A manutenção a longo prazo de muitas formas de plasticidade sináptica requer a síntese de novas proteínas. Enquanto o papel da transcrição do gene somático dependente de experiência na memória a longo prazo tem sido bem estudado, muitos mRNAs são traficados para dendritos sugerindo um papel adicional para o controle sináptico local da síntese protéica. De fato, a tradução dependente de atividade do mRNA dendrítico pré-existente na sinapse é necessária para a expressão de múltiplas formas de plasticidade sináptica . A proteína de retardo mental Frágil X (FMRP) influencia esta plasticidade sináptica por funcionar como um regulador chave da tradução do mRNA .

FMRP foi caracterizada pela primeira vez no contexto da síndrome do X Frágil. O gene FMR1 é silenciado no Fragile X (FX), e a consequente perda da FMRP leva aos sintomas da desordem, muitas vezes incluindo incapacidade intelectual e autismo. No modelo de rato Fmr1 KO , a perda da FMRP resulta em níveis aumentados de síntese de proteínas . Acredita-se que as conseqüências deste aumento estão no centro da fisiopatologia de FX. Progresso rápido tem sido feito caracterizando como a perda de FMRP influencia a função sináptica e plasticidade, e este conhecimento tem levado a várias estratégias para corrigir o distúrbio que têm sido validadas em animais e agora estão sendo testadas em humanos .

Aqui revisamos brevemente as evidências, principalmente do rato Fmr1 KO, sugerindo um papel para FMRP na plasticidade sináptica. Embora a distinção nem sempre seja clara, é conceitualmente importante separar as perturbações da plasticidade sináptica que são conseqüências do desenvolvimento cerebral alterado daquelas perturbações da plasticidade sináptica que causam alteração da função cerebral no Fmr1 KO. Embora ambos sejam importantes para a compreensão da fisiopatologia da doença, apenas este último é relevante para a questão de como a FMRP contribui para a plasticidade sináptica no cérebro do tipo selvagem.

FMRP regula a tradução

FMRP é uma proteína de ligação do RNA e um repressor da tradução que é bem conservada do rato para o humano. FMRP associa com mRNAs através de um dos três domínios de ligação do RNA , em alguns casos em conjunto com proteínas adaptadoras . Há evidências de que a FMRP pode reprimir a tradução tanto bloqueando a iniciação quanto o alongamento . Uma mutação pontual em um domínio de ligação FMRP/mRNA é suficiente para recapitular fenótipos de plasticidade vistos no rato Fmr1 KO e em pelo menos um caso FX em um paciente humano . Assim é provável que a FMRP regula a plasticidade principalmente em seu papel de repressor de tradução.

FMRP é regulada por modificações pós-tradução. A FMRP fosforilada bloqueia a translocação ribossômica e inibe a tradução, enquanto a desfosforilação da FMRP upregula a tradução . A regulação bidirecional da fosforilação FMRP pela cinase S6 e fosfatase protéica 2A (PP2A) em resposta à atividade fornece uma ligação potencial entre a estimulação sináptica e a tradução local .

FMRP está bem posicionada para regular a plasticidade sináptica

FMRP está bem posicionada para ser um regulador chave da plasticidade sináptica por três razões principais. Primeiro, a proteína é encontrada em espinhas dendríticas , importantes locais pós-sinápticos de indução e manutenção da plasticidade. Em segundo lugar, FMRP regula a tradução do mRNA dendrítico , que é necessário para múltiplas formas de plasticidade . Finalmente, a própria FMRP é regulada dinamicamente pela atividade: a experiência e a ativação sináptica podem desencadear sua tradução local e sua rápida degradação, além da regulação pós-traducional mencionada acima. Múltiplas manipulações experimentais associadas à plasticidade sináptica têm demonstrado aumentar os níveis de FMRP, incluindo a exposição a um ambiente enriquecido, uma complexa tarefa de aprendizagem e a ativação farmacológica dos receptores metabótropicos glutatados do grupo 1 (mGluRs) . É importante ressaltar que a FMRP é sintetizada rapidamente, na mesma escala de tempo (10-30 minutos) da indução de plasticidade sináptica estável. Em culturas hipocampais, aumentos dependentes de atividade e mGluR na FMRP dendrítica podem resultar do aumento do tráfico da FMRP existente, em vez da síntese da FMRP de novo. De qualquer maneira, FMRP é um candidato ideal para estar envolvido na regulação da plasticidade sináptica por causa de seu rápido e transitório aumento de dendritos seguindo paradigmas bem caracterizados de indução de plasticidade, assim como seu papel como inibidor de tradução.

