Prevalencia de la reversión de la expresión en la evolución experimental

Identificamos cinco estudios que realizaron seis experimentos de adaptación diferentes y recogieron datos del transcriptoma que se ajustaban a nuestro análisis. Estos seis experimentos incluían 10 réplicas de E. coli adaptándose a un entorno de alta temperatura17, 6 réplicas de otra cepa de E. coli adaptándose a un entorno de alta temperatura18, 7 réplicas de E. coli adaptándose a un medio de glicerol16, 7 réplicas de E. coli adaptándose a un medio con lactato16, 1 réplica de cada una de las 12 cepas diferentes de levadura (Saccharomyces cerevisiae) adaptándose a un medio con xilulosa19, y 2 réplicas de guppies (Poecilia reticulata) adaptándose a un entorno de baja depredación15. En total, analizamos 44 casos de adaptación.

En cada caso, los datos del transcriptoma se recogieron respectivamente para los organismos en el entorno original (o para la etapa original), poco después de su exposición al nuevo entorno (p para la etapa plástica), y al concluir la evolución experimental en el nuevo entorno (a para la etapa adaptada; Fig. 1a). Obsérvese que el tiempo transcurrido entre o y p es tan corto que se espera que ningún alelo recién surgido haya alcanzado una frecuencia apreciable en el estadio p como para influir en el fenotipo medio de la población. El nivel de expresión de cada gen se trata como un rasgo. Dejemos que los niveles de expresión de un gen en los estadios o, p y a sean Lo, Lp y La, respectivamente. En cada experimento, primero identificamos los genes con PCs apreciables en el nivel de expresión requiriendo que PC = |Lp-Lo| sea mayor que un límite preestablecido. También identificamos los genes con CGs apreciables en el nivel de expresión exigiendo que CG = |La-Lp| fuera mayor que el mismo límite preestablecido. Para aquellos genes que muestran tanto PCs apreciables como GCs apreciables, preguntamos si los dos cambios están en la misma dirección (es decir, refuerzo) o en direcciones opuestas (es decir, reversión; Fig. 1b, c). Utilizamos el 20% del nivel de expresión génica original (es decir, 0,2Lo) como punto de corte en el análisis anterior. La fracción de genes que exhiben refuerzo del nivel de expresión (CRI) es menor que la fracción de genes que exhiben reversión (CRV) en 42 de las 44 adaptaciones, y la diferencia entre CRI y CRV es significativa en 40 de estos 42 casos (P nominal < 0,05; prueba binomial de dos colas; Fig. 1d). Entre las dos adaptaciones con CRI > CRV, su diferencia es significativa sólo en un caso (Fig. 1d). La preponderancia general de la reversión del nivel de expresión (es decir, 42 de 44 casos) en la adaptación es estadísticamente significativa (P = 1,1 × 10-10, prueba binomial de dos colas). La misma tendencia es evidente cuando el corte se altera a 0,05Lo (Fig. suplementaria 1a) o 0,5Lo (Fig. suplementaria 2a), lo que sugiere que el hallazgo anterior es robusto a la elección del corte. Claramente, los datos transcriptómicos no apoyan la hipótesis de que la plasticidad generalmente facilita la adaptación genética.

Reversión del flujo metabólico en las adaptaciones ambientales

Para evaluar la generalidad del hallazgo anterior y entender su causa subyacente, ampliamos la comparación entre el refuerzo fenotípico y la reversión a los flujos metabólicos (ver Introducción). Dado que nuestro análisis metabólico no pretende modelar la evolución experimental anterior ni los cambios de expresión, los parámetros utilizados no están relacionados con la evolución experimental. Específicamente, predecimos computacionalmente los cambios de flujo plásticos y genéticos durante las adaptaciones ambientales usando iAF1260, la red metabólica reconstruida de E. coli23. Utilizamos el análisis de equilibrio de flujos (FBA) para predecir los flujos optimizados de los organismos totalmente adaptados en el entorno original (fase o) y en el nuevo (fase a), respectivamente, bajo el supuesto de que la tasa de producción de biomasa, un indicador de la aptitud, se maximiza mediante la selección natural20. Las predicciones del FBA se ajustan razonablemente bien a las medidas experimentales para los organismos adaptados a sus entornos24,25,26,27,28,29 y se utilizan habitualmente en el estudio de las relaciones genotipo-ambiente-fenotipo22,27,29,30,31,32,33,34,35,36,37. Al predecir los cambios en el flujo plástico tras los cambios ambientales (etapa p), empleamos la minimización del ajuste metabólico (MOMA) en lugar del FBA porque el MOMA recapitula mejor la respuesta inmediata del flujo a las perturbaciones21 (ver Métodos). Tratamos el flujo de cada reacción en la red metabólica como un rasgo, y modelamos los cambios ambientales alterando la fuente de carbono disponible para la red. Hay 258 reacciones de intercambio distintas en iAF1260, cada una de las cuales transporta una fuente de carbono diferente. Por lo tanto, examinamos 258 entornos diferentes de una sola fuente de carbono.

