Prevalenza della reversione di espressione nell’evoluzione sperimentale

Abbiamo identificato cinque studi che hanno condotto sei diversi esperimenti di adattamento e raccolto dati trascrittomici adatti alla nostra analisi. Questi sei esperimenti includevano 10 repliche di E. coli che si adattavano a un ambiente ad alta temperatura17, 6 repliche di un altro ceppo di E. coli che si adattava a un ambiente ad alta temperatura18, 7 repliche di E. coli che si adattava a un mezzo di glicerolo16, 7 repliche di E. coli che si adatta a un mezzo di lattato16, 1 replica di 12 diversi ceppi di lievito (Saccharomyces cerevisiae) che si adattano a un mezzo di xilulosio19, e 2 repliche di guppy (Poecilia reticulata) che si adattano a un ambiente a bassa predazione15. In totale, abbiamo analizzato 44 casi di adattamento.

In ogni caso, i dati del trascrittoma sono stati raccolti rispettivamente per gli organismi nell’ambiente originale (o per lo stadio originale), poco dopo la loro esposizione al nuovo ambiente (p per lo stadio di plastica), e alla conclusione dell’evoluzione sperimentale nel nuovo ambiente (a per lo stadio adattato; Fig. 1a). Si noti che il tempo tra o e p è così breve che nessun allele appena sorto dovrebbe aver raggiunto una frequenza apprezzabile nello stadio p per influenzare il fenotipo medio della popolazione. Il livello di espressione di ogni gene è trattato come un tratto. Lasciamo che i livelli di espressione di un gene agli stadi o, p e a siano Lo, Lp e La, rispettivamente. In ogni esperimento, abbiamo prima identificato i geni con PC apprezzabili nel livello di espressione richiedendo PC = |Lp-Lo| per essere maggiore di un cutoff predefinito. Abbiamo anche identificato i geni con apprezzabile GCs nel livello di espressione richiedendo GC = |La-Lp| per essere maggiore della stessa cutoff preimpostato. Per quei geni che mostrano sia PC apprezzabili che GC apprezzabili, chiediamo se i due cambiamenti sono nella stessa direzione (cioè, rinforzo) o in direzioni opposte (cioè, inversione; Fig. 1b, c). Abbiamo usato il 20% del livello originale di espressione genica (cioè 0,2Lo) come cutoff nell’analisi di cui sopra. La frazione di geni che esibiscono il rafforzamento del livello di espressione (CRI) è inferiore alla frazione di geni che esibiscono la reversione (CRV) in 42 dei 44 adattamenti, e la differenza tra CRI e CRV è significativa in 40 di questi 42 casi (P nominale < 0,05; test binomiale a due code; Fig. 1d). Tra i due adattamenti con CRI > CRV, la loro differenza è significativa in un solo caso (Fig. 1d). La preponderanza generale di inversione del livello di espressione (cioè, 42 di 44 casi) in adattamento è statisticamente significativo (P = 1.1 × 10-10, test binomiale a due code). La stessa tendenza è evidente quando il cutoff è alterato a 0.05Lo (Supplementary Fig. 1a) o 0.5Lo (Supplementary Fig. 2a), suggerendo che la scoperta di cui sopra è robusto alla scelta cutoff. Chiaramente, i dati trascrittomici non supportano l’ipotesi che la plasticità generalmente faciliti l’adattamento genetico.

