A kifejeződés visszafordításának gyakorisága a kísérleti evolúcióban

Öt tanulmányt azonosítottunk, amelyek hat különböző adaptációs kísérletet végeztek, és az elemzésünkhöz megfelelő transzkriptom adatokat gyűjtöttek. Ez a hat kísérlet magában foglalta a magas hőmérsékletű környezethez alkalmazkodó E. coli 10 replikátumát17, a magas hőmérsékletű környezethez alkalmazkodó másik E. coli törzs 6 replikátumát18, a glicerines közeghez alkalmazkodó E. coli 7 replikátumát16, az E. coli 7 replikátumát16, az E. coli laktát közeghez alkalmazkodó 7 replikátja16, 12 különböző élesztőtörzs (Saccharomyces cerevisiae) xilulóz közeghez alkalmazkodó 1 replikátja19, és 2 replikátja alacsony ragadozási környezethez alkalmazkodó guppiknak (Poecilia reticulata)15. Összesen 44 adaptációs esetet elemeztünk.

Minden esetben transzkriptom-adatokat gyűjtöttünk az eredeti környezetben lévő szervezetekről (o az eredeti stádium esetében), röviddel az új környezetnek való kitettségük után (p a plasztikus stádium esetében), illetve az új környezetben történő kísérleti fejlődés befejezésekor (a az adaptált stádium esetében; 1a. ábra). Megjegyzendő, hogy az o és a p közötti idő olyan rövid, hogy várhatóan egyetlen újonnan keletkezett allél sem érte el a p stádiumban azt a számottevő gyakoriságot, amely hatással lenne a populáció átlagos fenotípusára. Az egyes gének expressziós szintjét tulajdonságként kezeljük. Legyen egy gén expressziós szintje az o, p és a stádiumban Lo, Lp, illetve La. Minden kísérletben először azonosítottuk azokat a géneket, amelyeknél a kifejeződési szintben érzékelhető PC-k vannak, megkövetelve, hogy a PC = |Lp-Lo| nagyobb legyen, mint egy előre beállított határérték. Azonosítottuk azokat a géneket is, amelyek expressziós szintje jelentős GC-vel rendelkezik, megkövetelve, hogy a GC = |La-Lp| nagyobb legyen, mint ugyanez az előre beállított határérték. Azon gének esetében, amelyeknél mind a PC, mind a GC értékelhető, megkérdeztük, hogy a két változás azonos irányú (azaz megerősödés) vagy ellentétes irányú (azaz visszafordulás; 1b., c. ábra). A fenti elemzésben az eredeti génexpressziós szint 20%-át (azaz 0,2Lo) használtuk határértékként. A 44 adaptációból 42 esetben az expressziós szint megerősödését mutató gének frakciója (CRI) kisebb, mint a reverziót mutató gének frakciója (CRV), és a CRI és CRV közötti különbség e 42 esetből 40 esetben szignifikáns (nominális P < 0,05; kétfarkú binomiális teszt; 1d. ábra). A CRI > CRV-vel rendelkező két adaptáció közül a különbség csak egy esetben szignifikáns (1d. ábra). Az expressziós szintreverzió általános túlsúlya (azaz 44 esetből 42 esetben) az adaptációban statisztikailag szignifikáns (P = 1,1 × 10-10, kétfarkú binomiális teszt). Ugyanez a tendencia nyilvánvaló, ha a határértéket 0,05Lo (Kiegészítő 1a. ábra) vagy 0,5Lo (Kiegészítő 2a. ábra) értékre változtatjuk, ami arra utal, hogy a fenti eredmény robusztus a határérték megválasztására. A transzkriptomikai adatok egyértelműen nem támasztják alá azt a hipotézist, hogy a plaszticitás általában elősegíti a genetikai adaptációt.

