Main Points:

• Vers geoogst weefsel van belang moet onmiddellijk worden gefixeerd om degradatie te voorkomen.

• 10% neutraal gebufferde formaline (NBF) of 4% paraformaldehydeoplossing (PFA) worden gewoonlijk gebruikt voor histologie. Dit zijn effectieve fixatieven voor H&E, en de meeste immunohistochemische (IHC) markers en speciale kleurslagen.

• Optimale fixatie is de sleutel tot de beste histopathologieresultaten.

Inleiding tot weefselfixatie

De basisonderzoeken in de anatomische pathologie en het microscopisch onderzoek van weefsel vereisen een optimale fixatie, verwerking, coupes en kleuring van weefsel. Fixatie is een kritische eerste stap in de histologie. Slechte fixatie kan leiden tot meerdere onnauwkeurige resultaten met inbegrip van speciale kleuringen, immunohistochemie en andere histologische technieken. Goed gefixeerd weefsel behoudt zijn structuur en reactiviteit op reagentia zoals speciale kleurstoffen, antilichamen voor immunohistochemie en nucleïnezuursondes voor in situ hybridisatie-analyses. Zowel onderfixatie als overfixatie kunnen heel wat problemen veroorzaken in de histologie, maar onderfixatie kan een groter probleem zijn dan overfixatie en moet vermeden worden. Fixatie van vetweefsel zoals hersenweefsel van mensen, ratten of muizen kan speciale aandacht vereisen. Een optimale weefselfixatie garandeert het behoud van cellulaire en extracellulaire structuren met het oog op dunne coupes, optimale histochemische kleuring en langdurige bewaring en archivering. Hier bespreken we kort de belangrijke factoren voor het bereiken van een optimale fixatie voor zowel menselijk als veterinair weefsel.

Wat is weefselfixatie?

Fixatie is een chemisch proces waarbij biologisch weefsel wordt geconserveerd om de in vivo toestand van het monster zo goed mogelijk weer te geven. Om een weefselmonster te bewaren in een toestand die het leven zo dicht mogelijk benadert, moeten de postmortale processen van autolyse, d.w.z. zelfafbraak via proteolytische enzymen, en/of putrefactie, d.w.z. het vergaan van organisch materiaal door toedoen van micro-organismen, een halt worden toegeroepen. Een ideaal fixatief moet het gegeven weefselmonster conserveren op een wijze die representatief is voor zijn in vivo situatie; de cellulaire en extracellulaire morfologie moet behouden blijven, en het fixatief mag geen eiwitten denatureren die belangrijk zijn voor histopathologische analyse.

Gemeenschappelijke Fixatieven voor Histologie

Er bestaan een aantal fixatieven en het gebruik van een bepaald type wordt gedicteerd door de downstream analyse. Voor de histologie zijn de meest doeltreffende en vaak gebruikte fixatieven op basis van aldehyde. De volgende fixeermiddelen worden aanbevolen voor H5768>E-kleuring, en de meeste IHC-markers en speciale kleuring:

1. Neutraal gebufferde formaline (NBF): Een 10% formaldehydebufferoplossing, pH 7,0-7,4, wordt in de meeste laboratoria gebruikt. Onmiddellijk na de operatie wordt het weefsel volledig ondergedompeld in 10% NBF-oplossing en getimed. Een gebruiksklare oplossing is verkrijgbaar bij verschillende leveranciers in de VS. Het tijdstip van fixatie bepaalt de optimale fixatie, zoals verder wordt besproken.

2. Paraformaldehydeoplossing (PFA): Vers bereide 4% PFA-oplossing levert vergelijkbare resultaten op en is kosteneffectief. Vanwege de snelle afbraak wordt deze oplossing elke keer voor gebruik vers bereid.

Het werkingsmechanisme en de hoeveelheid formaldehyde in beide oplossingen zijn hetzelfde.

Werkingsmechanisme

Het werkingsmechanisme van fixatie is het snel beëindigen van alle lopende enzymreacties en metabolische activiteiten door denaturering van intrinsieke biomoleculen. Hierdoor worden proteolytische enzymen die anders het weefselmonster via autolyse zouden verteren, gedenatureerd en worden autolytische processen gestopt. Fixatieven beschermen het staal ook tegen extrinsieke schade aangezien ze toxisch zijn voor de meeste gangbare micro-organismen (in het bijzonder bacteriën) die anders een weefselstaal zouden koloniseren. Bovendien veranderen veel fixatieven het behandelde weefsel chemisch zodat het minder smakelijk is voor opportunistische micro-organismen, waardoor het proces van rotting wordt voorkomen.

Formaldehyde fixeert door middel van cross-linking, of het creëren van covalente chemische bindingen, tussen aminozuur residuen, meestal die van aminozuur lysine residuen (zijketen amino groepen van lysine), die resulteren in methyleen bruggen. Vernetting van formaldehyde kan ook optreden tussen de aminomethylolgroepen en fenol-, indool- en imidazoolzijketens. Voorts werkt formaldehyde op een verscheidenheid van aminozuren, zoals lysine, arginine, tyrosine, asparagine, histidine, glutamine en serine. Fixeermiddelen met verknoping houden de interne structuren van een monster in stand en schaden de structuur van het eiwit niet noemenswaardig. Het gebruik van formaldehyde is gunstig omdat het de morfologie van het weefselmonster in stand houdt en de secundaire en tertiaire eiwitstructuur niet worden aangetast en dus bewaard blijven. Er is voorgesteld dat formaldehyde een effectief fixatief is vanwege zijn snelle penetratiesnelheid.

