2Lo wie bei der Transkriptomanalyse fanden wir heraus, dass CRV bei jeder Anpassung signifikant größer als CRI ist (nominaler P < 10-10, zweiseitiger Binomialtest). Die Zufallswahrscheinlichkeit, dass alle 50 Anpassungen CRV > CRI aufweisen, beträgt 1,8 × 10-15 (zweiseitiger Binomialtest; Abb. 2a), was auf eine allgemeine Vorherrschaft der Flussumkehr hinweist. Der Mittelwert und der Medianwert von CRV liegen bei 30,2 % bzw. 30,5 %, während die Werte für CRI nur 1,0 % bzw. 0,8 % betragen. Der obige Trend bleibt bestehen, wenn wir den Grenzwert auf 0,05Lo (ergänzende Abb. 1b) oder 0,5Lo (ergänzende Abb. 2b) ändern. Da ein FBA- oder MOMA-Problem mehrere Lösungen haben kann, könnte die Reihenfolge der Reaktionen in der stöchiometrischen Matrix die vom Löser gelieferte spezifische Lösung beeinflussen. Als wir jedoch die Reaktionsreihenfolge in iAF1260 zufällig umstellten, blieb das allgemeine Muster von CRV > CRI unverändert (ergänzende Abb. 4a). Da die von MOMA geforderte quadratische Programmierung schwieriger zu lösen ist als die in FBA verwendete lineare Programmierung, könnte CRV im Vergleich zu CRI überschätzt worden sein. Um dieses potenzielle Problem zu beheben, entwickelten wir eine auf quadratischer Programmierung basierende MOMA mit der Bezeichnung „MOMA-b“ und verwendeten sie anstelle der FBA zur Vorhersage der Flüsse im Stadium a (siehe Methoden), stellten jedoch fest, dass CRV immer noch höher ist als CRI (siehe ergänzende Abb. 4b). Dieser Trend ist also kein technisches Artefakt des Unterschieds zwischen MOMA und FBA.

Flussumkehr stellt die ursprünglichen Flüsse weitgehend wieder her

Vorherrschaft der Flussumkehr unabhängig von der ursprünglichen Umgebung

Um die Allgemeingültigkeit unserer Feststellung der Vorherrschaft der Flussumkehr zu untersuchen, untersuchten wir auch Anpassungen mit einer ursprünglichen Umgebung ohne Glukose. Für viele ursprüngliche Umgebungen sind jedoch nur wenige neue Umgebungen durch das E. coli-Stoffwechselnetz adaptierbar. Wir konzentrierten uns daher auf 41 ursprüngliche Umgebungen (einschließlich der zuvor verwendeten Glukose-Umgebung), die jeweils mehr als 20 anpassungsfähige (d. h. fp > 10-4) neue Umgebungen aufweisen (ergänzende Tabelle 2). Für jede dieser ursprünglichen Umgebungen berechneten wir das CRI/CRV-Verhältnis für jede anpassungsfähige neue Umgebung und stellten fest, dass es in der Regel unter 0,1 lag (Abb. 2d). Anschließend berechneten wir den Median von CRI/CRV für alle anpassbaren neuen Umgebungen jeder ursprünglichen Umgebung. Bei den 41 Originalumgebungen liegt der größte Median CRI/CRV bei 0,11 und der Median des Median CRI/CRV bei nur 0,02. Unabhängig von der ursprünglichen Umgebung ist also bei genetischen Anpassungen an neue Umgebungen die Flussumkehr viel häufiger als die Verstärkung.

Warum ist die phänotypische Umkehr häufiger als die Verstärkung

Unsere Feststellung, dass die phänotypische Verstärkung nicht nur nicht häufiger, sondern sogar viel seltener ist als die Umkehr, ist unerwartet und erfordert daher eine Erklärung. Die Beobachtung dieses Trends sowohl in transkriptomischen als auch in fluxomischen Analysen deutet auf einen allgemeinen zugrundeliegenden Mechanismus hin, von dem wir annehmen, dass es sich um das Auftreten von PC > TC handelt. Geometrisch gesehen ist es offensichtlich, dass, wenn PC > TC, die GC die PC umkehren muss (linkes und mittleres Diagramm in der oberen Reihe in Abb. 3a). Im Gegensatz dazu sind bei PC < TC Umkehrung und Verstärkung gleich wahrscheinlich, wenn keine andere Verzerrung vorliegt (das linke und mittlere Diagramm in der unteren Reihe in Abb. 3a). Die Wahrscheinlichkeit von PC > TC sei q (> 0). Es wird erwartet, dass CRI/CRV / = (1 – q)/(1 + q) < 1 ist. Mit anderen Worten: Solange PC > TC für einige wenige Merkmale ist, wird erwartet, dass Reversion häufiger ist als Verstärkung (ohne andere Verzerrung).