A metabolikus fluxus reverziója a környezeti adaptációban

A fenti megállapítás általánosságának felmérése és a mögöttes ok megértése érdekében kiterjesztettük a fenotípusos megerősödés és a metabolikus fluxus reverziója közötti összehasonlítást (lásd a Bevezetést). Mivel metabolikus elemzésünknek nem célja a fenti kísérleti evolúció vagy expressziós változások modellezése, a felhasznált paraméterek nem kapcsolódnak a kísérleti evolúcióhoz. Konkrétan a környezeti adaptáció során bekövetkező plasztikus és genetikai fluxusváltozásokat az iAF1260, a rekonstruált E. coli metabolikus hálózat23 segítségével számítással jósoltuk meg. Fluxusegyensúly-elemzést (FBA) használtunk a teljesen adaptált szervezetek optimalizált fluxusainak előrejelzésére az eredeti (o stádium), illetve az új (a stádium) környezetben, azzal a feltételezéssel, hogy a biomassza termelési rátát, a fitnesz helyettesítőjét, a természetes szelekció maximalizálja20. Az FBA-előrejelzések meglehetősen jól illeszkednek a kísérleti mérésekhez a környezetükhöz alkalmazkodott szervezetek esetében24,25,26,27,28,29 , és gyakran használják a genotípus-környezet-fenotípus kapcsolatok tanulmányozására22,27,29,30,31,32,33,34,35,36,37 . A környezeti változások hatására bekövetkező plasztikus fluxusváltozások előrejelzésekor (p szakasz) az FBA helyett a metabolikus alkalmazkodás minimalizálását (MOMA) alkalmaztuk, mivel a MOMA jobban reprezentálja a perturbációkra adott azonnali fluxusválaszt21 (lásd Módszerek). A metabolikus hálózat minden egyes reakciójának fluxusát tulajdonságként kezeltük, és a környezeti változásokat a hálózat számára elérhető szénforrás megváltoztatásával modelleztük. Az iAF1260-ban 258 különböző cserereakció van, amelyek mindegyike más-más szénforrást szállít. Ezért 258 különböző, egy szénforrással rendelkező környezetet vizsgáltunk.

Az elemzést úgy kezdtük, hogy az eredeti környezetben glükózt használtunk szénforrásként, mivel ez a környezet volt a viszonyítási alap az iAF1260 konstrukciójában23. Ezután az E. coli 257 új környezethez való alkalmazkodását vizsgáltuk, amelyek mindegyike más-más egyszénforrással rendelkezett. Azt találtuk, hogy ezek az új környezetek természetesen két csoportra oszlanak a MOMA által előre jelzett biomassza termelési sebességben, ami a p stádiumban lévő fitnesz (fp) helyettesítője (3. kiegészítő ábra). Az egyik csoportban az fp < 10-4, ami arra utal, hogy az E. coli valószínűleg nem tud fennmaradni ezekben az új környezetekben. Ezért a fennmaradó 50 új környezetre összpontosítottunk, amelyek fp > 10-4, és amelyekhez az E. coli feltehetően képes alkalmazkodni (Kiegészítő 1. táblázat).

A fluxus megerősödését és visszafordulását meghatározva és a transzkriptom-elemzéshez hasonlóan a 0,2Lo határértéket használva azt találtuk, hogy a CRV szignifikánsan nagyobb, mint a CRI (nominális P < 10-10, kétfarkú binomiális teszt) minden adaptációban. Annak a véletlen valószínűsége, hogy mind az 50 adaptáció CRV > CRI-t mutat, 1,8 × 10-15 (kétfarkú binomiális teszt; 2a. ábra), ami a fluxusreverzió általános túlsúlyára utal. A CRV átlaga és mediánja 30,2%, illetve 30,5%, míg a CRI-é csak 1,0%, illetve 0,8%. A fenti tendencia akkor is fennáll, ha a határértéket 0,05Lo (1b. kiegészítő ábra) vagy 0,5Lo (2b. kiegészítő ábra) értékre változtatjuk. Mivel egy FBA- vagy MOMA-problémának több megoldása is lehet, a reakciók sorrendje a sztöchiometriai mátrixban befolyásolhatja a megoldó által adott konkrét megoldást. Mindazonáltal, amikor véletlenszerűen megkevertük a reakciók sorrendjét az iAF1260-ban, a CRV > CRI általános mintázata nem változott (4a. kiegészítő ábra). Mivel a MOMA által megkövetelt kvadratikus programozást nehezebb megoldani, mint az FBA-ban használt lineáris programozást, a CRV-t a CRI-hez képest túlbecsülhettük. E potenciális probléma orvoslására megterveztünk egy kvadratikus programozáson alapuló MOMA-t, amelyet “MOMA-b”-nek neveztünk el, és FBA helyett azt használtuk az a szakaszban a fluxusok előrejelzésére (lásd Módszerek), de azt találtuk, hogy a CRV még mindig meghaladja a CRI-t (4b. kiegészítő ábra). Ez a tendencia tehát nem a MOMA és az FBA közötti megoldókülönbség technikai artefaktuma.