Inversione del flusso metabolico negli adattamenti ambientali

Per valutare la generalità della scoperta di cui sopra e capire la sua causa sottostante, abbiamo esteso il confronto tra il rinforzo fenotipico e l’inversione ai flussi metabolici (vedi Introduzione). Poiché la nostra analisi metabolica non ha lo scopo di modellare l’evoluzione sperimentale di cui sopra o i cambiamenti di espressione, i parametri utilizzati non sono correlati all’evoluzione sperimentale. In particolare, abbiamo predetto computazionalmente i cambiamenti di flusso plastico e genetico durante gli adattamenti ambientali usando iAF1260, la rete metabolica ricostruita di E. coli23. Abbiamo usato l’analisi di equilibrio del flusso (FBA) per prevedere i flussi ottimizzati di organismi completamente adattati negli ambienti originali (fase o) e nuovi (fase a), rispettivamente, sotto l’ipotesi che il tasso di produzione di biomassa, un proxy per il fitness, è massimizzato dalla selezione naturale 20. Le previsioni FBA corrispondono alle misure sperimentali ragionevolmente bene per gli organismi adattati ai loro ambienti24,25,26,27,28,29 e sono comunemente usate nello studio delle relazioni genotipo-ambiente-fenotipo22,27,29,30,31,32,33,34,35,36,37. Nel prevedere i cambiamenti di flusso plastica su turni ambientali (fase p), abbiamo impiegato la minimizzazione della regolazione metabolica (MOMA) invece di FBA perché MOMA meglio ricapitola la risposta immediata flusso di perturbazioni21 (vedi metodi). Abbiamo trattato il flusso di ogni reazione nella rete metabolica come un tratto, e modellato turni ambientali alterando la fonte di carbonio disponibile per la rete. Ci sono 258 distinte reazioni di scambio in iAF1260, ognuna delle quali trasporta una diversa fonte di carbonio. Abbiamo quindi esaminato 258 diversi ambienti con una sola fonte di carbonio.

Abbiamo iniziato l’analisi utilizzando il glucosio come fonte di carbonio nell’ambiente originale, perché questo ambiente era il punto di riferimento nella costruzione di iAF126023. Abbiamo poi considerato gli adattamenti di E. coli a 257 nuovi ambienti, ciascuno con una diversa fonte di carbonio singolo. Abbiamo trovato che questi nuovi ambienti sono naturalmente separati in due gruppi nel tasso di produzione di biomassa previsto da MOMA, un proxy per il fitness allo stadio p (fp) (Fig. 3 supplementare). Un gruppo mostra fp < 10-4, suggerendo che è improbabile che E. coli sostenga in questi nuovi ambienti. Ci siamo quindi concentrati sui restanti 50 nuovi ambienti con fp > 10-4, a cui E. coli può presumibilmente adattarsi (Tabella supplementare 1).

Definendo il rinforzo del flusso e la reversione e utilizzando il cutoff di 0.2Lo come nell’analisi del trascrittoma, abbiamo trovato CRV per essere significativamente maggiore di CRI (nominale P < 10-10, test binomiale a due code) in ogni adattamento. La probabilità che tutti i 50 adattamenti mostrano CRV > CRI è 1.8 × 10-15 (test binomiale a due code; Fig. 2a), suggerendo una predominanza generale di inversione di flusso. Il CRV medio e mediano sono 30,2% e 30,5%, rispettivamente, mentre quelli per CRI sono solo 1,0% e 0,8%, rispettivamente. La tendenza di cui sopra si mantiene quando alteriamo il cutoff a 0.05Lo (Fig. 1b supplementare) o 0.5Lo (Fig. 2b supplementare). Poiché un problema FBA o MOMA può avere più soluzioni, l’ordine delle reazioni nella matrice stechiometrica potrebbe influenzare la soluzione specifica fornita dal solutore. Tuttavia, quando abbiamo mescolato casualmente l’ordine di reazione in iAF1260, il modello generale di CRV > CRI è inalterato (Fig. 4a supplementare). Poiché la programmazione quadratica – richiesta da MOMA – è più difficile da risolvere rispetto alla programmazione lineare utilizzata in FBA, CRV potrebbe essere stato sovrastimato rispetto a CRI. Per correggere questo potenziale problema, abbiamo progettato un MOMA basato sulla programmazione quadratica chiamato “MOMA-b” e utilizzato al posto di FBA per prevedere i flussi in fase a (vedi Metodi), ma ha trovato che CRV supera ancora CRI (Fig. 4b supplementare). Quindi, questa tendenza non è un artefatto tecnico della differenza di solutore tra MOMA e FBA.

