Puncte principale:

• Tesutul de interes proaspăt recoltat trebuie fixat imediat pentru a se evita degradarea.

• Soluția de formol neutru tamponat (NBF) 10% sau soluția de paraformaldehidă (PFA) 4% sunt utilizate în mod obișnuit pentru histologie. Acestea sunt fixatori eficienți pentru H&E, precum și pentru majoritatea markerilor de imunohistochimie (IHC) și a coloranților speciali.

• Fixarea optimă este esențială pentru cele mai bune rezultate histopatologice.

Introducere la fixarea țesuturilor

Testarea de bază în anatomia patologică și examinarea microscopică a țesuturilor necesită fixarea, prelucrarea, secționarea și colorarea optimă a țesuturilor. Fixarea este o etapă inițială critică în histologie. O fixare necorespunzătoare poate duce la multiple rezultate inexacte, inclusiv la colorații speciale, imunohistochimie și alte tehnici histologice. Un țesut bine conservat își păstrează structura și reactivitatea la reactivi precum coloranții speciali, anticorpii pentru imunohistochimie și sondele de acid nucleic pentru testele de hibridizare in situ. Atât subfixarea, cât și suprafixarea pot cauza o mulțime de probleme în histologie; cu toate acestea, subfixarea poate fi o problemă mai mare decât suprafixarea și trebuie evitată. Fixarea țesuturilor grase, cum ar fi țesutul cerebral uman, de șobolan sau de șoarece, poate necesita o atenție specială. O fixare optimă a țesuturilor asigură conservarea structurilor celulare și extracelulare pentru a obține o secționare subțire, o colorare histochimică optimă și o conservare și arhivare pe termen lung. Aici vom discuta pe scurt factorii importanți pentru realizarea unei fixări optime atât pentru țesut uman, cât și pentru țesut veterinar.

Ce este fixarea țesuturilor?

Fixarea este un proces chimic prin care țesutul biologic este conservat pentru a reprezenta cât mai mult posibil starea in vivo a eșantionului. Pentru a păstra o mostră de țesut într-o stare cât mai apropiată de viață, trebuie oprite procesele postmortem de autoliză, care reprezintă autodegradarea prin intermediul enzimelor proteolitice, și/sau putrefacție, care reprezintă descompunerea materiei organice prin acțiunea microorganismelor. Un fixator ideal ar trebui să păstreze eșantionul de țesut dat într-un mod care să fie reprezentativ pentru situația sa in vivo; morfologia celulară și extracelulară ar trebui să fie păstrată, iar fixatorul nu ar trebui să denatureze proteinele care sunt importante pentru analiza histopatologică.

Fixativi comuni pentru histologie

Există un număr de fixatori și utilizarea unui anumit tip este dictată de analiza din aval. Pentru histologie, cei mai eficienți și mai frecvent utilizați fixatori sunt cei pe bază de aldehide. Următorii fixatori sunt recomandați pentru colorația H&E, precum și pentru majoritatea markerilor IHC și a colorațiilor speciale:

1. Formalină tamponată neutră (NBF): O soluție tampon de formaldehidă 10%, cu pH 7,0-7,4, este utilizată în mod obișnuit în majoritatea laboratoarelor. Imediat după operație, țesutul este complet scufundat în soluție NBF 10% și temporizat. O soluție gata de utilizare este disponibilă de la diverși vânzători din SUA. Momentul fixării determină fixarea optimă, după cum se va discuta în continuare.

2. Soluție de paraformaldehidă (PFA): Soluția de PFA 4% proaspăt preparată produce rezultate similare și este rentabilă. Din cauza degradării sale rapide, această soluție se prepară proaspătă de fiecare dată înainte de utilizare.

Mecanismul de acțiune și cantitatea de formaldehidă din ambele soluții sunt aceleași.

Mecanismul de acțiune

Mecanismul de acțiune al fixării este prin încetarea rapidă a tuturor reacțiilor enzimatice în curs și a activităților metabolice prin denaturarea biomoleculelor intrinseci. Procedând astfel, enzimele proteolitice care altfel ar digera proba de țesut prin autoliză sunt denaturate, iar procesele autolitice sunt oprite. De asemenea, fixatorii protejează proba de daune extrinseci, deoarece sunt toxici pentru majoritatea microorganismelor obișnuite (în special pentru bacterii) care ar putea altfel coloniza o probă de țesut. În plus, mulți fixatori modifică chimic țesutul tratat pentru a fi mai puțin acceptabil pentru microorganismele oportuniste, împiedicând astfel procesul de putrefacție.

Mecanismul de fixare al formaldehidei este prin reticulare, sau prin crearea de legături chimice covalente, între reziduurile de aminoacizi, cel mai frecvent cel al reziduurilor de aminoacizi de lizină (grupări amino cu lanț lateral al lizinei), care au ca rezultat punți de metilenă. Legătura încrucișată a formaldehidei poate avea loc, de asemenea, între grupele aminometilol și lanțurile laterale fenol, indol și imidazol. În plus, formaldehida acționează asupra unei varietăți de aminoacizi, cum ar fi lizina, arginina, tirozina, asparagina, histidina, glutamina și serina. Fixatorii de reticulare mențin structurile interne ale unei probe și nu afectează semnificativ structura proteinei. Utilizarea formaldehidei este favorabilă, deoarece menține morfologia probei de țesut, iar structura secundară și terțiară a proteinelor nu este afectată și, prin urmare, este păstrată. S-a propus ca formaldehida să fie un fixator eficient datorită vitezei sale rapide de penetrare.