A fluxusreverzió nagyrészt visszaállítja az eredeti fluxusokat

A fluxusreverzió túlsúlya az eredeti környezettől függetlenül

A fluxusreverzió túlsúlyára vonatkozó eredményünk általánosságának vizsgálatára nem glükózos eredeti környezethez való alkalmazkodást is vizsgáltunk. Sok eredeti környezet esetében azonban csak kevés új környezethez alkalmazkodik az E. coli anyagcsere-hálózata. Ezért 41 eredeti környezetre összpontosítottunk (beleértve a korábban használt glükóz környezetet is), amelyek mindegyikéhez több mint 20 adaptálható (azaz fp > 10-4) új környezet tartozik (2. kiegészítő táblázat). Ezen eredeti környezetek mindegyikére kiszámítottuk az egyes adaptálható új környezetek CRI/CRV arányát, és azt találtuk, hogy az jellemzően 0,1-nél alacsonyabb (2d. ábra). Ezután minden eredeti környezetből kiszámítottuk az összes adaptálható új környezet CRI/CRV mediánját. A 41 eredeti környezetet tekintve a legnagyobb medián CRI/CRV 0,11, és a medián CRI/CRV mediánja mindössze 0,02. Ezért az eredeti környezettől függetlenül az új környezethez való genetikai alkalmazkodás során a fluxus visszafordulás sokkal gyakoribb, mint a megerősödés.

Miért gyakoribb a fenotípusos visszafordulás, mint a megerősödés

A megállapításunk, hogy a fenotípusos megerősödés nemhogy nem több, de valójában sokkal ritkább, mint a visszafordulás, váratlan, és ezért magyarázatot igényel. Ennek a tendenciának a megfigyelése mind a transzkriptomikai, mind a fluxomikai elemzésekben egy általános mögöttes mechanizmusra utal, amely szerintünk a PC > TC előfordulása. Geometriai szempontból nyilvánvaló, hogy amikor PC > TC, a GC-nek meg kell fordítania a PC-t (a 3a. ábra felső sorának bal és középső diagramja). Ezzel szemben, ha PC < TC, a visszafordítás és a megerősítés egyformán valószínű, ha nincs más torzítás (a 3a. ábra alsó sorának bal és középső diagramja). Legyen a PC > TC valószínűsége q (> 0). A CRI/CRV várhatóan / = (1 – q)/(1 + q) < 1. Más szóval, amíg PC > TC néhány tulajdonság esetében, a visszafordulás várhatóan gyakoribb lesz, mint a megerősödés (más torzítás nélkül).

