Huvudpunkter:

• Färsk skördad vävnad av intresse bör omedelbart fixeras för att undvika nedbrytning.

• 10% neutral buffrad formalin (NBF) eller 4% paraformaldehydlösning (PFA) används vanligen för histologi. Dessa är effektiva fixeringsmedel för H&E och de flesta immunohistokemiska (IHC) markörer och specialfärgningar.

• Optimal fixering är nyckeln till bästa histopatologiska resultat.

Introduktion till vävnadsfixering

De grundläggande testerna inom anatomisk patologi och mikroskopisk undersökning av vävnad kräver optimal fixering, bearbetning, sektionering och färgning av vävnad. Fixering är ett kritiskt inledande steg i histologin. Dålig fixering kan leda till flera felaktiga resultat inklusive specialfärgningar, immunohistokemi och andra histologiska tekniker. En väl konserverad vävnad behåller sin struktur och sin reaktivitet för reagenser som specialfärgningar, antikroppar för immunohistokemi och nukleinsyraprober för in situ-hybridiseringsanalyser. Både underfixering och överfixering kan orsaka en hel del problem inom histologin, men underfixering kan vara ett större problem än överfixering och måste undvikas. Fixering av fettvävnad som hjärnvävnad från människa, råtta eller mus kan kräva särskild uppmärksamhet. En optimal vävnadsfixering säkerställer bevarandet av cellulära och extracellulära strukturer för att uppnå tunna snitt, optimal histokemisk färgning samt långsiktigt bevarande och arkivering. Här diskuterar vi kortfattat de viktiga faktorerna för att uppnå optimal fixering för både mänsklig och veterinär vävnad.

Vad är vävnadsfixering?

Fixering är en kemisk process genom vilken biologisk vävnad bevaras för att i möjligaste mån representera provets in vivo-tillstånd. För att bevara ett vävnadsprov i ett tillstånd som ligger så nära livet som möjligt måste post mortem-processerna autolys, dvs. självnedbrytning genom proteolytiska enzymer, och/eller putrefikation, dvs. nedbrytning av organiskt material genom mikroorganismers inverkan, stoppas. Ett idealiskt fixeringsmedel bör bevara det givna vävnadsprovet på ett sätt som är representativt för dess situation in vivo; cellulär och extracellulär morfologi bör bevaras och fixeringsmedlet bör inte denaturera proteiner som är viktiga för histopatologisk analys.

Gemensamma fixeringsmedel för histologi

Det finns ett antal fixeringsmedel och användningen av en viss typ dikteras av den efterföljande analysen. För histologi är de mest effektiva och vanligaste fixeringsmedlen aldehydbaserade. Följande fixeringsmedel rekommenderas för H&E-färgning och de flesta IHC-markörer och specialfärgningar:

1. Neutral buffrad formalin (NBF): En 10 % formaldehydbuffertlösning med pH 7,0-7,4 används vanligen i de flesta laboratorier. Omedelbart efter operationen sänks vävnaden helt ner i 10 % NBF-lösning och tidsbestäms. En färdig lösning finns tillgänglig från olika leverantörer i USA. Tidpunkten för fixering avgör den optimala fixeringen, vilket diskuteras vidare.

2. Paraformaldehydlösning (PFA): Nyberedd 4 % PFA-lösning ger liknande resultat och är kostnadseffektiv. På grund av dess snabba nedbrytning förbereds denna lösning ny varje gång före användning.

Ansvarsmekanismen och mängden formaldehyd i båda lösningarna är densamma.

Ansvarsmekanism

Fixeringens verkningsmekanism sker genom att snabbt avsluta alla pågående enzymatiska reaktioner och metaboliska aktiviteter genom att denaturera inneboende biomolekyler. Genom att göra detta denatureras proteolytiska enzymer som annars skulle smälta vävnadsprovet genom autolys och autolytiska processer stoppas. Fixeringsmedel skyddar också provet från yttre skador eftersom de är giftiga för de flesta vanliga mikroorganismer (särskilt bakterier) som annars kan kolonisera ett vävnadsprov. Dessutom ändrar många fixeringsmedel kemiskt den behandlade vävnaden så att den blir mindre smaklig för opportunistiska mikroorganismer, vilket förhindrar förruttnelseprocessen.

Formaldehyds fixeringsmekanism är genom tvärbindning, eller skapande av kovalenta kemiska bindningar, mellan aminosyrarester, oftast vanligen aminosyran lysinrester (sidokedjans aminogrupper av lysin), vilket resulterar i metylenbryggor. Korsbindning av formaldehyd kan också ske mellan aminometylolgrupperna och fenol-, indol- och imidazolsidokedjor. Formaldehyd verkar dessutom på en rad olika aminosyror, t.ex. lysin, arginin, tyrosin, asparagin, histidin, glutamin och serin. Korsbindande fixeringsmedel bibehåller provets inre strukturer och skadar inte proteinets struktur nämnvärt. Användningen av formaldehyd är fördelaktig eftersom det bibehåller vävnadsprovets morfologi och den sekundära och tertiära proteinstrukturen är opåverkad och därmed bevarad. Det har föreslagits att formaldehyd är ett effektivt fixeringsmedel på grund av dess snabba penetrationshastighet.