Um empirische Beweise für die obige Erklärung zu finden, haben wir für jeden der 44 Fälle experimenteller Evolution den Anteil der Gene berechnet, deren Expressionsänderungen PC > TC erfüllen (Abb. 3b). Der Mittelwert und der Medianwert liegen bei 0,51 bzw. 0,48. Nachdem wir alle Gene entfernt haben, für die PC > TC gilt, gibt es keinen Überschuss an Umkehrung mehr (ergänzende Abb. 5a), was zeigt, dass unsere Erklärung ausreichend ist. In ähnlicher Weise berechneten wir den Anteil der Stoffwechselreaktionen mit PC > TC bei der Anpassung des E. coli-Stoffwechselnetzes von der Glukoseumgebung an jede der 50 neuen Umgebungen (Abb. 3c). Der Mittelwert und der Medianwert liegen bei 0,85 bzw. 0,93. Auch nach Abzug der Reaktionen, die PC > TC aufweisen, gibt es keinen allgemeinen Trend zu mehr Umkehrung als Verstärkung über die 50 Anpassungen hinweg (ergänzende Abb. 5b). Diese Transkriptom- und Fluxom-Ergebnisse unterstützen, dass der Überschuss an Umkehrung im Vergleich zu Verstärkung durch das Auftreten von PC > TC für einen nicht zu vernachlässigenden Anteil von Merkmalen erklärbar ist.

Warum übersteigt PC bei vielen Merkmalen TC? Ein wahrscheinlicher Grund ist, dass PC es den Organismen ermöglichen, bei einer plötzlichen Umweltveränderung zu überleben, aber die Fitness ist im Vergleich zu derjenigen in der ursprünglichen Umgebung und derjenigen nach der Anpassung an die neue Umgebung stark reduziert. So kann der physiologische Gesamtzustand der Organismen zwischen den angepassten Stadien in der ursprünglichen und der neuen Umgebung recht ähnlich sein, ist aber in dem plastischen Stadium mit geringer Fitness direkt nach der Umweltveränderung sehr unterschiedlich. Dies könnte erklären, warum der PC bei vielen Merkmalen den TC übersteigt, unabhängig davon, ob die Merkmalswerte Ursachen oder Folgen der Fitness und Physiologie des Organismus sind.

Wir fanden starke Belege für das obige Modell durch die Analyse des metabolischen Netzwerks. Zunächst verglichen wir unter Verwendung der vorhergesagten Biomasseproduktionsrate als Stellvertreter für die Fitness die E. coli-Fitness im plastischen Stadium (fp) und die nach der Anpassung an eine neue Umgebung (fa) im Verhältnis zu derjenigen in der ursprünglichen Glukoseumgebung für jede der Anpassungen an die 50 neuen Umgebungen. In allen Fällen war fp < 1 (Abb. 3d), was bestätigt, dass Umweltveränderungen zu einem Rückgang der Fitness führen, bevor eine genetische Anpassung erfolgt. Wir haben festgestellt, dass fa in der Regel nahe bei 1 liegt, obwohl es in einigen neuen Umgebungen viel >1 ist (Abb. 3d). Auf einer log10-Skala ist fp in 43 der 50 Anpassungen weiter von 1 entfernt als fa (P = 1,0 × 10-7; einseitiger Binomialtest). Zweitens geht unser Modell von einem Zusammenhang zwischen Flussänderungen und Fitnessänderungen aus22. Bei den 50 Anpassungen aus der Glukose-Umgebung gibt es eine starke negative Korrelation zwischen fp und dem mittleren PC (Spearman’s ρ = -0.98, P < 10-300; Abb. 3e). Eine entgegengesetzte Korrelation besteht zwischen fa und dem mittleren TC (ρ = 0,57, P = 1,1 × 10-5; Abb. 3f). Zusammengenommen zeigen unsere Analysen, dass der Hauptgrund für eine höhere Häufigkeit der phänotypischen Reversion als der Verstärkung während der Anpassung darin liegt, dass sich Organismen im Stadium p im Hinblick auf ihre Fitness und die damit verbundenen Phänotypen stärker von denen im Stadium a unterscheiden als von denen im Stadium o.