L’inversione di flusso ripristina in gran parte i flussi originali

Predominanza dell’inversione di flusso indipendentemente dall’ambiente originale

Per studiare la generalità della nostra scoperta della predominanza dell’inversione di flusso, abbiamo anche esaminato gli adattamenti con un ambiente originale non glucosio. Per molti ambienti originali, tuttavia, solo pochi nuovi ambienti sono adattabili dalla rete metabolica di E. coli. Ci siamo quindi concentrati su 41 ambienti originali (compreso l’ambiente di glucosio usato in precedenza) che hanno ciascuno più di 20 ambienti nuovi adattabili (cioè, fp > 10-4) (Tabella supplementare 2). Per ciascuno di questi ambienti originali, abbiamo calcolato il rapporto CRI/CRV per ogni ambiente adattabile nuovo, e trovato per essere tipicamente inferiore a 0,1 (Fig. 2d). Abbiamo poi calcolato la mediana CRI/CRV tra tutti i nuovi ambienti adattabili da ogni ambiente originale. Tra i 41 ambienti originali, il CRI/CRV mediano più grande è 0,11 e la mediana del CRI/CRV mediano è solo 0,02. Quindi, indipendentemente dall’ambiente originale, l’inversione di flusso è molto più prevalente del rinforzo durante gli adattamenti genetici a nuovi ambienti.

Perché l’inversione fenotipica è più frequente del rinforzo

La nostra scoperta che il rinforzo fenotipico non solo non è più ma in realtà molto meno comune dell’inversione è inaspettata e quindi richiede una spiegazione. L’osservazione di questa tendenza in entrambe le analisi transcriptomic e fluxomic suggerisce un meccanismo generale sottostante, che proponiamo è il verificarsi di PC > TC. Geometricamente, è ovvio che quando PC > TC, il GC deve invertire il PC (i diagrammi di sinistra e centrale nella riga superiore in Fig. 3a). Al contrario, quando PC < TC, l’inversione e il rinforzo sono ugualmente probabili se non esistono altri bias (i diagrammi di sinistra e centrale nella riga inferiore in Fig. 3a). Sia q la probabilità di PC > TC (> 0). L’IRC/CRV dovrebbe essere / = (1 – q)/(1 + q) < 1. In altre parole, finché PC > TC per alcuni tratti, la reversione dovrebbe essere più frequente del rinforzo (senza altri bias).

Per cercare prove empiriche della spiegazione di cui sopra, per ciascuno dei 44 casi di evoluzione sperimentale, abbiamo calcolato la frazione di geni i cui cambiamenti di espressione soddisfano PC > TC (Fig. 3b). Le frazioni media e mediana sono 0,51 e 0,48, rispettivamente. Inoltre, dopo aver rimosso tutti i geni per i quali PC > TC, non c’è più un eccesso di reversione (Fig. 5a supplementare), indicando la sufficienza della nostra spiegazione. Allo stesso modo, abbiamo calcolato la frazione di reazioni metaboliche che mostrano PC > TC nell’adattamento della rete metabolica di E. coli dall’ambiente del glucosio a ciascuno dei 50 nuovi ambienti (Fig. 3c). Le frazioni media e mediana sono 0,85 e 0,93, rispettivamente. Allo stesso modo, dopo la rimozione delle reazioni che mostrano PC > TC, non c’è una tendenza generale di più reversione che rinforzo attraverso i 50 adattamenti (Fig. 5b supplementare). Questi risultati del trascrittoma e del fluxome sostengono che l’eccesso di reversione rispetto al rinforzo è spiegabile con il verificarsi di PC > TC per frazioni non trascurabili di tratti.

Perché PC supera TC per molti tratti? Una probabile ragione è che le PC permettono agli organismi di sopravvivere a un improvviso cambiamento ambientale, ma la fitness è molto ridotta rispetto a quella nell’ambiente originale e a quella dopo l’adattamento al nuovo ambiente. Così, lo stato fisiologico generale degli organismi può essere abbastanza simile tra gli stadi adattati nell’ambiente originale e in quello nuovo, ma è molto diverso nello stadio di plastica a bassa fitness subito dopo il cambiamento ambientale. Questo può spiegare perché il PC supera il TC per molti tratti, indipendentemente dal fatto che i valori dei tratti siano cause o conseguenze della fitness e della fisiologia dell’organismo.