Empezamos el análisis utilizando la glucosa como fuente de carbono en el entorno original, porque este entorno fue el punto de referencia en la construcción de iAF126023. A continuación, consideramos las adaptaciones de E. coli a 257 nuevos entornos, cada uno con una fuente de carbono diferente. Encontramos que estos nuevos ambientes están naturalmente separados en dos grupos en la tasa de producción de biomasa predicha por MOMA, un proxy para la aptitud en la etapa p (fp) (Fig. Suplementaria 3). Un grupo muestra fp < 10-4, lo que sugiere que es improbable que E. coli se mantenga en estos nuevos entornos. Por lo tanto, nos centramos en los restantes 50 nuevos ambientes con fp > 10-4, a la que E. coli puede presumiblemente adaptarse (Tabla Suplementaria 1).

Definiendo el refuerzo de flujo y la reversión y el uso de la corte de 0,2Lo como en el análisis del transcriptoma, encontramos CRV a ser significativamente mayor que el CRI (nominal P < 10-10, prueba binomial de dos colas) en cada adaptación. La probabilidad de que todas las 50 adaptaciones muestren CRV > CRI es de 1,8 × 10-15 (prueba binomial de dos colas; Fig. 2a), lo que sugiere un predominio general de la reversión del flujo. La media y la mediana de CRV son 30,2% y 30,5%, respectivamente, mientras que las de CRI son sólo 1,0% y 0,8%, respectivamente. La tendencia anterior se mantiene cuando modificamos el corte a 0,05Lo (Fig. suplementaria 1b) o a 0,5Lo (Fig. suplementaria 2b). Dado que un problema FBA o MOMA puede tener múltiples soluciones, el orden de las reacciones en la matriz estequiométrica podría afectar a la solución específica proporcionada por el solucionador. Sin embargo, cuando barajamos aleatoriamente el orden de las reacciones en iAF1260, el patrón general de CRV > CRI no se ve alterado (Supplementary Fig. 4a). Debido a que la programación cuadrática -requerida por MOMA- es más difícil de resolver que la programación lineal utilizada en FBA, el CRV podría haber sido sobreestimado en comparación con el CRI. Para rectificar este problema potencial, diseñamos un MOMA basado en programación cuadrática llamado «MOMA-b» y lo usamos en lugar de FBA para predecir los flujos en la etapa a (ver Métodos), pero encontramos que CRV aún excede a CRI (Fig. Suplementaria 4b). Por lo tanto, esta tendencia no es un artefacto técnico de la diferencia del solucionador entre MOMA y FBA.

La reversión del flujo restaura en gran medida los flujos originales

Predominio de la reversión del flujo independientemente del entorno original

Para investigar la generalidad de nuestro hallazgo del predominio de la reversión del flujo, también examinamos las adaptaciones con un entorno original sin glucosa. Sin embargo, para muchos entornos originales, sólo unos pocos entornos nuevos son adaptables por la red metabólica de E. coli. Así, nos centramos en 41 entornos originales (incluyendo el entorno de la glucosa utilizado anteriormente) que cada uno tiene más de 20 adaptables (es decir, fp > 10-4) nuevos entornos (Tabla Suplementaria 2). Para cada uno de estos ambientes originales, calculamos la relación CRI/CRV para cada ambiente nuevo adaptable, y encontramos que es típicamente menor a 0.1 (Fig. 2d). A continuación, calculamos la mediana de CRI/CRV en todos los nuevos entornos adaptables de cada entorno original. Entre los 41 entornos originales, la mayor mediana de CRI/CRV es 0,11 y la mediana de CRI/CRV es sólo 0,02. Por lo tanto, independientemente del entorno original, la reversión del flujo es mucho más frecuente que el refuerzo durante las adaptaciones genéticas a nuevos entornos.