FMRP regula mGluR-LTD via síntese de proteínas

Potenciação a longo prazo (LTP) e depressão a longo prazo (LTD) são formas bem caracterizadas de plasticidade sináptica associada com aprendizagem e memória. Estas mudanças persistentes na força sináptica podem ser induzidas por uma variedade de manipulações e seus mecanismos de expressão são diversos. Diferentes protocolos de indução dependem de diferentes mecanismos de manutenção, incluindo a exigência de síntese de proteínas. Um exemplo particularmente convincente de uma forma de plasticidade que requer tradução local é o LTD metabótropo dependente do receptor de glutamato (mGluR-LTD) na região CA1 do hipocampo. A ativação dos grupos 1 mGluRs (mGluR1 e 5), seja com estimulação sináptica de baixa frequência (PP-LFS) ou com o agonista seletivo (S)-3,5-dihidroxifenilglicina (DHPG) , resulta em uma diminuição persistente da força sináptica, mecanisticamente distinta da LTD clássica dependente do receptor NMDA (NMDAR). É importante notar que existem vários mecanismos a jusante da activação do mGluR que podem deprimir a transmissão sináptica, e estes podem ser expressos diferentemente dependendo do protocolo de indução, idade, história de criação e espécies (por exemplo, ). No entanto, sob condições experimentais apropriadas, a manutenção do mGluR-LTD requer síntese rápida de proteínas dentro de minutos após a indução. Esta síntese protéica é provavelmente sináptica, pois mGluR-LTD ainda pode ser induzida se a camada dendrítica for fisicamente separada da camada celular do corpo . mGluR-LTD é expressa, em parte, pela remoção dos receptores AMPA das sinapses, o que também requer uma rápida tradução de novo . A nova síntese protéica pode ser instrutiva e não meramente permissiva para plasticidade sináptica, já que a ativação dos mGluRs do grupo 1 estimula rapidamente a síntese protéica em fatias hipocampais, dendritos e sinaptoneurosomas .

Fmr1 knockout mGluR-LTD (Tabela 1). Um estudo subsequente encontrou um realce semelhante no mGluR-LTD cerebelar, que compartilha muitos dos mesmos mecanismos de expressão . Consistente com os dados eletofisiológicos, a perda da FMRP leva à internalização excessiva do mGluR-mediated AMPAR . Além disso, o mGluR-LTD já não requer nova síntese de proteínas nos ratos Fmr1 KO . Estes resultados, combinados com o que é conhecido sobre a função FMRP, sugerem que a FMRP age para inibir a síntese de proteínas necessárias para o mGluR-LTD. Na ausência da FMRP, estas “proteínas LTD” já estão disponíveis ou super-expressas em dendritos resultando em maior magnitude e persistência da síntese protéica independente desta forma de plasticidade (Figura 1A) . Pelo contrário, a superexpressão pós-natal da FMRP reduz a magnitude do mGluR-LTD tanto em neurônios tipo selvagem quanto em neurônios Fmr1 KO e restaura sua dependência da síntese protéica. Além disso, a redução da sinalização de mGluR5 em camundongos Fmr1 KO restaura tanto a taxa de síntese protéica quanto a magnitude LTD no hipocampo a níveis do tipo selvagem, sugerindo que mGluR5 e FMRP atuam em oposição funcional para manter um nível ótimo de síntese protéica sináptica ao longo do desenvolvimento e até a idade adulta (Figura 1A).