Fixeringsmetoder

Det finns två sätt att fixera vävnad – nedsänkning och transkardiell perfusion. Fixering genom nedsänkning innebär att nyskördad vävnad placeras i en tillräcklig mängd fixeringsmedel. Detta är det enklaste och vanligaste sättet att fixera. Vid transkardiell perfusion används däremot cirkulationssystemet för att sprida fixeringsmedlet, vilket när det utförs skickligt resulterar i snabb och effektiv fixering. Denna teknik ger i allmänhet en välbevarad morfologi med minimal nedbrytning på grund av autolys eller förruttnelse.

För gnagare och andra smådjur rekommenderas starkt transkardiell perfusion för att uppnå bästa resultat. Efter transkardiell perfusion kan det eller de organ som ska tas upp för att säkerställa fullständig fixering nedsänkas i fixeringsmedlet.

Fixeringslängd

Ett fixeringsmedel bör exponeras för vävnadsprovet så länge som krävs för att lösningen ska penetrera provet fullständigt. Vid fixering genom nedsänkning måste vissa faktorer beaktas, t.ex. vävnadsprovets densitet, penetrationshastighet och temperatur. Det är viktigt att notera att penetrationshastighet och fixeringshastighet är två helt olika processer för ett fixeringsmedel, där den senare går långsammare än den förra. En allmän tumregel för penetrationshastigheten är 1 mm/timme. En fixeringstid på 24 timmar rekommenderas för NBF-behandlade prover.

Underfixering (tidigt tillbakadragande av fixeringsmedlet från den behandlade vävnaden) kan leda till dåligt morfologiskt bevarande, medan överfixering (sent tillbakadragande av fixeringsmedlet från den behandlade vävnaden) kan leda till fixeringsartefakter, signalförlust eller ökade ospecifika bakgrundssignaler (”brus”). Generellt rekommenderas inte att fixera vävnaden i mer än 36 timmar för att undvika överfixering. Båda är problem som kräver egna lösningar och måste undvikas när man fixerar ett vävnadsprov. Varaktigheten av ett provs exponering för fixeringsmedlet är således en mycket viktig fråga som måste kalibreras noggrant.

Efter fixeringsprocessen kan artefakter introduceras när provet torkar. Dessa artefakter kan vara i form av förlust av organeller, kärnkrympning och artefaktuell klumpning, så det är viktigt att hålla det behandlade provet fuktigt med fosfatbuffert/saltlösning för att fortsätta att bevara provet på ett korrekt sätt.

Vävnadens storlek och volymen fixeringsmedel

Fixeringsmedel är dåliga buffertar; därför tenderar lösningens pH att förändras under fixeringsprocessen. En stor volym fixeringsmedel säkerställer en optimal fixering. Volymen fixeringsmedel som används bör vara ungefär 15-20 gånger vävnadens volym. En stor volym tenderar att ge en tillfredsställande fixering samtidigt som reagenset hålls stabilt. För bästa resultat bör vävnaden skäras i bitar som inte är mer än 4-5 mm tjocka i en dimension. Om vävnaden av intresse behövs för andra ändamål/tillämpningar (molekylära tester etc.) kan den skäras och snabbfrysas separat före fixering.

Sammanfattning

• Fixering måste utföras omedelbart efter kirurgi/dissektion.

• Fixera vävnaden i en lösning av 10 % neutral buffertformaldehyd (NBF) eller i en nyberedd 4 % paraformaldehydlösning. Formaldehydbaserade fixeringsmedel är att föredra för långtidskonservering av vävnad och är kända för att ge bästa resultat vid sektionering, morfologi (H&E), specialfärgningar och immunohistokemi.

• Skär vävnaden i mindre bitar (max 4-5 mm) och använd rikligt med fixeringsmedel och se till att vävnaden är helt nedsänkt i fixeringsmedlet.

• Fixeringen måste utföras i högst 24-36 timmar beroende på vävnadens storlek. Tidpunkten för exponering av ett prov för fixeringsmedlet är viktig och måste kalibreras.

• Fixerad vävnad ska överföras till PBS eller 70 % etanol och skickas för bearbetning för att förbereda vävnadsblock.

Sök laboratoriepersonal om du behöver förvara fixerad vävnad under en längre tid eller om du behöver ytterligare råd om fixering och/eller sändning av vävnadsprover. Frågor kan skickas till [email protected].

Skrivet av: Hannah Bashar

Redigerad av: Hannah Bashar

Redigerad av: Rajni Sharma, Ph.D.