¿Por qué la reversión fenotípica es más frecuente que el refuerzo

Nuestro hallazgo de que el refuerzo fenotípico no sólo no es más, sino que en realidad es mucho menos común que la reversión, es inesperado y por lo tanto exige una explicación. La observación de esta tendencia tanto en los análisis transcriptómicos como en los fluxómicos sugiere un mecanismo general subyacente, que proponemos sea la ocurrencia de PC TC. Geométricamente, es obvio que cuando PC > TC, el GC debe invertir el PC (los diagramas de la izquierda y del medio en la fila superior en la Fig. 3a). Por el contrario, cuando PC < TC, la reversión y el refuerzo son igualmente probables si no existe ningún otro sesgo (los diagramas de la izquierda y del medio en la fila inferior de la Fig. 3a). Dejemos que la probabilidad de PC > TC sea q (> 0). Se espera que CRI/CRV sea / = (1 – q)/(1 + q) < 1. En otras palabras, mientras PC TC para unos pocos rasgos, se espera que la reversión sea más frecuente que el refuerzo (bajo ningún otro sesgo).

Para buscar evidencia empírica de la explicación anterior, para cada uno de los 44 casos de evolución experimental, calculamos la fracción de genes cuyos cambios de expresión satisfacen PC > TC (Fig. 3b). Las fracciones media y mediana son 0,51 y 0,48, respectivamente. Además, después de eliminar todos los genes para los que PC TC, ya no hay un exceso de reversión (Supplementary Fig. 5a), lo que indica la suficiencia de nuestra explicación. De forma similar, calculamos la fracción de reacciones metabólicas que muestran PC > TC en la adaptación de la red metabólica de E. coli desde el entorno de la glucosa a cada uno de los 50 nuevos entornos (Fig. 3c). Las fracciones media y mediana son 0,85 y 0,93, respectivamente. Del mismo modo, después de la eliminación de las reacciones que muestran PC TC, no hay una tendencia general de más reversión que refuerzo a través de las 50 adaptaciones (Supplementary Fig. 5b). Estos resultados del transcriptoma y el fluxoma apoyan que el exceso de reversión en relación con el refuerzo es explicable por la ocurrencia de PC TC para fracciones no insignificantes de rasgos.

¿Por qué PC supera a TC para muchos rasgos? Una razón probable es que los PC permiten a los organismos sobrevivir a un cambio ambiental repentino, pero la aptitud se reduce mucho en comparación con la del entorno original, así como con la de después de la adaptación al nuevo entorno. Así, el estado fisiológico general de los organismos puede ser bastante similar entre las etapas adaptadas en el entorno original y en el nuevo, pero es muy diferente en la etapa plástica de baja aptitud justo después del cambio ambiental. Esto puede explicar por qué la PC supera a la TC para muchos rasgos, independientemente de si los valores de los rasgos son causas o consecuencias de la aptitud y la fisiología del organismo.