L-LTP parece normal em ratos Fmr1 KO

Embora os efeitos da inibição da síntese protéica no mGluR-LTD possam ser vistos em minutos, a maioria das formas de plasticidade sináptica não requerem nova síntese até várias horas após a indução. Isto é melhor caracterizado pela fase tardia do LTP (L-LTP), uma forma persistente de potenciação que dura pelo menos 4 horas. A fase de manutenção tardia do L-LTP requer síntese de proteínas, mas a indução inicial não . Devido ao papel conjeturado da FMRP na regulação da tradução, o L-LTP foi uma das primeiras formas de plasticidade estudada no rato Fmr1 KO . Curiosamente, nenhuma diferença foi encontrada na magnitude do L-LTP no rato Fmr1 KO . O fato de que a remoção da FMRP afeta o LTD dependente da síntese protéica mas não o LTP sugere que a FMRP pode especificamente regular a translação das proteínas necessárias para a expressão do LTD (Figura 1B). Entretanto, enquanto a magnitude do L-LTP não é alterada, é possível que o L-LTP seja qualitativamente diferente em sua necessidade de nova síntese protéica quando a FMRP está ausente, como é o caso do mGluR-LTD (e LTP priming, ver abaixo). Portanto, será importante testar a dependência da síntese protéica de L-LTP em ratos Fmr1 KO para mostrar que a FMRP realmente não tem um papel na regulação da persistência de LTP.

Alternativamente, a FMRP pode ser requerida para a regulação da tradução local mas não somática no contexto de L-LTP (Figura 1C). O L-LTP é tradicionalmente induzido por múltiplos trens de tétano de alta freqüência ou estimulação theta burst, protocolos que dependem de transcrição e tradução em toda a célula. O L-LTP foi caracterizado no rato Fmr1 KO utilizando estes paradigmas clássicos . No entanto, usando um protocolo de indução menos intenso resulta em L-LTP que é mantido especificamente pela tradução dendrítica local . Esta forma de L-LTP, semelhante ao mGluR-LTD, é sensível a inibidores de tradução mas não de transcrição, e pode ser mantida em dendritos isolados. Será interessante determinar se esta forma de L-LTP expressa localmente é regulada pelo FMRP.

FMRP regula o priming LTP

Embora o papel do FMRP no L-LTP não seja claro, o FMRP é conhecido por estar envolvido no LTP em outros contextos. Em particular, FMRP está envolvida na regulação de uma forma de metaplasticidade dependente de mGluR que estabelece o limiar para LTP. Originalmente descrito em ratos, a fraca ativação dos mGluRs do grupo 1, por si só insuficiente para a indução de LTP, facilita a subseqüente indução de LTP (“LTP priming”). Tal como no mGluR-LTD, esta facilitação requer tradução mas não transcrição . Isso levou ao exame do papel do FMRP no priming do LTP. O priming dependente do mGluR do LTP é de magnitude comparável em ratos WT e Fmr1 KO; entretanto, enquanto o priming do LTP requer estimulação aguda da síntese de proteínas em ratos WT, ele não é mais dependente da síntese de proteínas no Fmr1 KO. Assim, enquanto o mGluR-LTD e o LTP priming são consequências funcionais qualitativamente diferentes da síntese protéica estimulada por Gp1 mGluR no hipocampo, ambos os processos são alterados pela remoção da FMRP (Figura 1D). Estes resultados sugerem que o mRNA sob controle translacional da FMRP pode codificar as proteínas necessárias para as mudanças bidirecionais na força sináptica. Assim, as proteínas reguladas pela FMRP devem ser conceituadas como gatekeepers de plasticidade ao invés de apenas “proteínas LTD”

O limiar de indução para LTP e STD-LTP é elevado em ratos Fmr1 KO

Em cortes hipocampais Fmr1 KO, a indução de LTP é deficiente com um protocolo de ruptura de 5 teta fraca, mas é normal com um protocolo de ruptura de 10 teta forte (Figura 2A) . Além disso, o FMRP modula o limiar de indução para a potenciação de longo prazo dependente do tempo de pico (STD-LTP). Esta forma de plasticidade Hebbiana é induzida por atividade pré-sináptica e pós-sináptica temporalmente escalonada dentro de uma janela muito curta . Em corticais somatosensoriais e pré-frontais, o STD-LTP é deficiente em neurônios Fmr1 KO . Entretanto, se a força do estímulo pós-sináptico for aumentada de um único pico para um estouro de cinco picos, o STD-LTP ocorre nos neurônios KO (Figura 2A) . Portanto, a FMRP não é necessária para a expressão de STD-LTP, mas o limiar é aumentado na sua ausência. Um possível mecanismo para regulação contínua dos limiares de LTP pela FMRP é discutido posteriormente nesta revisão.