Abbiamo trovato forti prove per il modello di cui sopra attraverso l’analisi della rete metabolica. In primo luogo, utilizzando il tasso di produzione di biomassa previsto come proxy per il fitness, abbiamo confrontato il fitness di E. coli allo stadio plastico (fp) e quello dopo l’adattamento a un nuovo ambiente (fa), rispetto a quello nell’ambiente originale di glucosio, per ciascuno degli adattamenti ai 50 nuovi ambienti. In tutti i casi, fp < 1 (Fig. 3d), confermando che i cambiamenti ambientali causano cali di fitness prima dell’adattamento genetico. Abbiamo trovato che fa è tipicamente vicino a 1, anche se in alcuni nuovi ambienti è molto >1 (Fig. 3d). In una scala log10, fp è più diverso da 1 che è fa in 43 dei 50 adattamenti (P = 1.0 × 10-7; test binomiale a una coda). In secondo luogo, il nostro modello presuppone un’associazione tra cambiamenti di flusso e cambiamenti di fitness22. Attraverso i 50 adattamenti dall’ambiente di glucosio, c’è una forte correlazione negativa tra fp e PC medio (Spearman’s ρ = -0.98, P < 10-300; Fig. 3e). Una correlazione opposta esiste tra fa e TC medio (ρ = 0,57, P = 1,1 × 10-5; Fig. 3f). Insieme, le nostre analisi dimostrano che la ragione principale di una maggiore frequenza di inversione fenotipica rispetto al rinforzo durante l’adattamento è che in termini di fitness e fenotipi associati, gli organismi allo stadio p sono più diversi di quelli allo stadio a, se confrontati con quelli allo stadio o.

Inversione fenotipica in reti metaboliche casuali

I PC e i CG nel livello di espressione genica e nel flusso metabolico durante gli adattamenti dipendono, rispettivamente, dalla rete normativa e dalla rete metabolica delle specie interessate. Poiché queste reti sono il risultato di miliardi di anni di evoluzione, ci si chiede se la predominanza della reversione fenotipica sia attribuibile alla storia evolutiva della specie studiata, soprattutto agli ambienti in cui la specie e i suoi antenati sono stati selezionati in passato, o una proprietà intrinseca di qualsiasi sistema funzionale. Per affrontare questa domanda, abbiamo applicato la stessa analisi a 500 reti metaboliche funzionali casuali precedentemente generate22. Queste reti sono state costruite da iAF1260 scambiando le sue reazioni con reazioni scelte a caso dall’universo di tutte le reazioni metaboliche nella Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes38 a condizione che la rete abbia un fitness previsto da FBA non nullo nell’ambiente del glucosio su ogni scambio di reazioni39.

Solo 20 nuovi ambienti a cui iAF1260 può adattarsi (dall’ambiente del glucosio) sono adattabili da almeno 20 delle 500 reti casuali. Abbiamo quindi analizzato gli adattamenti delle reti casuali a ciascuno di questi 20 nuovi ambienti, con l’ambiente del glucosio come ambiente originale. Per ogni nuovo ambiente, il CRV mediano di tutte le reti casuali che possono adattarsi a questo ambiente è generalmente intorno a 0,1 (box plot in Fig. 4a), con la mediana del CRV mediano che è 0,11. Al contrario, l’IRC mediano tra le reti casuali per un nuovo ambiente è generalmente inferiore a 0,01 (diagrammi a caselle in Fig. 4b), con la mediana dell’IRC mediano che è 0,0033. Rapporto CRI/CRV mediana attraverso reti casuali per un nuovo ambiente è generalmente inferiore a 0,05 (box plot in Fig. 4c), con la mediana del CRI/CRV mediana essere 0,0033. Chiaramente, la predominanza dell’inversione di flusso è evidente anche nelle reti casuali funzionali, suggerendo che questa proprietà è intrinseca a qualsiasi rete metabolica funzionale piuttosto che un prodotto di particolari storie evolutive. Infatti, la spiegazione meccanicistica di questa proprietà negli organismi attuali (Fig. 3) è valida nelle reti metaboliche casuali esaminate qui. In particolare, la frazione di reazioni che presentano PC > TC è sostanziale (Fig. 4d) e fp è per lo più inferiore a 1 (Fig. 4e). Inoltre, fp è generalmente più diverso da 1 di quanto lo sia fa in una scala log10, perché |log10fp|-|log10fa| è ampiamente positivo (Fig. 4f).

