Acelerando su camino hacia el descubrimiento

Puntos principales:

  • Los tejidos de interés recién recolectados deben fijarse inmediatamente para evitar su degradación.

  • La formalina tamponada neutra (NBF) al 10% o la solución de paraformaldehído (PFA) al 4% se utilizan habitualmente para la histología. Son fijadores eficaces para la H&E y la mayoría de los marcadores de inmunohistoquímica (IHC) y tinciones especiales.

  • La fijación óptima es la clave para obtener los mejores resultados en histopatología.

Introducción a la fijación de tejidos

Las pruebas básicas en anatomía patológica y el examen microscópico de los tejidos requieren una óptima fijación, procesamiento, seccionamiento y tinción de los mismos. La fijación es un paso inicial crítico en la histología. Una fijación deficiente puede dar lugar a múltiples resultados inexactos, incluidas las tinciones especiales, la inmunohistoquímica y otras técnicas histológicas. Un tejido bien conservado conserva su estructura y su reactividad a reactivos como las tinciones especiales, los anticuerpos para la inmunohistoquímica y las sondas de ácidos nucleicos para los ensayos de hibridación in situ. Tanto la infra-fijación como la sobre-fijación pueden causar muchos problemas en histología, sin embargo, la infra-fijación puede ser un problema mayor que la sobre-fijación y debe ser evitada. La fijación de tejidos grasos, como el tejido cerebral humano, de rata o de ratón, puede requerir una atención especial. Una fijación óptima del tejido garantiza la preservación de las estructuras celulares y extracelulares para lograr un corte fino, una tinción histoquímica óptima y una conservación y archivo a largo plazo. Aquí discutimos brevemente los factores importantes para lograr una fijación óptima de los tejidos humanos y veterinarios.

¿Qué es la fijación de tejidos?

La fijación es un proceso químico mediante el cual se preserva el tejido biológico para representar el estado in vivo de la muestra tanto como sea posible. Para preservar una muestra de tejido en un estado lo más cercano posible a la vida, deben detenerse los procesos postmortem de autolisis, que es la autodegradación a través de enzimas proteolíticas, y/o la putrefacción, que es la descomposición de la materia orgánica por acción de microorganismos. Un fijador ideal debe preservar la muestra de tejido dada de una manera que sea representativa de su situación in vivo; la morfología celular y extracelular debe preservarse, y el fijador no debe desnaturalizar las proteínas que son importantes para el análisis histopatológico.

Fijadores comunes para histología

Existen varios fijadores y el uso de un tipo concreto viene dictado por el análisis posterior. Para la histología, los fijadores más eficaces y utilizados son los basados en aldehídos. Se recomiendan los siguientes fijadores para la tinción H&E y la mayoría de los marcadores IHC y las tinciones especiales:

  1. Formalina tamponada neutra (NBF): En la mayoría de los laboratorios se utiliza habitualmente una solución tampón de formaldehído al 10%, con un pH de 7,0 a 7,4. Inmediatamente después de la cirugía, el tejido se sumerge completamente en una solución de NBF al 10% y se cronometra. Hay una solución lista para usar disponible en varios proveedores de los Estados Unidos. El momento de la fijación determina la fijación óptima, tal como se explica más adelante.

  2. Solución de paraformaldehído (PFA): La solución de PFA al 4% recién preparada produce resultados similares y es rentable. Debido a su rápida degradación, esta solución se prepara fresca cada vez antes de su uso.

El mecanismo de acción y la cantidad de formaldehído en ambas soluciones son los mismos.

Mecanismo de acción

El mecanismo de acción de la fijación es a través de la terminación rápida de todas las reacciones enzimáticas y actividades metabólicas en curso mediante la desnaturalización de las biomoléculas intrínsecas. Al hacerlo, se desnaturalizan las enzimas proteolíticas que de otro modo digerirían la muestra de tejido a través de la autolisis, y se detienen los procesos autolíticos. Los fijadores también protegen la muestra de los daños extrínsecos, ya que son tóxicos para la mayoría de los microorganismos comunes (en particular, las bacterias) que podrían colonizar una muestra de tejido. Además, muchos fijadores alteran químicamente el tejido tratado para que sea menos apetecible para los microorganismos oportunistas, evitando así el proceso de putrefacción.

El mecanismo de fijación del formaldehído es a través de la reticulación, o creación de enlaces químicos covalentes, entre los residuos de aminoácidos, sobre todo el de los residuos de aminoácidos de lisina (grupos amino de cadena lateral de la lisina), que dan lugar a puentes de metileno. La reticulación del formaldehído también puede producirse entre los grupos aminometilol y las cadenas laterales de fenol, indol e imidazol. Además, el formaldehído actúa sobre una variedad de aminoácidos, como la lisina, la arginina, la tirosina, la asparagina, la histidina, la glutamina y la serina. Los fijadores reticulados mantienen las estructuras internas de una muestra y no dañan significativamente la estructura de la proteína. El uso de formaldehído es favorable, ya que mantiene la morfología de la muestra de tejido y la estructura secundaria y terciaria de la proteína no se ve afectada y, por tanto, se conserva. Se ha propuesto que el formaldehído es un fijador eficaz debido a su rápida velocidad de penetración.