Phänotypische Reversion in zufälligen Stoffwechselnetzwerken

Die PC und GC im Niveau der Genexpression und im Stoffwechselfluss während der Anpassungen hängen vom regulatorischen Netzwerk bzw. vom Stoffwechselnetzwerk der betreffenden Art ab. Da diese Netzwerke das Ergebnis von Milliarden von Jahren der Evolution sind, stellt sich die Frage, ob das Vorherrschen der phänotypischen Reversion auf die Evolutionsgeschichte der untersuchten Art zurückzuführen ist, insbesondere auf die Umgebungen, in denen die Art und ihre Vorfahren in der Vergangenheit selektiert wurden, oder ob es sich um eine intrinsische Eigenschaft eines funktionellen Systems handelt. Um diese Frage zu klären, haben wir dieselbe Analyse auf 500 funktionelle zufällige Stoffwechselnetze angewandt, die zuvor erstellt worden waren22. Diese Netzwerke wurden aus iAF1260 konstruiert, indem ihre Reaktionen mit zufällig ausgewählten Reaktionen aus dem Universum aller Stoffwechselreaktionen in der Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes38 ausgetauscht wurden, solange das Netzwerk bei jedem Reaktionstausch eine von Null abweichende, von der FBA vorhergesagte Fitness in der Glukose-Umgebung aufweist39.

Nur 20 neue Umgebungen, an die sich iAF1260 (aus der Glukose-Umgebung) anpassen kann, können von mindestens 20 der 500 zufälligen Netzwerke angepasst werden. Wir haben daher die Anpassungen der Zufallsnetzwerke an jede dieser 20 neuen Umgebungen analysiert, wobei die Glukose-Umgebung die ursprüngliche Umgebung war. Für jede neue Umgebung liegt der Median des CRV aller Zufallsnetzwerke, die sich an diese Umgebung anpassen können, im Allgemeinen bei 0,1 (Boxplots in Abb. 4a), wobei der Median des CRV 0,11 beträgt. Im Gegensatz dazu liegt der Median des CRI aller Zufallsnetze für eine neue Umgebung im Allgemeinen unter 0,01 (Boxplots in Abb. 4b), wobei der Median des CRI bei 0,0033 liegt. Der Median des CRI/CRV-Verhältnisses über zufällige Netze für eine neue Umgebung liegt im Allgemeinen unter 0,05 (Boxplot in Abb. 4c), wobei der Median des Median CRI/CRV 0,0033 beträgt. Die Vorherrschaft der Flussumkehr ist auch in funktionellen Zufallsnetzwerken offensichtlich, was darauf hindeutet, dass diese Eigenschaft jedem funktionellen Stoffwechselnetzwerk innewohnt und nicht nur ein Produkt bestimmter Evolutionsgeschichten ist. Die mechanistische Erklärung für diese Eigenschaft in tatsächlichen Organismen (Abb. 3) gilt auch für die hier untersuchten zufälligen Stoffwechselnetzwerke. Insbesondere ist der Anteil der Reaktionen, die PC > TC aufweisen, beträchtlich (Abb. 4d) und fp ist meist kleiner als 1 (Abb. 4e). Außerdem weicht fp im Allgemeinen stärker von 1 ab als fa in einer log10-Skala, da |log10fp|-|log10fa| größtenteils positiv ist (Abb. 4f).

