Punti principali:

• I tessuti di interesse appena raccolti dovrebbero essere fissati immediatamente per evitare la degradazione.

• Il 10% di formalina tamponata neutra (NBF) o la soluzione di paraformaldeide al 4% (PFA) sono comunemente usati per l’istologia. Questi sono fissativi efficaci per H&E, e la maggior parte dei marcatori di immunoistochimica (IHC) e macchie speciali.

• La fissazione ottimale è la chiave per i migliori risultati istopatologici.

Introduzione alla fissazione dei tessuti

I test di base in patologia anatomica e l’esame microscopico dei tessuti richiedono una fissazione, lavorazione, sezionamento e colorazione ottimale dei tessuti. La fissazione è una fase iniziale critica in istologia. Una cattiva fissazione può portare a molteplici risultati imprecisi tra cui macchie speciali, immunoistochimica e altre tecniche istologiche. Un tessuto ben conservato mantiene la sua struttura e la sua reattività ai reagenti come le macchie speciali, gli anticorpi per l’immunoistochimica e le sonde di acido nucleico per i saggi di ibridazione in situ. Sia la sottofissazione che la sovrafissazione possono causare una grande quantità di problemi in istologia, tuttavia la sottofissazione può essere un problema maggiore della sovrafissazione e deve essere evitata. La fissazione di tessuti grassi come il tessuto cerebrale umano, di ratto o di topo può richiedere un’attenzione particolare. Una fissazione ottimale del tessuto assicura la conservazione delle strutture cellulari ed extracellulari per ottenere un sezionamento sottile, una colorazione istochimica ottimale e una conservazione e archiviazione a lungo termine. Qui discutiamo brevemente i fattori importanti per ottenere una fissazione ottimale sia per i tessuti umani che veterinari.

Che cos’è la fissazione dei tessuti?

La fissazione è un processo chimico attraverso il quale il tessuto biologico viene conservato per rappresentare il più possibile lo stato in vivo del campione. Per conservare un campione di tessuto in uno stato il più vicino possibile alla vita, i processi postmortem di autolisi, che è l’auto-degradazione attraverso gli enzimi proteolitici, e/o la putrefazione, che è il decadimento della materia organica attraverso l’azione dei microrganismi, devono essere fermati. Un fissativo ideale dovrebbe preservare il campione di tessuto in un modo che sia rappresentativo della sua situazione in vivo; la morfologia cellulare ed extracellulare dovrebbe essere preservata, e il fissativo non dovrebbe denaturare le proteine che sono importanti per l’analisi istopatologica.

Fissativi comuni per l’istologia

Esiste una serie di fissativi e l’uso di un tipo particolare è dettato dall’analisi a valle. Per l’istologia, i fissativi più efficaci e comunemente usati sono a base di aldeidi. I seguenti fissativi sono raccomandati per la colorazione H&E e la maggior parte dei marcatori IHC e delle colorazioni speciali:

1. Formalina tamponata neutra (NBF): Una soluzione tampone di formaldeide al 10%, pH 7.0-7.4 è comunemente usata nella maggior parte dei laboratori. Immediatamente dopo l’intervento, il tessuto viene immerso completamente nella soluzione NBF al 10% e cronometrato. Una soluzione pronta all’uso è disponibile da vari fornitori negli Stati Uniti. La tempistica della fissazione determina la fissazione ottimale come discusso in seguito.

2. Soluzione di paraformaldeide (PFA): La soluzione di PFA al 4% appena preparata produce risultati simili ed è conveniente. A causa della sua rapida degradazione, questa soluzione viene preparata fresca ogni volta prima dell’uso.

Il meccanismo d’azione e la quantità di formaldeide in entrambe le soluzioni sono gli stessi.

Meccanismo d’azione

Il meccanismo d’azione della fissazione è attraverso la rapida terminazione di tutte le reazioni enzimatiche e attività metaboliche in corso denaturando le biomolecole intrinseche. In questo modo, gli enzimi proteolitici che altrimenti digerirebbero il campione di tessuto tramite autolisi vengono denaturati e i processi autolitici vengono fermati. I fissativi proteggono anche il campione da danni estrinseci, poiché sono tossici per la maggior parte dei microrganismi comuni (in particolare i batteri) che potrebbero altrimenti colonizzare un campione di tessuto. Inoltre, molti fissativi alterano chimicamente il tessuto trattato per essere meno appetibile ai microrganismi opportunisti, impedendo così il processo di putrefazione.

Il meccanismo di fissazione della formaldeide è attraverso la reticolazione, o la creazione di legami chimici covalenti, tra i residui di aminoacidi, più comunemente quello dei residui di lisina degli aminoacidi (gruppi amminici della catena laterale della lisina), che si traducono in ponti di metilene. La reticolazione della formaldeide può avvenire anche tra i gruppi aminometilici e le catene laterali di fenolo, indolo e imidazolo. Inoltre, la formaldeide agisce su una varietà di aminoacidi, come lisina, arginina, tirosina, asparagina, istidina, glutamina e serina. I fissatori a reticolazione mantengono le strutture interne di un campione e non danneggiano significativamente la struttura della proteina. L’uso della formaldeide è favorevole in quanto mantiene la morfologia del campione di tessuto e la struttura secondaria e terziaria della proteina non viene alterata e quindi conservata. È stato proposto che la formaldeide sia un fissativo efficace a causa della sua velocità di penetrazione.