Modos de fijación

Hay dos formas de fijar el tejido: inmersión y perfusión transcardial. La fijación por inmersión consiste en colocar el tejido recién cosechado en una cantidad adecuada de fijador. Esta es la forma más simple y más común de fijación. La perfusión transcárdica, por su parte, utiliza el sistema circulatorio para esparcir el fijador, lo que, cuando se realiza con habilidad, da lugar a una fijación rápida y eficaz. Esta técnica suele dar lugar a una morfología bien conservada con una degradación mínima causada por la autolisis o la putrefacción.

Para los roedores y otros animales pequeños, la perfusión transcardial es muy recomendable para obtener los mejores resultados. Tras la perfusión transcardial, el órgano u órganos de interés cosechados pueden sumergirse en el fijador para asegurar una fijación completa.

Duración de la fijación

Un fijador debe exponerse a la muestra de tejido durante el tiempo necesario para que la solución penetre completamente en la muestra. Para la fijación por inmersión, deben tenerse en cuenta ciertos factores como la densidad de la muestra de tejido, la velocidad de penetración y la temperatura. Es importante tener en cuenta que la velocidad de penetración y la velocidad de fijación son dos procesos completamente diferentes de un fijador, siendo el segundo más lento que el primero. Una regla general a aplicar para la velocidad de penetración es de 1 mm/hora. Se recomienda un tiempo de fijación de 24 horas para las muestras tratadas con NBF.

La infra-fijación (retirada temprana del fijador del tejido tratado) puede dar lugar a una mala conservación morfológica, mientras que la sobre-fijación (retirada tardía del fijador del tejido tratado) puede dar lugar a artefactos de fijación, pérdida de señal o aumento de señales de fondo no específicas («ruido»). En general, no se recomienda fijar el tejido durante más de 36 horas para evitar el exceso de fijación. Ambos son problemas que requieren su propia solución y deben evitarse al fijar una muestra de tejido. La duración de la exposición de una muestra al fijador es, por tanto, una cuestión muy importante que debe calibrarse cuidadosamente.

Después del proceso de fijación, pueden introducirse artefactos a medida que la muestra se seca. Estos artefactos pueden presentarse en forma de pérdida de orgánulos, contracción nuclear y aglomeración artificial, por lo que es vital mantener la muestra tratada húmeda con solución tampón de fosfato/solución salina para seguir conservando la muestra con precisión.

Tamaño del tejido y volumen de fijador

Los fijadores son pobres tampones; por lo tanto, el pH de la solución tiende a cambiar durante el proceso de fijación. Un gran volumen de fijador asegurará una fijación óptima. El volumen de fijador utilizado debe ser aproximadamente 15-20 veces el volumen del tejido. Un volumen grande tenderá a realizar la fijación de forma adecuada manteniendo el reactivo estable. Para obtener los mejores resultados, el tejido debe cortarse en trozos de no más de 4-5 mm de grosor en una dimensión. Si el tejido de interés se necesita para otros fines/aplicaciones (pruebas moleculares, etc.), puede cortarse y congelarse por separado antes de la fijación.

Resumen

  • La fijación debe realizarse inmediatamente después de la cirugía/disección.

  • Fijar el tejido en una solución de formaldehído de tampón neutro (NBF) al 10% o en una solución de paraformaldehído al 4% recién preparada. Los fijadores a base de formaldehído son los preferidos para la conservación del tejido a largo plazo y se sabe que producen los mejores resultados para el seccionamiento, la morfología (H&E), las tinciones especiales y la inmunohistoquímica.

  • Corte el tejido en trozos más pequeños (máx. 4-5 mm) y utilice una cantidad suficiente de fijador, asegurándose de que el tejido esté completamente sumergido en el fijador.

  • La fijación debe realizarse durante no más de 24-36 horas, dependiendo del tamaño del tejido. El tiempo de exposición de una muestra al fijador es importante y debe calibrarse.

  • El tejido fijado debe transferirse a PBS o etanol al 70% y enviarse para su procesamiento para preparar bloques de tejido.

Por favor, consulte con el personal del laboratorio si necesita almacenar tejido fijado durante más tiempo o si necesita asesoramiento adicional sobre la fijación y/o el envío de muestras de tejido. Las preguntas pueden enviarse por correo electrónico a [email protected]

Escrito por: Hannah Bashar

Editado por: Rajni Sharma, Ph.D.