Encontramos una fuerte evidencia para el modelo anterior mediante el análisis de la red metabólica. En primer lugar, utilizando la tasa de producción de biomasa predicha como proxy de la aptitud, comparamos la aptitud de E. coli en la etapa plástica (fp) y la de después de la adaptación a un nuevo entorno (fa), en relación con la del entorno original de la glucosa, para cada una de las adaptaciones a los 50 nuevos entornos. En todos los casos, fp < 1 (Fig. 3d), lo que confirma que los cambios ambientales provocan caídas de la aptitud antes de la adaptación genética. Encontramos que fa es típicamente cercano a 1, aunque en unos pocos ambientes nuevos es mucho >1 (Fig. 3d). En una escala log10, fp es más diferente de 1 que fa en 43 de las 50 adaptaciones (P = 1,0 × 10-7; prueba binomial de una cola). En segundo lugar, nuestro modelo asume una asociación entre los cambios de flujo y los cambios de aptitud22. En las 50 adaptaciones del entorno de la glucosa, hay una fuerte correlación negativa entre fp y la PC media (ρ de Spearman = -0.98, P < 10-300; Fig. 3e). Existe una correlación opuesta entre fa y TC media (ρ = 0,57, P = 1,1 × 10-5; Fig. 3f). En conjunto, nuestros análisis demuestran que la razón principal de una mayor frecuencia de reversión fenotípica que de refuerzo durante la adaptación es que, en términos de aptitud y fenotipos asociados, los organismos en la etapa p son más diferentes que los de la etapa a, cuando se comparan con los de la etapa o.

Reversión fenotípica en redes metabólicas aleatorias

Los PC y GC en el nivel de expresión génica y el flujo metabólico durante las adaptaciones dependen, respectivamente, de la red reguladora y la red metabólica de la especie en cuestión. Dado que estas redes son el resultado de miles de millones de años de evolución, cabe preguntarse si el predominio de la reversión fenotípica es atribuible a la historia evolutiva de las especies estudiadas, especialmente a los entornos en los que la especie y sus antepasados han sido seleccionados en el pasado, o a una propiedad intrínseca de cualquier sistema funcional. Para abordar esta cuestión, aplicamos el mismo análisis a 500 redes metabólicas funcionales aleatorias generadas previamente22. Estas redes se construyeron a partir de iAF1260 intercambiando sus reacciones con reacciones elegidas al azar del universo de todas las reacciones metabólicas en la Enciclopedia de Genes y Genomas de Kyoto38 siempre que la red tenga una aptitud predicha por FBA no nula en el entorno de la glucosa en cada intercambio de reacciones39.

Sólo 20 nuevos entornos a los que iAF1260 puede adaptarse (desde el entorno de la glucosa) son adaptables por al menos 20 de las 500 redes aleatorias. Por tanto, analizamos las adaptaciones de las redes aleatorias a cada uno de estos 20 nuevos entornos, siendo el entorno de la glucosa el entorno original. Para cada nuevo entorno, la mediana de CRV de todas las redes aleatorias que pueden adaptarse a este entorno es generalmente de alrededor de 0,1 (gráficos de caja en la Fig. 4a), siendo la mediana de CRV de 0,11. Por el contrario, la mediana del IRC de todas las redes aleatorias para un nuevo entorno es generalmente inferior a 0,01 (gráficos de caja en la Fig. 4b), siendo la mediana del IRC medio de 0,0033. La mediana de la relación CRI/CRV en las redes aleatorias para un nuevo entorno es generalmente inferior a 0,05 (gráfico de caja en la Fig. 4c), siendo la mediana de la CRI/CRV mediana de 0,0033. Claramente, el predominio de la reversión de flujo es también evidente en las redes funcionales al azar, sugiriendo que esta propiedad es intrínseca a cualquier red metabólica funcional más que un producto de historias evolutivas particulares. De hecho, la explicación mecánica de esta propiedad en los organismos reales (Fig. 3) se mantiene en las redes metabólicas aleatorias examinadas aquí. Específicamente, la fracción de reacciones que exhiben PC > TC es sustancial (Fig. 4d) y fp es mayormente inferior a 1 (Fig. 4e). Además, fp es generalmente más diferente de 1 que fa en una escala log10, porque |log10fp|-|log10fa| es en gran parte positiva (Fig. 4f).