Intrigante, tuttavia, per 19 dei 20 nuovi ambienti, CRV nella rete metabolica E. coli supera la mediana CRV nelle reti casuali (Fig. 4a). Una tendenza simile, ma meno evidente, vale per l’IRC (Fig. 4b). Per 16 dei 20 nuovi ambienti, CRI/CRV da E. coli è inferiore alla mediana CRI/CRV delle reti casuali (P = 0.012, test binomiale a due code; Fig. 4c). Quindi, anche se sia la rete metabolica E. coli e reti casuali mostrano una predominanza di inversione di flusso, questo fenomeno è più pronunciato in E. coli. Meccanicamente, questa disparità è spiegabile almeno qualitativamente dal nostro modello nella sezione precedente. In particolare, per 15 dei 20 nuovi ambienti, la frazione di reazioni E. coli con PC > TC supera la corrispondente frazione mediana nelle reti casuali (P = 0.021, test binomiale a una coda; Fig. 4d). Per tutti i 20 nuovi ambienti, fp di E. coli è inferiore alla mediana fp di reti casuali (P = 9,5 × 10-7, test binomiale a una coda; Fig. 4e). Per 19 dei 20 nuovi ambienti, |log10 fp| – |log10 fa| per E. coli è più grande del corrispondente valore mediano per le reti casuali (P = 2.0 × 10-5, test binomiale a una coda; Fig. 4f). Ma, perché fp di E. coli è inferiore a quello delle reti casuali? Una spiegazione potenziale è che la composizione e la struttura della rete metabolica di E. coli sono stati evolutivamente ottimizzati per la crescita nell’ambiente di glucosio e / o ambienti correlati, mentre lo stesso non è vero per le reti casuali, che sono stati richiesti solo per essere vitale nell’ambiente di glucosio. Di conseguenza, quando il glucosio viene sostituito con una nuova fonte di carbonio in un nuovo ambiente, la fitness di E. coli scende sostanzialmente, ma quella delle reti casuali può scendere solo leggermente. Anche se la fitness assoluta nella fase plastica può essere più alta per E. coli rispetto alle reti casuali, la fitness relativa, che è fp, dovrebbe essere più bassa per E. coli rispetto alle reti casuali. Quindi, la maggiore prevalenza dell’inversione di flusso rispetto al rinforzo in E. coli rispetto alle reti casuali è probabilmente un sottoprodotto della selezione più forte di E. coli rispetto alle reti casuali nell’ambiente originale utilizzato nella nostra analisi di adattamento.

L’inversione è comune almeno quanto il rinforzo anche per i tratti con TC apprezzabile

Nelle precedenti analisi dei trascrittomi (Fig. 1d) e dei fluxomi (Fig. 2a), abbiamo considerato tutti i tratti che mostrano PC e GC apprezzabili. Negli studi comparativi ed evolutivi, tuttavia, i fenotipi allo stadio p sono tipicamente inaccessibili. Di conseguenza, i biologi comparativi ed evolutivi di solito si concentrano sui tratti i cui valori fenotipici differiscono tra gli stadi o e a, nonostante il fatto che gli altri tratti potrebbero anche aver subito cambiamenti adattativi (dai valori allo stadio p a quelli allo stadio a). Per studiare se i nostri risultati precedenti si applicano ai tratti che sono l’oggetto della maggior parte dei biologi comparativi ed evolutivi, ci concentriamo su un sottoinsieme di tratti sopra analizzati che soddisfano la condizione di TC > 0,2Lo. Dei 44 casi di evoluzione sperimentale, 33 hanno mostrato CRV > CRI (P = 0,0013, test binomiale a due code), in 30 dei quali CRV supera significativamente CRI (P nominale < 0,05; test binomiale a due code; Fig. 5a). Dei 50 adattamenti ambientali della rete metabolica di E. coli originati dall’ambiente del glucosio, tre casi avevano un numero uguale di inversione di flusso e rinforzo. Tra i restanti 47 casi, 22 hanno mostrato più inversione di rinforzo, mentre 25 hanno mostrato il contrario (P = 0,77, test binomiale a due code; Fig. 5b). Quando CRI è significativamente diverso da CRV, 15 casi hanno mostrato CRV < CRI mentre 11 hanno mostrato il contrario (P = 0,70, test binomiale a due code; Fig. 5b). Quindi, anche tra i tratti con TC > 0.2Lo, non c’è evidenza di un rinforzo significativamente maggiore rispetto alla reversione. Da notare, nell’analisi metabolica di cui sopra, in media 139 reazioni soddisfatto TC > 0.2Lo per adattamento. Poiché tutti i cambiamenti di flusso osservati nella massimizzazione del fitness sono richiesti e quindi sono per definizione benefici, anche l’adattamento a un semplice cambiamento di fonte di carbonio apparentemente coinvolge molto più di poche reazioni.