A fenti magyarázat empirikus bizonyítékát keresve, a kísérleti evolúció mind a 44 esetére kiszámítottuk azoknak a géneknek a hányadát, amelyek expresszióváltozása megfelel a PC > TC-nek (3b. ábra). Az átlagos és a medián frakció 0,51, illetve 0,48. Továbbá, miután eltávolítottuk az összes olyan gént, amelyek esetében PC > TC, már nincs többlet reverzió (5a. kiegészítő ábra), ami magyarázatunk elégséges voltát jelzi. Hasonlóképpen kiszámítottuk a PC > TC-t mutató metabolikus reakciók hányadát az E. coli metabolikus hálózatának a glükóz környezetből mind az 50 új környezetbe való adaptációja során (3c. ábra). Az átlagos és a medián frakció 0,85 és 0,93. Hasonlóképpen, a PC > TC-t mutató reakciók eltávolítása után nincs általános tendencia, hogy az 50 adaptációban több lenne a visszafordulás, mint a megerősödés (5b. kiegészítő ábra). Ezek a transzkriptom és fluxom eredmények alátámasztják, hogy a megerősítéshez viszonyított reverzió többletét a PC > TC előfordulása magyarázza a tulajdonságok nem elhanyagolható hányadánál.

Miért haladja meg a PC a TC-t sok tulajdonság esetében? Az egyik valószínű ok az, hogy a PC lehetővé teszi az organizmusok számára a túlélést egy hirtelen környezeti változáskor, de a fitnesz sokkal kisebb, mind az eredeti környezetben, mind az új környezethez való alkalmazkodás után. Így az organizmusok általános fiziológiai állapota meglehetősen hasonló lehet az eredeti és az új környezetben adaptált szakaszok között, de a környezeti váltás után közvetlenül az alacsony fitneszű plasztikus szakaszban sokkal eltérő. Ez megmagyarázhatja, hogy a PC miért haladja meg a TC-t számos tulajdonság esetében, függetlenül attól, hogy a tulajdonságértékek a szervezet fitneszének és fiziológiájának okai vagy következményei.

A fenti modellre erős bizonyítékot találtunk a metabolikus hálózatelemzéssel. Először is, a megjósolt biomassza termelési sebességet a fitnesz helyettesítőjeként használva összehasonlítottuk az E. coli fitneszét a plasztikus szakaszban (fp) és az új környezethez való alkalmazkodás után (fa), az eredeti glükózkörnyezethez képest, mind az 50 új környezethez való alkalmazkodás esetében. Minden esetben fp < 1 (3d. ábra), ami megerősíti, hogy a környezeti változások a genetikai adaptáció előtt fitneszcsökkenést okoznak. Azt találtuk, hogy az fa jellemzően közel 1, bár néhány új környezetben sokkal >1 (3d. ábra). Log10-es skálán az fp az 50 adaptáció közül 43-ban jobban eltér 1-től, mint a fa (P = 1,0 × 10-7; egyfarkú binomiális teszt). Másodszor, a modellünk összefüggést feltételez a fluxusváltozások és a fitneszváltozások között22. A glükózkörnyezetből származó 50 adaptációban erős negatív korreláció van az fp és az átlagos PC között (Spearman ρ = -0.98, P < 10-300; 3e. ábra). A fa és az átlagos TC között ellentétes korreláció áll fenn (ρ = 0,57, P = 1,1 × 10-5; 3f. ábra). Elemzéseink együttesen azt mutatják, hogy az adaptáció során a fenotípusos reverzió nagyobb gyakoriságának, mint a megerősödésnek az elsődleges oka az, hogy a p stádiumban lévő szervezetek a fitnesz és a kapcsolódó fenotípusok szempontjából jobban különböznek az o stádiumban lévőkhöz képest, mint az a stádiumban lévők.

Fenotípusos reverzió véletlenszerű metabolikus hálózatokban

A génexpressziós szint és a metabolikus fluxus PC-k és GC-k az adaptáció során az adott faj szabályozó hálózatától, illetve metabolikus hálózatától függnek. Mivel ezek a hálózatok több milliárd éves evolúció eredménye, felmerül a kérdés, hogy a fenotípusos reverzió túlsúlya a vizsgált faj evolúciós történetének tulajdonítható-e, különösen annak a környezetnek, amelyben a faj és ősei a múltban szelektálódtak, vagy bármely funkcionális rendszer belső tulajdonsága. E kérdés megválaszolására ugyanezt az elemzést alkalmaztuk 500 funkcionális véletlenszerű anyagcsere-hálózatra, amelyeket korábban generáltunk22. Ezeket a hálózatokat az iAF1260-ból úgy állítottuk össze, hogy reakcióit véletlenszerűen kiválasztott reakciókkal cseréltük fel a Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes38 összes metabolikus reakciójának univerzumából, amennyiben a hálózatnak minden egyes reakciócserénél nem nulla FBA-előrejelzett fitneszértéke van a glükózkörnyezetben39.