Intrigantemente, sin embargo, para 19 de los 20 nuevos entornos, el CRV en la red metabólica de E. coli supera la mediana del CRV en las redes aleatorias (Fig. 4a). Una tendencia similar, pero menos obvia, se mantiene para el IRC (Fig. 4b). Para 16 de los 20 nuevos entornos, el CRI/CRV de E. coli es menor que la mediana del CRI/CRV de las redes aleatorias (P = 0,012, prueba binomial de dos colas; Fig. 4c). Por lo tanto, aunque tanto la red metabólica de E. coli como las redes aleatorias muestran un predominio de la reversión del flujo, este fenómeno es más pronunciado en E. coli. Mecánicamente, esta disparidad es explicable al menos cualitativamente por nuestro modelo de la sección anterior. Específicamente, para 15 de los 20 nuevos ambientes, la fracción de reacciones de E. coli con PC > TC excede la fracción mediana correspondiente en redes aleatorias (P = 0.021, prueba binomial de una cola; Fig. 4d). Para los 20 nuevos entornos, la fp de E. coli es inferior a la mediana de la fp de las redes aleatorias (P = 9,5 × 10-7, prueba binomial de una cola; Fig. 4e). Para 19 de los 20 nuevos entornos, |log10 fp| – |log10 fa| para E. coli es mayor que el valor medio correspondiente de las redes aleatorias (P = 2,0 × 10-5, prueba binomial de una cola; Fig. 4f). Pero, ¿por qué la fp de E. coli es menor que la de las redes aleatorias? Una posible explicación es que la composición y la estructura de la red metabólica de E. coli se han optimizado evolutivamente para el crecimiento en el entorno de la glucosa y/o entornos afines, mientras que no ocurre lo mismo con las redes aleatorias, que sólo debían ser viables en el entorno de la glucosa. En consecuencia, cuando se sustituye la glucosa por una nueva fuente de carbono en un nuevo entorno, la aptitud de E. coli disminuye sustancialmente, pero la de las redes aleatorias puede disminuir sólo ligeramente. Aunque la aptitud absoluta en la etapa plástica puede ser mayor para E. coli que para las redes aleatorias, se espera que la aptitud relativa, que es fp, sea menor para E. coli que para las redes aleatorias. Así, la mayor prevalencia de la reversión de flujos en relación con el refuerzo en E. coli que en las redes aleatorias es probablemente un subproducto de una selección más fuerte de E. coli en comparación con las redes aleatorias en el entorno original utilizado en nuestro análisis de adaptación.

La reversión es al menos tan común como el refuerzo incluso para los rasgos con CT apreciable

En los análisis anteriores de los transcriptomas (Fig. 1d) y fluxomas (Fig. 2a), hemos considerado todos los rasgos que exhiben PCs y GCs apreciables. Sin embargo, en los estudios comparativos y evolutivos, los fenotipos en el estadio p son típicamente inaccesibles. En consecuencia, los biólogos comparativos y evolutivos suelen centrarse en los rasgos cuyos valores fenotípicos difieren entre los estadios o y a, a pesar de que los demás rasgos podrían haber experimentado también cambios adaptativos (de los valores del estadio p a los del estadio a). Para estudiar si nuestros hallazgos anteriores se aplican a los rasgos que son objeto de la mayoría de los biólogos comparativos y evolutivos, nos centramos en un subconjunto de rasgos anteriormente analizados que satisfacen la condición de CT 0,2Lo. De los 44 casos de evolución experimental, 33 mostraron VCR > IRC (P = 0,0013, prueba binomial de dos colas), en 30 de los cuales el VCR supera significativamente el IRC (P nominal < 0,05; prueba binomial de dos colas; Fig. 5a). De las 50 adaptaciones ambientales de la red metabólica de E. coli que se originan en el entorno de la glucosa, tres casos tuvieron igual número de reversión de flujo y refuerzo. Entre los 47 casos restantes, 22 mostraron más reversión que refuerzo, mientras que 25 mostraron lo contrario (P = 0,77, prueba binomial de dos colas; Fig. 5b). Cuando el IRC es significativamente diferente del VCR, 15 casos mostraron VCR < IRC, mientras que 11 mostraron lo contrario (P = 0,70, prueba binomial de dos colas; Fig. 5b). Por lo tanto, incluso entre los rasgos con TC > 0,2Lo, no hay evidencia de un refuerzo significativamente mayor que la reversión. Cabe destacar que en el análisis metabólico anterior, un promedio de 139 reacciones satisfizo TC 0,2Lo por adaptación. Debido a que todos los cambios de flujo observados en la maximización de la aptitud son requeridos y por lo tanto son, por definición, beneficiosos, incluso la adaptación a un simple cambio en la fuente de carbono aparentemente implica mucho más que unas pocas reacciones.