Main Points:

• Świeżo pobrana tkanka zainteresowania powinna być natychmiast utrwalona, aby uniknąć degradacji.

• 10% Neutralna zbuforowana formalina (NBF) lub 4% roztwór paraformaldehydu (PFA) są powszechnie stosowane w histologii. Są to skuteczne utrwalacze dla H&E, większości markerów immunohistochemicznych (IHC) i specjalnych barwników.

• Optymalne utrwalanie jest kluczem do najlepszych wyników histopatologii.

Wprowadzenie do utrwalania tkanek

Podstawowe badania w patologii anatomicznej i mikroskopowym badaniu tkanek wymagają optymalnego utrwalania, przetwarzania, sekcjonowania i barwienia tkanek. Utrwalanie jest krytycznym, wstępnym krokiem w histologii. Słabe utrwalenie może prowadzić do wielu niedokładnych wyników, w tym barwień specjalnych, immunohistochemii i innych technik histologicznych. Dobrze zakonserwowana tkanka zachowuje swoją strukturę i reaktywność na odczynniki takie jak barwniki specjalne, przeciwciała do immunohistochemii i sondy kwasów nukleinowych do badań hybrydyzacji in situ. Zarówno niedostateczne utrwalenie, jak i nadmierne utrwalenie może powodować wiele problemów w histologii, jednakże niedostateczne utrwalenie może być większym problemem niż nadmierne utrwalenie i należy go unikać. Utrwalanie tkanki tłuszczowej, takiej jak tkanka mózgowa człowieka, szczura lub myszy, może wymagać szczególnej uwagi. Optymalne utrwalenie tkanki zapewnia zachowanie struktur komórkowych i pozakomórkowych w celu uzyskania cienkich przekrojów, optymalnego barwienia histochemicznego oraz długotrwałego przechowywania i archiwizacji. Tutaj krótko omawiamy ważne czynniki dla osiągnięcia optymalnego utrwalenia zarówno dla tkanek ludzkich jak i weterynaryjnych.

Co to jest utrwalanie tkanek?

Utrwalanie jest procesem chemicznym, w którym tkanka biologiczna jest konserwowana w celu reprezentowania stanu in vivo próbki tak bardzo jak to możliwe. Aby zachować próbkę tkanki w stanie jak najbardziej zbliżonym do życia, muszą zostać zatrzymane pośmiertne procesy autolizy, czyli samodegradacji przez enzymy proteolityczne, i/lub putrefakcji, czyli rozkładu materii organicznej przez działanie mikroorganizmów. Idealny utrwalacz powinien zachować daną próbkę tkanki w sposób, który jest reprezentatywny dla jej sytuacji in vivo; morfologia komórkowa i pozakomórkowa powinna być zachowana, a utrwalacz nie powinien denaturować białek, które są ważne dla analizy histopatologicznej.

Wspólne utrwalacze dla histologii

Istnieje szereg utrwalaczy, a użycie konkretnego typu jest podyktowane dalszą analizą. Dla histologii, najbardziej efektywnymi i powszechnie stosowanymi utrwalaczami są utrwalacze na bazie aldehydów. Następujące utrwalacze są zalecane do barwienia H&E oraz większości markerów IHC i specjalnych barwników:

1. Neutralna zbuforowana formalina (NBF): 10% roztwór buforowy formaldehydu, pH 7,0-7,4 jest powszechnie stosowany w większości laboratoriów. Bezpośrednio po zabiegu tkanka jest całkowicie zanurzana w 10% roztworze NBF i odmierzany jest czas. Gotowy do użycia roztwór jest dostępny u różnych producentów w USA. Czas utrwalania determinuje optymalne utrwalenie, co omówiono dalej.

2. Roztwór paraformaldehydu (PFA): Świeżo przygotowany 4% roztwór PFA daje podobne wyniki i jest efektywny kosztowo. Ze względu na jego szybką degradację, roztwór ten jest przygotowywany na świeżo za każdym razem przed użyciem.

Mechanizm działania i ilość formaldehydu w obu roztworach są takie same.

Mechanizm działania

Mechanizm działania utrwalania polega na szybkim zakończeniu wszystkich trwających reakcji enzymatycznych i czynności metabolicznych poprzez denaturację wewnętrznych biomolekuł. W ten sposób enzymy proteolityczne, które w przeciwnym razie strawiłyby próbkę tkanki poprzez autolizę, ulegają denaturacji, a procesy autolityczne zostają zatrzymane. Utrwalacze chronią również próbkę przed uszkodzeniami zewnętrznymi, ponieważ są toksyczne dla większości powszechnie występujących mikroorganizmów (w szczególności bakterii), które w przeciwnym razie mogłyby skolonizować próbkę tkanki. Ponadto, wiele utrwalaczy zmienia chemicznie traktowaną tkankę tak, aby była mniej przyjazna dla mikroorganizmów oportunistycznych, zapobiegając w ten sposób procesowi gnicia.

Mechanizm utrwalania formaldehydu polega na sieciowaniu lub tworzeniu kowalencyjnych wiązań chemicznych między resztami aminokwasów, najczęściej reszt aminokwasów lizyny (grupy aminowe łańcucha bocznego lizyny), które powodują powstanie mostków metylenowych. Wiązania krzyżowe formaldehydu mogą również występować pomiędzy grupami aminometylolowymi a łańcuchami bocznymi fenolu, indolu i imidazolu. Ponadto formaldehyd działa na różne aminokwasy, takie jak lizyna, arginina, tyrozyna, asparagina, histydyna, glutamina i seryna. Utrwalacze sieciujące zachowują wewnętrzne struktury próbki i nie uszkadzają znacząco struktury białka. Zastosowanie formaldehydu jest korzystne, ponieważ pozwala na zachowanie morfologii próbki tkanki, a drugorzędowa i trzeciorzędowa struktura białek jest nienaruszona i tym samym zachowana. Zaproponowano, że formaldehyd jest skutecznym utrwalaczem ze względu na jego szybką szybkość penetracji.