FMRP e outras formas de plasticidade dependentes de tradução

Além do seu papel nas formas de plasticidade Hebbian dependentes de tradução, FMRP também pode modular algumas formas de plasticidade homeostática. A escala sináptica é uma forma de plasticidade homeostática que atua para manter a força das sinapses dentro de uma faixa funcional em resposta a mudanças extremas na atividade. Em geral, uma diminuição da actividade leva a um subsequente aumento da força sináptica em toda a célula (“aumento de escala”) e um aumento da actividade leva a uma diminuição da força sináptica (“diminuição de escala”). Dois tipos de aumento de escala têm sido descritos na cultura da fatia hipocampal: um que requer transcrição e outro que requer tradução local . Curiosamente, apenas a forma de escalada sináptica dependente de tradução é deficiente em neurônios sem FMRP. A expressão viral pós-sináptica da FMRP corrige o escalonamento deficiente dependente de tradução nos neurônios Fmr1 KO . A diminuição de sinapses em resposta a altos níveis de atividade (após bloqueio prolongado de inibição) também tem sido observada e requer ativação do mGluR5 . Entretanto, o papel da FMRP e da síntese local de proteínas na diminuição da escala não foi diretamente examinado.

Embora o papel da FMRP tenha sido melhor caracterizado nas formas de plasticidade dependentes do mGluR, ele não é específico para estes receptores. A remoção da FMRP oclui aumentos mediados por TrkB na síntese protéica e altera outras formas de receptores G acoplados à proteína (GPCR)-dependentes do LTD e LTP . O fio comum entre estes processos é a sua dependência da tradução dendrítica local. De fato, evidências sugerem que a FMRP pode ser especificamente importante para a regulação da tradução local ao invés da tradução somática (Figura 1C), já que a remoção da FMRP afeta a tradução mas não as formas de plasticidade Hebbiana e homeostática dependentes de transcrição.

FMRP e plasticidade independente de translação

Embora muitas formas de plasticidade sináptica dependente de translação sejam anormais em ratos Fmr1 KO, outras formas de plasticidade hipocampal, incluindo LTD dependente de NMDAR e LTP de fase inicial, são normais . Estas observações sugerem que a FMRP regula a plasticidade principalmente no seu papel de regulador da tradução. No entanto, a remoção da FMRP também tem mostrado afetar algumas formas de plasticidade sináptica que não requerem nova tradução, como o LTP de fase inicial em outras áreas do cérebro, incluindo o córtex e a amígdala . Alguns destes efeitos poderiam ser explicados pela modulação FMRP dos limiares de plasticidade dependente da síntese protéica; entretanto, parece provável que muitos representem conseqüências do estágio final do desenvolvimento sináptico alterado no Fmr1 KO.

A caso em questão é LTP alterado na amígdala. Um déficit substancial na transmissão basal foi relatado nas mesmas sinapses que mostraram LTP alterado. A redução da conectividade sináptica pode ter causado o LTP defeituoso, e pode ter surgido como consequência do aumento da síntese protéica dependente da FMRP durante o desenvolvimento do circuito da amígdala.

Proteínas candidatas à plasticidade de portas reguladas pela FMRP

Para determinar como a FMRP regula a plasticidade sináptica, devemos identificar as proteínas sinápticas cuja tradução é regulada pela FMRP. A FMRP tem uma grande variedade de alvos – foi demonstrado que liga seletivamente aproximadamente 4% do mRNA no cérebro dos mamíferos. Recentemente, mais de 800 alvos de ligação do mRNA da FMRP foram identificados através de um novo ensaio de imunoprecipitação de ligação cruzada (HITS-CLIP) de alto rendimento. Estes alvos incluem a codificação dos genes para as proteínas pré e pós-sinápticas: 27% dos mRNAs da proteína pré-sináptica (90 genes) e 23% dos mRNAs da proteína pós-sináptica (257 genes) são alvos da FMRP. Mais especificamente, o estudo HITS-CLIP descobriu que 31% dos mRNAs codificados para proteínas no complexo NMDAR (58 genes), 62% no complexo mGluR5 (32 genes) e 33% no complexo AMPAR (3 genes) são alvos da FMRP. Estes três complexos receptores são importantes para a indução e manutenção da plasticidade sináptica, sugerindo que a FMRP provavelmente age amplamente como um regulador translacional ao invés de apenas regular uma ou duas “proteínas de plasticidade”