Interessanterweise übersteigt die CRV im E. coli-Stoffwechselnetzwerk jedoch für 19 der 20 neuen Umgebungen den Median der CRV in den Zufallsnetzwerken (Abb. 4a). Ein ähnlicher, aber weniger offensichtlicher Trend gilt für den CRI (Abb. 4b). Für 16 der 20 neuen Umgebungen ist CRI/CRV von E. coli kleiner als der Median CRI/CRV der Zufallsnetzwerke (P = 0,012, zweiseitiger Binomialtest; Abb. 4c). Obwohl also sowohl das metabolische Netzwerk von E. coli als auch die Zufallsnetzwerke eine Vorherrschaft der Flussumkehr zeigen, ist dieses Phänomen in E. coli stärker ausgeprägt. Mechanistisch gesehen lässt sich diese Diskrepanz zumindest qualitativ durch unser Modell aus dem vorherigen Abschnitt erklären. Insbesondere übersteigt bei 15 der 20 neuen Umgebungen der Anteil der E. coli-Reaktionen mit PC > TC den entsprechenden Mediananteil in Zufallsnetzwerken (P = 0,021, einseitiger Binomialtest; Abb. 4d). Für alle 20 neuen Umgebungen ist fp von E. coli niedriger als der Median von fp der Zufallsnetzwerke (P = 9,5 × 10-7, einseitiger Binomialtest; Abb. 4e). Für 19 der 20 neuen Umgebungen ist |log10 fp| – |log10 fa| für E. coli größer als der entsprechende Medianwert für die Zufallsnetzwerke (P = 2,0 × 10-5, einseitiger Binomialtest; Abb. 4f). Aber warum ist fp bei E. coli niedriger als bei den Zufallsnetzwerken? Eine mögliche Erklärung ist, dass die Zusammensetzung und Struktur des E. coli-Stoffwechselnetzes evolutionär für das Wachstum in der Glukose-Umgebung und/oder in verwandten Umgebungen optimiert wurde, während dies für die zufälligen Netze, die nur in der Glukose-Umgebung lebensfähig sein mussten, nicht zutrifft. Wenn Glukose durch eine neue Kohlenstoffquelle in einer neuen Umgebung ersetzt wird, sinkt die Fitness von E. coli erheblich, die der Zufallsnetzwerke jedoch nur geringfügig. Obwohl die absolute Fitness in der plastischen Phase bei E. coli höher sein mag als bei den Zufallsnetzwerken, dürfte die relative Fitness, die fp ist, bei E. coli niedriger sein als bei den Zufallsnetzwerken. Daher ist die höhere Prävalenz der Flussumkehr im Vergleich zur Verstärkung bei E. coli im Vergleich zu den zufälligen Netzwerken wahrscheinlich ein Nebenprodukt der stärkeren Selektion von E. coli im Vergleich zu den zufälligen Netzwerken in der ursprünglichen Umgebung, die in unserer Anpassungsanalyse verwendet wurde.

Die Umkehr ist selbst bei Merkmalen mit nennenswertem TC mindestens so häufig wie die Verstärkung

In den vorangegangenen Analysen der Transkriptome (Abb. 1d) und Fluxome (Abb. 2a) haben wir alle Merkmale berücksichtigt, die nennenswerte PCs und GCs aufweisen. In vergleichenden und evolutionären Studien sind Phänotypen im Stadium p jedoch in der Regel unzugänglich. Daher konzentrieren sich vergleichende und Evolutionsbiologen in der Regel auf Merkmale, deren phänotypische Werte sich zwischen den Stadien o und a unterscheiden, obwohl die anderen Merkmale ebenfalls adaptive Veränderungen erfahren haben könnten (von den Werten im Stadium p zu denen im Stadium a). Um zu untersuchen, ob unsere obigen Erkenntnisse auf die Merkmale zutreffen, die Gegenstand der meisten vergleichenden und evolutiven Biologen sind, konzentrieren wir uns auf eine Teilmenge der oben analysierten Merkmale, die die Bedingung TC > 0,2Lo erfüllen. Von den 44 Fällen experimenteller Evolution zeigten 33 CRV > CRI (P = 0,0013, zweiseitiger Binomialtest), in 30 davon übersteigt CRV signifikant CRI (nominal P < 0,05; zweiseitiger Binomialtest; Abb. 5a). Von den 50 Umweltanpassungen des E. coli-Stoffwechselnetzes, die aus der Glukoseumgebung stammen, gab es in drei Fällen eine gleiche Anzahl von Flussumkehrungen und Verstärkungen. Von den übrigen 47 Fällen wiesen 22 mehr Umkehrung als Verstärkung auf, während 25 das Gegenteil zeigten (P = 0,77, zweiseitiger Binomialtest; Abb. 5b). Wenn sich CRI signifikant von CRV unterscheidet, zeigten 15 Fälle CRV < CRI, während 11 das Gegenteil zeigten (P = 0,70, zweiseitiger Binomialtest; Abb. 5b). Somit gibt es selbst bei den Merkmalen mit TC > 0,2Lo keinen Hinweis auf eine signifikant stärkere Verstärkung als eine Umkehrung. Bemerkenswert ist, dass in der obigen Stoffwechselanalyse im Durchschnitt 139 Reaktionen TC > 0,2Lo pro Anpassung erfüllten. Da alle Flussänderungen, die bei der Maximierung der Fitness beobachtet werden, erforderlich sind und daher per definitionem vorteilhaft sind, beinhaltet selbst die Anpassung an eine einfache Änderung der Kohlenstoffquelle offensichtlich viel mehr als nur ein paar Reaktionen.