Modalități de fixare

Există două modalități de fixare a țesuturilor – imersiunea și perfuzia transcardială. Fixarea prin imersie presupune plasarea țesutului proaspăt recoltat într-o cantitate adecvată de fixator. Acesta este cel mai simplu și cel mai comun mod de fixare. Perfuzia transcardială, pe de altă parte, utilizează sistemul circulator pentru a răspândi fixatorul, care, atunci când este realizat cu pricepere, duce la o fixare rapidă și eficientă. Această tehnică are ca rezultat, în general, o morfologie bine conservată, cu o degradare minimă cauzată de autoliză sau putrefacție.

Pentru rozătoare și alte animale mici, perfuzia transcardială este foarte recomandată pentru obținerea celor mai bune rezultate. În urma perfuziei transcardiale, organul (organele) de interes recoltat(e) poate (pot) fi scufundat(e) în fixator pentru a asigura o fixare completă.

Lungimea de fixare

Un fixator trebuie expus la proba de țesut atât timp cât este necesar pentru ca soluția să pătrundă complet în probă. Pentru fixarea prin imersie, trebuie luați în considerare anumiți factori, cum ar fi densitatea probei de țesut, viteza de penetrare și temperatura. Este important de reținut că rata de penetrare și rata de fixare sunt două procese complet diferite ale unui fixator, cel de-al doilea procedând mai lent decât primul. O regulă generală de bază care se aplică pentru rata de penetrare este de 1 mm/oră. Se recomandă un timp de fixare de 24 de ore pentru probele tratate cu NBF.

Fixarea insuficientă (retragerea timpurie a fixativului din țesutul tratat) poate duce la o conservare slabă a morfologiei, în timp ce fixarea excesivă (retragerea târzie a fixativului din țesutul tratat) poate duce la artefacte de fixare, la pierderea semnalului sau la creșterea semnalelor de fond nespecifice („zgomot”). În general, nu se recomandă fixarea țesutului timp de mai mult de 36 de ore pentru a evita suprafixarea. Ambele sunt probleme care necesită soluții proprii și trebuie evitate atunci când se fixează o probă de țesut. Durata de expunere a unei probe la fixator este, prin urmare, un aspect foarte important care trebuie calibrat cu atenție.

După procesul de fixare, pot fi introduse artefacte pe măsură ce proba se usucă. Aceste artefacte pot fi sub formă de pierdere de organite, contracție nucleară și aglomerare artefactuală, astfel încât este vital să se mențină umedă proba tratată cu soluție tampon de fosfat/soluție salină pentru a continua să se conserve cu acuratețe proba.

Dimensiunea țesutului și volumul de fixativ

Fixativele nu sunt buni tamponi; prin urmare, pH-ul soluției tinde să se modifice în timpul procesului de fixare. Un volum mare de fixator va asigura o fixare optimă. Volumul de fixator utilizat trebuie să fie de aproximativ 15-20x volumul țesutului. Un volum mare va avea tendința de a realiza fixarea în mod adecvat, menținând în același timp reactivul stabil. Pentru cele mai bune rezultate, țesutul trebuie tăiat în bucăți cu o grosime maximă de 4-5 mm într-o singură dimensiune. În cazul în care țesutul de interes este necesar în alte scopuri/aplicații (teste moleculare etc.), acesta poate fi tăiat și congelat separat înainte de fixare.

Rezumat

• Fixarea trebuie efectuată imediat după operație/dizecție.

• Fixați țesutul în soluție de formaldehidă tampon neutră (NBF) 10% sau în soluție de paraformaldehidă 4% proaspăt preparată. Fixatorii pe bază de formaldehidă sunt preferați pentru conservarea pe termen lung a țesuturilor și se știe că produc cele mai bune rezultate pentru secționare, morfologie (H&E), colorații speciale și imunohistochimie.

• Tăiați țesutul în bucăți mai mici (max. 4-5 mm) și folosiți o cantitate amplă de fixator, asigurându-vă că țesutul este complet scufundat în fixator.

• Fixarea trebuie efectuată timp de cel mult 24-36 de ore, în funcție de dimensiunea țesutului. Sincronizarea expunerii unei probe la fixator este importantă și trebuie calibrată.

• Tesutul fixat trebuie transferat în PBS sau în etanol 70% și trimis pentru procesare pentru a pregăti blocuri de țesut.

Vă rugăm să consultați personalul laboratorului dacă trebuie să păstrați țesuturile fixate pentru o perioadă mai lungă de timp sau dacă aveți nevoie de sfaturi suplimentare privind fixarea și/sau expedierea probelor de țesut. Întrebările pot fi trimise prin e-mail la adresa [email protected].

Scris de:

: Hannah Bashar

Edit: Hannah Bashar

Edit: Hannah Bashar

Edit: Hannah Bashar Rajni Sharma, Ph.D.

.