Az 500 véletlen hálózatból legalább 20 új környezethez képes alkalmazkodni az iAF1260 (a glükózkörnyezetből). Ezért elemeztük a véletlen hálózatok alkalmazkodását mind a 20 új környezethez, úgy, hogy a glükóz környezet volt az eredeti környezet. Minden egyes új környezet esetében az összes olyan véletlenszerű hálózat CRV mediánja, amely képes alkalmazkodni ehhez a környezethez, általában 0,1 körül van (dobozdiagramok a 4a. ábrán), a medián CRV mediánja pedig 0,11 volt. Ezzel szemben a CRI mediánja a véletlen hálózatok között egy új környezetben általában 0,01 alatt van (4b. ábra keretes ábrái), a CRI mediánjának mediánja pedig 0,0033. A CRI/CRV arány mediánja az új környezet véletlenszerű hálózatain általában 0,05 alatt van (4c. ábra keretes ábrája), a CRI/CRV mediánjának mediánja pedig 0,0033. Nyilvánvaló, hogy a fluxusvisszafordulás túlsúlya a funkcionális véletlen hálózatokban is nyilvánvaló, ami arra utal, hogy ez a tulajdonság minden funkcionális metabolikus hálózatnak sajátja, nem pedig az adott evolúciós történetek terméke. Valójában a tényleges organizmusok e tulajdonságának mechanisztikus magyarázata (3. ábra) az itt vizsgált véletlenszerű anyagcsere-hálózatokra is érvényes. Konkrétan, a PC > TC-t mutató reakciók aránya jelentős (4d. ábra) és az fp többnyire 1-nél kisebb (4e. ábra). Továbbá, fp általában jobban eltér 1-től, mint fa a log10-es skálán, mivel a |log10fp|-|log10fa| nagyrészt pozitív (4f. ábra).

Érdekes módon azonban a 20 új környezetből 19 esetében az E. coli metabolikus hálózat CRV értéke meghaladja a random hálózatok CRV mediánját (4a. ábra). Hasonló, de kevésbé nyilvánvaló tendencia érvényes a CRI-re (4b. ábra). A 20 új környezetből 16 esetében az E. coli CRI/CRV kisebb, mint a véletlen hálózatok CRI/CRV mediánja (P = 0,012, kétfarkú binomiális teszt; 4c. ábra). Ezért, bár mind az E. coli metabolikus hálózat, mind a véletlen hálózatok a fluxusvisszafordulás túlsúlyát mutatják, ez a jelenség az E. coli esetében kifejezettebb. Mechanisztikailag ez az eltérés legalábbis minőségileg megmagyarázható az előző szakaszban bemutatott modellünkkel. Konkrétan, a 20 új környezetből 15 esetében a PC > TC értékű E. coli reakciók frakciója meghaladja a megfelelő medián frakciót a véletlen hálózatokban (P = 0,021, egyfarkú binomiális teszt; 4d. ábra). Mind a 20 új környezetben az E. coli fp-je alacsonyabb, mint a véletlen hálózatok fp-jének mediánja (P = 9,5 × 10-7, egyfarkú binomiális teszt; 4e. ábra). A 20 új környezetből 19 esetében az E. coli esetében a |log10 fp| – |log10 fa| nagyobb, mint a véletlen hálózatok megfelelő mediánértéke (P = 2,0 × 10-5, egyfarkú binomiális teszt; 4f. ábra). De miért alacsonyabb az E. coli fp értéke, mint a véletlen hálózatoké? Az egyik lehetséges magyarázat az, hogy az E. coli metabolikus hálózatának összetétele és szerkezete evolúciósan a glükózkörnyezetben és/vagy rokon környezetben való növekedésre lett optimalizálva, míg ugyanez nem igaz a random hálózatokra, amelyeknek csak a glükózkörnyezetben kellett életképesnek lenniük. Ennek eredményeképpen, amikor a glükózt egy új szénforrással helyettesítjük egy új környezetben, az E. coli fittsége jelentősen csökken, de a véletlen hálózatoké csak enyhén csökkenhet. Bár az abszolút fitnesz a plasztikus szakaszban az E. coli esetében magasabb lehet, mint a véletlen hálózatok esetében, a relatív fitnesz, ami az fp, várhatóan alacsonyabb lesz az E. coli esetében, mint a véletlen hálózatok esetében. Így a fluxusreverziónak a megerősítéshez viszonyított nagyobb gyakorisága az E. coliban, mint a véletlen hálózatokban, valószínűleg az E. coli erősebb szelekciójának mellékterméke a véletlen hálózatokhoz képest az adaptációs elemzésünkben használt eredeti környezetben.