Modalità di fissazione

Ci sono due modi di fissare i tessuti – immersione e perfusione transcardiale. La fissazione per immersione consiste nel mettere il tessuto appena raccolto in una quantità adeguata di fissativo. Questo è il modo più semplice e più comune di fissazione. La perfusione transcardiale, d’altra parte, utilizza il sistema circolatorio per diffondere il fissativo, il che, se eseguito abilmente, si traduce in una fissazione rapida ed efficace. Questa tecnica si traduce generalmente in una morfologia ben conservata con una degradazione minima dovuta all’autolisi o alla putrefazione.

Per i roditori e altri piccoli animali, la perfusione transcardiale è altamente raccomandata per ottenere i migliori risultati. Dopo la perfusione transcardiale, l’organo o gli organi di interesse raccolti possono essere immersi nel fissativo per garantire una fissazione completa.

Lunghezza della fissazione

Un fissativo dovrebbe essere esposto al campione di tessuto per il tempo necessario affinché la soluzione penetri completamente nel campione. Per la fissazione per immersione, devono essere presi in considerazione alcuni fattori come la densità del campione di tessuto, la velocità di penetrazione e la temperatura. È importante notare che il tasso di penetrazione e il tasso di fissazione sono due processi completamente diversi di un fissativo, con il secondo che procede più lentamente del primo. Una regola generale da applicare per il tasso di penetrazione è 1 mm/ora. Un tempo di fissazione di 24 ore è raccomandato per i campioni trattati con NBF.

La sottofissazione (precoce ritiro del fissativo dal tessuto trattato) può portare ad una scarsa conservazione morfologica, mentre la sovra-fissazione (ritiro tardivo del fissativo dal tessuto trattato) può portare ad artefatti di fissazione, perdita di segnale, o aumento dei segnali di fondo aspecifici (“rumore”). In generale, non si raccomanda di fissare il tessuto per più di 36 ore per evitare la fissazione eccessiva. Entrambi sono problemi che richiedono soluzioni proprie e devono essere evitati quando si fissa un campione di tessuto. La durata dell’esposizione di un campione al fissativo è quindi una questione molto importante che deve essere attentamente calibrata.

Dopo il processo di fissazione, si possono introdurre artefatti mentre il campione si asciuga. Questi artefatti possono essere sotto forma di perdita di organelli, restringimento nucleare e raggruppamento artificiale, quindi è vitale mantenere il campione trattato umido con una soluzione tampone fosfato/salina per continuare a conservare accuratamente il campione.

Dimensione del tessuto e volume del fissativo

I fissativi sono tamponi poveri; quindi, il pH della soluzione tende a cambiare durante il processo di fissazione. Un grande volume di fissativo assicurerà una fissazione ottimale. Il volume di fissativo usato dovrebbe essere circa 15-20 volte il volume del tessuto. Un grande volume tenderà ad eseguire adeguatamente la fissazione mantenendo stabile il reagente. Per ottenere i migliori risultati, il tessuto dovrebbe essere tagliato in pezzi che non sono più di 4-5 mm di spessore in una dimensione. Se il tessuto di interesse è necessario per altri scopi/applicazioni (test molecolari ecc.), può essere tagliato e congelato separatamente prima della fissazione.

Sommario

• La fissazione deve essere eseguita immediatamente dopo l’intervento chirurgico/la dissezione.

• Fissare il tessuto in una soluzione di formaldeide tampone neutra (NBF) al 10% o una soluzione di paraformaldeide al 4% appena preparata. I fissativi a base di formaldeide sono preferiti per la conservazione a lungo termine dei tessuti e sono noti per produrre i migliori risultati per il sezionamento, la morfologia (H&E), macchie speciali e immunoistochimica.

• Tagliare il tessuto in pezzi più piccoli (max. 4-5 mm), e utilizzare un’ampia quantità di fissativo, assicurandosi che il tessuto sia completamente immerso nel fissativo.

• La fissazione deve essere eseguita per non più di 24-36 ore a seconda delle dimensioni del tessuto. La tempistica dell’esposizione di un campione al fissativo è importante e deve essere calibrata.

• Il tessuto fissato deve essere trasferito in PBS o etanolo al 70% e inviato alla lavorazione per preparare blocchi di tessuto.

Si prega di consultare il personale del laboratorio se è necessario conservare il tessuto fissato per un tempo più lungo o se si ha bisogno di ulteriori consigli sulla fissazione e/o sulla spedizione dei campioni di tessuto. Le domande possono essere inviate a [email protected].

Scritto da: Hannah Bashar

Redatto da: Rajni Sharma, Ph.D.