Pontos Principais:

• Os tecidos de interesse devem ser imediatamente fixados para evitar degradação.

• 10% Formalina Tampão Neutro (NBF) ou 4% Solução de Paraformaldeído (PFA) são comumente usados para histologia. Estes são fixadores eficazes para H&E, e a maioria dos marcadores imunohistoquímicos (IHC) e manchas especiais.

• A fixação ideal é a chave para os melhores resultados histopatológicos.

Introdução à fixação tecidual

Os testes básicos em patologia anatómica e exame microscópico do tecido requerem fixação, processamento, secção e coloração óptimas do tecido. A fixação é um passo inicial crítico na histologia. A má fixação pode levar a múltiplos resultados imprecisos, incluindo manchas especiais, imuno-histoquímica e outras técnicas histológicas. Um tecido bem preservado retém a sua estrutura e reactividade a reagentes como corantes especiais, anticorpos para imunohistoquímica e sondas de ácido nucleico para ensaios de hibridação in situ. Tanto a sub-fixação como a sobrefixação podem causar muitos problemas na histologia, contudo, a sub-fixação pode ser um problema maior do que a sobrefixação e deve ser evitada. A fixação de tecido adiposo como tecido cerebral humano, de rato ou de rato pode necessitar de atenção especial. Uma fixação óptima do tecido assegura a preservação das estruturas celulares e extracelulares, de modo a conseguir uma secção fina, uma coloração histoquímica óptima e uma preservação e arquivo a longo prazo. Aqui discutimos brevemente os fatores importantes para se conseguir uma ótima fixação tanto para tecido humano quanto veterinário.

O que é a fixação tecidual?

Fixação é um processo químico pelo qual o tecido biológico é preservado para representar o estado in vivo da amostra o máximo possível. A fim de preservar uma amostra de tecido em um estado o mais próximo possível da vida, os processos pós-morte de autólise, que é a auto-degradação através de enzimas proteolíticas, e/ou putrefação, que é a decomposição da matéria orgânica através da ação de microorganismos, devem ser interrompidos. Um fixador ideal deve preservar a amostra do tecido de forma representativa da sua situação in vivo; a morfologia celular e extracelular deve ser preservada, e o fixador não deve desnaturar proteínas que são importantes para a análise histopatológica.

Fixadores Comuns para Histologia

Existe um número de fixadores e o uso de um determinado tipo é ditado pela análise a jusante. Para a histologia, os fixadores mais eficazes e comumente usados são os baseados em aldeídos. Os seguintes fixadores são recomendados para a coloração com H&E e a maioria dos marcadores IHC e corantes especiais:

1. Neutro Formalina tamponada (NBF): Uma solução tampão de formaldeído a 10%, pH 7,0-7,4 é comumente usada na maioria dos laboratórios. Imediatamente após a cirurgia, o tecido é completamente imerso em solução de NBF a 10% e cronometrado. Uma solução pronta para uso está disponível em vários fornecedores nos EUA. O tempo de fixação determina a fixação ideal, conforme discutido mais adiante.

2. Solução de Paraformaldeído (PFA): Solução de PFA a 4% preparada recentemente produz resultados semelhantes e é rentável. Devido à sua rápida degradação, esta solução é preparada fresca cada vez antes de ser usada.

O mecanismo de acção e a quantidade de formaldeído em ambas as soluções são os mesmos.

Mecanismo de acção

O mecanismo de acção da fixação é através da rápida cessação de todas as reacções enzimáticas e actividades metabólicas em curso, desnaturalizando biomoléculas intrínsecas. Ao fazer isso, enzimas proteolíticas que de outra forma digeririam a amostra de tecido via autólise são desnaturadas, e os processos autolíticos são interrompidos. Os fixadores também protegem a amostra de danos extrínsecos, pois são tóxicos para a maioria dos microorganismos comuns (bactérias em particular) que, de outra forma, poderiam colonizar uma amostra de tecido. Além disso, muitos fixadores alteram quimicamente o tecido tratado para ser menos palatável a microrganismos oportunistas, impedindo assim o processo de putrefacção.

O mecanismo de fixação do formaldeído é através de ligações cruzadas, ou criando ligações químicas covalentes, entre resíduos de aminoácidos, na maioria das vezes, os resíduos de aminoácidos lisina (grupos de aminoácidos de cadeia lateral da lisina), que resultam em pontes de metileno. A ligação cruzada de formaldeído também pode ocorrer entre os grupos de aminometilol e as cadeias laterais de fenol, indole e imidazol. Além disso, o formaldeído age sobre uma variedade de aminoácidos, tais como lisina, arginina, tirosina, asparagina, histidina, glutamina e serina. Os fixadores de ligação cruzada mantêm estruturas internas de uma amostra e não prejudicam significativamente a estrutura da proteína. O uso de formaldeído é favorável, pois mantém a morfologia da amostra do tecido e a estrutura secundária e terciária da proteína não é afetada e, portanto, preservada. Tem sido proposto que o formaldeído é um fixador eficaz devido à sua rápida velocidade de penetração.