A reverzió legalább olyan gyakori, mint a megerősítés, még az értékelhető TC-vel rendelkező tulajdonságok esetében is

A transzkriptomok (1d. ábra) és fluxomok (2a. ábra) fenti elemzéseiben minden olyan tulajdonságot figyelembe vettünk, amely értékelhető PC-t és GC-t mutat. Az összehasonlító és evolúciós vizsgálatokban azonban a p stádiumban lévő fenotípusok jellemzően hozzáférhetetlenek. Ennek következtében az összehasonlító és evolúciós biológusok általában azokra a tulajdonságokra összpontosítanak, amelyek fenotípusos értékei különböznek az o és a stádiumok között, annak ellenére, hogy a többi tulajdonság is áteshetett adaptív változásokon (a p stádiumbeli értékekről az a stádiumbeli értékekre). Annak vizsgálatára, hogy a fenti megállapításaink érvényesek-e azokra a tulajdonságokra, amelyekkel a legtöbb összehasonlító és evolúcióbiológus foglalkozik, a fent elemzett tulajdonságok egy részhalmazára összpontosítunk, amelyek megfelelnek a TC > 0,2Lo feltételnek. A 44 kísérleti evolúciós esetből 33 esetben CRV > CRI (P = 0,0013, kétfarkú binomiális teszt), ebből 30 esetben a CRV szignifikánsan meghaladja a CRI-t (nominális P < 0,05; kétfarkú binomiális teszt; 5a. ábra). Az E. coli metabolikus hálózatának a glükózkörnyezetből származó 50 környezeti adaptációja közül három esetben volt azonos számú fluxusvisszafordulás és megerősödés. A fennmaradó 47 eset közül 22 esetben több volt a reverzió, mint a megerősödés, míg 25 esetben éppen ellenkezőleg (P = 0,77, kétfarkú binomiális teszt; 5b. ábra). Ha a CRI szignifikánsan különbözik a CRV-től, 15 esetben a CRV < CRI volt, míg 11 esetben ennek ellenkezője (P = 0,70, kétfarkú binomiális teszt; 5b. ábra). Ennélfogva még a TC > 0,2Lo értékű tulajdonságok között sincs bizonyíték arra, hogy a megerősítés szignifikánsan több lenne, mint a visszafordítás. Megjegyzendő, hogy a fenti metabolikus elemzésben adaptációnként átlagosan 139 reakció felelt meg a TC > 0,2Lo értéknek. Mivel a fitnesz maximalizálása során megfigyelt összes fluxusváltozás szükséges, és ezért definíció szerint előnyös, nyilvánvalóan még egy egyszerű szénforrás-változáshoz való alkalmazkodás is sokkal több reakciót foglal magában, mint néhány.

.