Wijze van fixatie

Er zijn twee manieren om weefsel te fixeren – onderdompeling en transcardiale perfusie. Immersie fixatie omvat het plaatsen van vers geoogst weefsel in een voldoende hoeveelheid fixatief. Dit is de eenvoudigste en meest gebruikelijke manier van fixeren. Bij transcardiale perfusie daarentegen wordt gebruik gemaakt van de bloedsomloop om het fixeermiddel te verspreiden, wat bij een vakkundige uitvoering resulteert in een snelle en doeltreffende fixatie. Deze techniek resulteert in het algemeen in een goed bewaarde morfologie met een minimum aan degradatie ten gevolge van autolyse of putrefactie.

Voor knaagdieren en andere kleine dieren, transcardiale perfusie wordt sterk aanbevolen voor het verkrijgen van de beste resultaten. Na transcardiale perfusie, kan geoogst orgaan (s) van belang worden ondergedompeld in het fixatief om volledige fixatie te garanderen.

Lengte van fixatie

Een fixatief moet zo lang aan het weefselmonster worden blootgesteld als nodig is om de oplossing volledig in het monster te laten doordringen. Bij dompelfixatie moet rekening worden gehouden met bepaalde factoren zoals de dichtheid van het weefselmonster, de penetratiesnelheid en de temperatuur. Het is belangrijk op te merken dat de penetratiesnelheid en de fixatiesnelheid twee totaal verschillende processen van een fixatief zijn, waarbij het laatste langzamer verloopt dan het eerste. Een algemene vuistregel voor de penetratiesnelheid is 1 mm/uur. Voor met NBF behandelde monsters wordt een fixatietijd van 24 uur aanbevolen.

Onderfixatie (te vroege terugtrekking van het fixatief uit het behandelde weefsel) kan leiden tot slecht morfologisch behoud, terwijl overfixatie (te late terugtrekking van het fixatief uit het behandelde weefsel) kan leiden tot fixatieartefacten, signaalverlies of verhoogde niet-specifieke achtergrondsignalen (“ruis”). In het algemeen wordt niet aanbevolen het weefsel langer dan 36 uur te fixeren om overfixatie te voorkomen. Beide problemen vereisen hun eigen oplossing en moeten worden vermeden bij het fixeren van een weefselmonster. De duur van de blootstelling van een monster aan het fixeermiddel is dus een zeer belangrijke kwestie die zorgvuldig moet worden gekalibreerd.

Na het fixeerproces kunnen artefacten worden geïntroduceerd wanneer het monster droogt. Deze artefacten kunnen in de vorm van organel-verlies, nucleaire-krimp, en artefactuele klontering, dus het is van vitaal belang om het behandelde monster vochtig te houden met fosfaatbuffer / zoutoplossing om nauwkeurig te blijven behouden van het monster.

Grootte van het weefsel en volume van het fixeermiddel

Fixeermiddelen zijn slechte buffers; daarom heeft de pH van de oplossing de neiging om te veranderen tijdens het proces van fixatie. Een groot volume fixeermiddel zorgt voor een optimale fixatie. Het gebruikte volume fixatief moet ongeveer 15-20x het volume van het weefsel zijn. Een groot volume zal de neiging hebben om de fixatie adequaat uit te voeren en tegelijkertijd het reagens stabiel te houden. Voor de beste resultaten moet weefsel worden gesneden tot in stukken die niet meer dan 4-5 mm dik in een dimensie. Als het weefsel van belang is voor andere doeleinden/toepassingen (moleculaire tests, enz.), kan het worden gesneden en afzonderlijk worden ingevroren vóór fixatie.

Samenvatting

• Fixatie moet onmiddellijk na de operatie/sectie worden uitgevoerd.

• Fixeer weefsel in 10% neutral buffer formaldehyde (NBF)-oplossing of vers bereide 4% paraformaldehydeoplossing. Fixeermiddelen op basis van formaldehyde verdienen de voorkeur voor langdurige weefselconservering en staan bekend om de beste resultaten voor coupes, morfologie (H&E), speciale kleuringen en immunohistochemie.

• Snijd het weefsel in kleinere stukken (max. 4-5 mm) en gebruik een ruime hoeveelheid fixeermiddel, waarbij u ervoor zorgt dat het weefsel volledig in het fixeermiddel is ondergedompeld.

• Fixatie mag niet langer dan 24-36 uur worden uitgevoerd, afhankelijk van de grootte van het weefsel. De timing van de blootstelling van een monster aan het fixeermiddel is belangrijk en moet worden gekalibreerd.

• Gefixeerd weefsel moet worden overgebracht in PBS of 70% ethanol en worden verzonden voor verwerking ter voorbereiding van weefselblokken.

Raadpleeg het laboratoriumpersoneel als u gefixeerd weefsel voor langere tijd moet bewaren of aanvullend advies nodig hebt over fixatie en/of verzending van weefselmonsters. Vragen kunnen worden gemaild naar [email protected].

Geschreven door: Hannah Bashar

Geedigeerd door: Rajni Sharma, Ph.D.