Mody utrwalania

Istnieją dwa sposoby utrwalania tkanek – zanurzenie i perfuzja przezskórna. Utrwalanie zanurzeniowe polega na umieszczeniu świeżo pobranej tkanki w odpowiedniej ilości utrwalacza. Jest to najprostszy i najczęściej stosowany sposób utrwalania. Perfuzja przezskórna natomiast wykorzystuje układ krwionośny do rozprowadzenia utrwalacza, co przy umiejętnym wykonaniu daje szybkie i skuteczne utrwalenie. Technika ta generalnie skutkuje dobrze zachowaną morfologią z minimalną degradacją spowodowaną autolizą lub gniciem.

W przypadku gryzoni i innych małych zwierząt, perfuzja przezsercowa jest wysoce zalecana dla uzyskania najlepszych wyników. Po perfuzji przezsercowej, pobrany organ(y) zainteresowania może być zanurzony w utrwalaczu w celu zapewnienia całkowitego utrwalenia.

Długość utrwalania

Utrwalacz powinien być wystawiony na działanie próbki tkanki tak długo, jak jest to potrzebne do całkowitego wniknięcia roztworu do próbki. W przypadku utrwalania zanurzeniowego należy wziąć pod uwagę pewne czynniki, takie jak gęstość próbki tkanki, szybkość przenikania i temperaturę. Należy zauważyć, że szybkość przenikania i szybkość utrwalania to dwa zupełnie różne procesy utrwalania, przy czym ten drugi przebiega wolniej niż pierwszy. Ogólną zasadą, którą należy stosować dla szybkości penetracji jest 1 mm/godzinę. Dla próbek poddanych działaniu NBF zaleca się czas utrwalania wynoszący 24 godziny.

Niedostateczne utrwalenie (wczesne wycofanie utrwalacza z tkanki poddanej działaniu utrwalacza) może prowadzić do słabego zachowania morfologii, natomiast nadmierne utrwalenie (późne wycofanie utrwalacza z tkanki poddanej działaniu utrwalacza) może prowadzić do artefaktów utrwalania, utraty sygnału lub zwiększenia niespecyficznych sygnałów tła („szumu”). Generalnie, nie zaleca się utrwalania tkanki na dłużej niż 36 godzin, aby uniknąć nadmiernego utrwalenia. Oba te problemy wymagają odrębnych rozwiązań i należy ich unikać podczas utrwalania próbki tkanki. Czas ekspozycji próbki na utrwalacz jest więc bardzo ważną kwestią, która musi być starannie skalibrowana.

Po procesie utrwalania mogą pojawić się artefakty, ponieważ próbka wysycha. Te artefakty mogą być w formie utraty organelli, jądrowego skurczu i artefaktycznego zbrylania się, więc ważne jest, aby utrzymać leczoną próbkę wilgotną z buforem fosforanowym/roztworem soli, aby kontynuować dokładne zachowanie próbki.

Rozmiar tkanki i objętość utrwalacza

Utrwalacze są słabymi buforami; dlatego pH roztworu ma tendencję do zmiany podczas procesu utrwalania. Duża objętość utrwalacza zapewni optymalne utrwalenie. Objętość utrwalacza powinna być około 15-20x większa niż objętość tkanki. Duża objętość pozwoli na odpowiednie utrwalenie przy jednoczesnym zachowaniu stabilności odczynnika. Aby uzyskać najlepsze wyniki, tkanka powinna być pocięta na kawałki o grubości nie większej niż 4-5 mm w jednym wymiarze. Jeśli interesująca nas tkanka jest potrzebna do innych celów/zastosowań (badania molekularne itp.), można ją pociąć i zamrozić oddzielnie przed utrwaleniem.

Podsumowanie

• Utrwalanie musi być wykonane natychmiast po operacji/dysekcji.

• Utrwalać tkankę w 10% roztworze neutralnego buforu formaldehydu (NBF) lub świeżo przygotowanym 4% roztworze paraformaldehydu. Środki utrwalające na bazie formaldehydu są preferowane do długotrwałej konserwacji tkanek i znane są z tego, że dają najlepsze wyniki przy sekcjonowaniu, morfologii (H&E), barwieniu specjalnym i immunohistochemii.

• Tkankę należy pociąć na mniejsze kawałki (maks. 4-5 mm) i użyć wystarczającej ilości utrwalacza, upewniając się, że tkanka jest całkowicie zanurzona w utrwalaczu.

• Utrwalanie musi trwać nie dłużej niż 24-36 godzin w zależności od wielkości tkanki. Czas ekspozycji próbki na utrwalacz jest ważny i musi być skalibrowany.

• Utrwalona tkanka powinna być przeniesiona do PBS lub 70% etanolu i wysłana do przetwarzania w celu przygotowania bloków tkankowych.

Proszę skonsultować się z personelem laboratorium w przypadku konieczności przechowywania utrwalonej tkanki przez dłuższy czas lub uzyskania dodatkowych porad dotyczących utrwalania i/lub wysyłki próbek tkanek. Pytania można przesyłać pocztą elektroniczną na adres [email protected].

Written by: Hannah Bashar

Edited by: Rajni Sharma, Ph.D.

.