A descoberta de que muitos alvos FMRP codificam proteínas pré-sinápticas é interessante e esclarecedora. No sistema nervoso maduro a evidência para síntese local de proteínas em axônios ou terminais de axônios ainda é escassa; entretanto durante o desenvolvimento precoce de axônios e formação de sinapse acredita-se que a síntese local de proteínas desempenha um papel importante na seleção do caminho e do alvo. Assim, a ausência de regulação FMRP da síntese protéica durante o desenvolvimento precoce muito provavelmente altera a conectividade sináptica muito antes do início da plasticidade pós-natal dependente da experiência. Além disso, fora do SNC, o controle local da tradução em terminais aferentes sensoriais tem um papel importante na sensibilização nociceptiva e na dor neuropática. O FMRP é localizado a estes terminais e os ratos Fmr1 KO mostram uma sensibilização nociceptiva alterada. Estes resultados sugerem que na medula espinhal, a FMRP pré-sináptica pode inibir a tradução local e pode regular a plasticidade da dor mesmo na idade adulta.

Discutimos duas grandes categorias de defeitos de plasticidade em camundongos Fmr1 KO: (1) formas de plasticidade que requerem FMRP/ tradução local para sua manutenção (mGluR-LTD) e (2) formas de plasticidade onde FMRP regula seu limiar de indução (STD-LTP). Discutiremos algumas proteínas em ambas as categorias que provavelmente estão envolvidas, dada a sua regulação pela FMRP e os seus papéis conhecidos na manutenção da plasticidade e no estabelecimento de limiares em sinapses do tipo selvagem. Estas “proteínas candidatas” servem como exemplos de como a FMRP pode regular a plasticidade sináptica.

Proteínas de manutenção da plasticidade: MAP1B, Arc, e STEP

Trabalhos recentes identificaram proteínas cuja tradução é regulada pela FMRP e estão envolvidas em mGluR-LTD, incluindo a proteína associada a microtubos 1B (MAP1B) e a proteína associada a citoesqueleto (Arc) regulada por atividade. MAP1B é necessária para a endocitose do receptor AMPA mGluR-dependente , o mecanismo pelo qual o mGluR-LTD é expresso. FMRP associa com MAP1B mRNA e reprime sua tradução , e ratos Fmr1 KO mostram aumento da expressão hipocampal MAP1B . No entanto, pode haver tensão do rato e variações específicas da região na forma como o FMRP regula a tradução do MAP1B. Por exemplo, no cerebelo e hipocampo dos ratos FVB, a FMRP pode regular positivamente a expressão MAP1B .

Arc está envolvida na endocitose AMPAR e é upregulada nos dendritos após a ativação e comportamento do mGluR . O arco é necessário para hipocampais mGluR-LTD e L-LTP, que são ambos dependentes da síntese protéica, e os ratos Arc-/- têm múltiplos déficits de aprendizagem . FMRP liga o Arco mRNA e suprime sua tradução. Como resultado, a expressão do arco é aumentada em dendritos Fmr1 KO . Como (a) o mGluR-LTD é aumentado em ratos Fmr1 KO, (b) o arco é aumentado em dendritos Fmr1 KO, e (c) o arco é necessário para mGluR-LTD, parece provável que o FMRP regula o mGluR-LTD via arco. Esta hipótese foi testada diretamente usando ratos Fmr1/Arc de dupla nocaute que mostram deficiência (ao invés de exagerada) do mGluR-LTD . Este achado sugere que o aumento da expressão do Arco pode ser parcialmente responsável pelo aumento do mGluR-LTD observado em ratos Fmr1 KO.

Mecanisticamente, a desfosforização da FMRP pela fosfatase PP2A é necessária para aumentos rápidos da proteína mGluR-mediada pelo Arco. Entretanto, nos neurônios Fmr1 KO, os níveis de Arco são basicamente aumentados, ocluindo um efeito adicional do tratamento com DHPG. A reintrodução viral aguda de FMRP em neurônios Fmr1 KO normaliza os níveis de Arco dendrítico e restaura a síntese rápida de mGluR-mediated Arc. Isto fornece mais evidências de que a perda aguda da FMRP, ao invés da anormalidade de desenvolvimento, está subjacente aos fenótipos de plasticidade sináptica no rato Fmr1 knockout. eregulação da tradução.