Modos de fixação

Existem duas formas de fixação do tecido – imersão e perfusão transcardial. A fixação por imersão envolve a colocação de tecido recém-colhido numa quantidade adequada de fixador. Esta é a forma mais simples e mais comum de fixação. A perfusão trancárdica, por outro lado, utiliza o sistema circulatório para espalhar o fixador, o que quando realizado de forma hábil resulta em fixação rápida e eficaz. Esta técnica geralmente resulta em morfologia bem preservada com degradação mínima causada por autólise ou putrefação.

Para roedores e outros pequenos animais, a perfusão transcardial é altamente recomendada para a obtenção dos melhores resultados. Após a perfusão transcárdica, o(s) órgão(s) colhido(s) de interesse pode(m) ser imerso(s) no fixador para garantir uma fixação completa.

Comprimento de fixação

Um fixador deve ser exposto à amostra de tecido durante o tempo necessário para que a solução penetre completamente na amostra. Para a fixação por imersão, certos factores como a densidade da amostra de tecido, a taxa de penetração e a temperatura devem ser levados em consideração. É importante notar que a taxa de penetração e a taxa de fixação são dois processos completamente diferentes de um fixador, sendo que o último processo é mais lento do que o primeiro. Uma regra geral a aplicar para a taxa de penetração é de 1 mm/hora. Um tempo de fixação de 24 horas é recomendado para amostras tratadas com NBF.

Subfixação (retirada precoce do fixador do tecido tratado) pode levar a uma má preservação morfológica, enquanto que a sobrefixação (retirada tardia do fixador do tecido tratado) pode levar a artefatos de fixação, perda de sinal ou aumento de sinais de fundo não específicos (“ruído”). Geralmente, não é recomendado fixar o tecido por mais de 36 horas para evitar a sobrefixação. Ambos são problemas que requerem suas próprias soluções e devem ser evitados ao fixar uma amostra de tecido. A duração da exposição de uma amostra ao fixador é, portanto, uma questão muito importante que deve ser cuidadosamente calibrada.

Após o processo de fixação, os artefatos podem ser introduzidos à medida que a amostra seca. Estes artefatos podem estar na forma de perda de organelas, encolhimento nuclear e aglomeração de artefatos, portanto é vital manter a amostra tratada úmida com solução tampão fosfato/salina para continuar preservando a amostra com precisão.

Tamanho de tecido e volume de fixador

Fixantes são maus tampões; portanto, o pH da solução tende a mudar durante o processo de fixação. Um grande volume de fixador irá assegurar uma fixação óptima. O volume de fixador utilizado deve ser aproximadamente 15-20x o volume do tecido. Um grande volume tenderá a realizar a fixação adequadamente, mantendo o reagente estável. Para melhores resultados, o tecido deve ser cortado em pedaços que não tenham mais de 4-5 mm de espessura em uma dimensão. Se o tecido de interesse for necessário para outros fins/aplicações (testes moleculares, etc.), ele pode ser cortado e congelado separadamente antes da fixação.

Sumário

• Fixação deve ser realizada imediatamente após a cirurgia/dissecção.

• Fixar tecido em solução de formaldeído tampão neutro 10% (NBF) ou solução de paraformaldeído 4% preparada recentemente. Os fixadores à base de formaldeído são preferidos para preservação do tecido a longo prazo e são conhecidos por produzir melhores resultados na secção, morfologia (H&E), corantes especiais e imunohistoquímica.

• Cortar tecido em pedaços menores (máx. 4-5 mm), e usar quantidade ampla de fixador, certificando-se de que o tecido está completamente imerso no fixador.

• Fixação deve ser realizada por não mais que 24-36 horas, dependendo do tamanho do tecido. O tempo de exposição de uma amostra ao fixador é importante e deve ser calibrado.

• O tecido fixado deve ser transferido para PBS ou etanol a 70% e enviado para processamento para preparar blocos de tecido.

Por favor consulte a equipe do laboratório se você precisar armazenar o tecido fixo por mais tempo ou precisar de conselhos adicionais sobre fixação e/ou envio de amostras de tecido. Perguntas podem ser enviadas por e-mail para [email protected].

Escrever por: Hannah Bashar

Edited by: Rajni Sharma, Ph.D.