Além de MAP1B e Arco, numerosas outras proteínas candidatas LTD foram identificadas no rato Fmr1 KO. Um exemplo interessante é a proteína tirosina fosfatase enriquecida com striatal (STEP). A tradução de STEP é aumentada durante o mGluR-LTD , e STEP mRNA liga-se à FMRP . A redução genética do STEP corrige os fenótipos comportamentais no rato Fmr1 KO; mas não se sabe se os fenótipos LTD correspondentes são afectados. As proteínas candidatas adicionais incluem APP , OPHN1 , CaMKIIα , PSD-95 , e PI3K .

Proteínas reguladoras de plasticidade: Kv4.2

Uma recente revisão discutindo o papel dos canais de potássio no X Frágil fornece uma visão de como a FMRP pode regular a excitabilidade . A FMRP regula diretamente a tradução de pelo menos três canais de potássio: Kv4.2, Kv3.1b, e Slack . O controle FMRP da tradução de Kv4.2 pode ter conseqüências indiretas na regulação do limiar de indução LTP e STD-LTP.

Kv4.2 é um canal de potássio tipo A que regula a excitabilidade dendrítica e a extensão da potencial retropropagação de ação . As correntes do tipo A atuam para amortecer a excitabilidade dendrítica e a retropropagação do AP (Figura 2B). Ao modular a força da retropropagação, Kv4.2 também foi mostrado para regular o limiar para LTP e STD-LTP . Na ausência de Kv4.2, os dendritos são mais excitáveis e há um limiar reduzido para a indução de LTP .

Fmr1 Os ratos KO têm um limiar aumentado para a indução de LTP e STD-LTP, como discutido anteriormente (Figura 2A) . Uma hipótese potencial para este fenômeno é que a FMRP inibe a tradução de Kv4.2, e os ratos Fmr1 KO têm excesso de proteína Kv4.2 sintetizada em dendritos. De facto, a FMRP associa directamente e regula negativamente a tradução de Kv4.2 mRNA . Mas será que isto explica a alteração do limiar LTP/STD-LTP em ratos Fmr1 KO? A inibição farmacológica do Kv4.2 em camundongos Fmr1 KO corrige a deficiência do LTP hipocampal de estímulo fraco enquanto o LTP de estímulo forte permanece inalterado (Figura 2C). Este achado sugere que o aumento do limiar para o LTP no rato Fmr1 KO pode ser explicado pelo aumento da translação do canal de potássio Kv4.2.

Interessantemente, outro grupo mostrou recentemente que sob as suas condições, o FMRP regula positivamente a translação do Kv4.2 . Este estudo não abordou as potenciais consequências da diminuição do Kv4.2 no Fmr1 KO sobre a plasticidade sináptica. Seria de se esperar um aumento da excitabilidade dendrítica, que tem sido relatada anteriormente em outros contextos, e uma diminuição do limiar de LTP. Será importante determinar as condições experimentais e in vivo precisas sob as quais cada um destes padrões opostos de regulação pode ocorrer, mas é claro que a regulação da FMRP de Kv4.2 em qualquer direção teria consequências importantes para a plasticidade.

FMRP, plasticidade sináptica e aprendizagem

Potenciação sináptica de longa duração e depressão têm sido consideradas correlatos neurais potenciais de aprendizagem e memória. Em conjunto com o papel da FMRP na plasticidade sináptica em múltiplas áreas do cérebro, a FMRP também é importante para uma ampla gama de tarefas de aprendizagem comportamental em camundongos. Os ratos Fmr1 KO mostram memória deficiente de traços amígdalos do medo, aprendizagem cerebelar, aprendizagem inibitória para evitar a aprendizagem, e têm dificuldades com uma tarefa de aprendizagem cognitiva pré-frontal. Os mutantes Drosophila sem FMRP também têm memória a longo prazo deficiente. Em geral, a aprendizagem e déficits de memória no rato Fmr1 KO são uma consequência comportamental provável de plasticidade sináptica anormal.