1929. május 4-én a belgiumi Brüsszel közelében megszületett Edda van Heemstra Hepburn-Ruston, akit egy napon Audrey Hepburnként ismerhetnek majd a filmrajongók.
Egy angol bankár és egy holland bárónő lányaként Hepburn Londonban járt iskolába, amikor Európában kitört a második világháború. A háború alatt a nácik megszállták Hollandiát, ahol a fiatal Audrey és édesanyja tartózkodott, és a család sok megpróbáltatást szenvedett el. Hepburn folytatta balett-tanulmányait, majd a háború végén visszatért Londonba, ahol modellkedett, és kisebb szerepekben színpadon és a filmvásznon kezdett el játszani. 1951-ben Hepburnt Colette francia írónő “fedezte fel”, miközben Monacóban forgatott egy filmet. Colette ragaszkodott hozzá, hogy Hepburn kapja meg a Gigi című regénye Broadway-változatának címszerepét, és a fiatal színésznő még abban az évben debütált a Broadwayn.
Hepburn sikere a Gigiben közvetlenül vezetett ahhoz, hogy megkapta az 1953-as Római vakáció című film főszerepét. Az önfejű fiatal hercegnő alakításáért, aki beleszeret egy újságíróba (akit Gregory Peck alakított), miközben Rómában szabadlábon van, Hepburn elnyerte a legjobb színésznőnek járó Oscar-díjat. Ugyanebben az évben a legjobb színésznőnek járó Tony-díjat is elnyerte az Ondine című film főszerepéért. A következő évtizedben Hepburn bebizonyította, hogy több mint egyenrangú partnere Hollywood legjobb férfi főszereplőinek olyan sikerekben, mint a Sabrina (1954, William Holdennel és Humphrey Bogarttal), a Funny Face (1957, Fred Astaire-rel) és a Love in the Afternoon (1957, Gary Cooperrel).
A Reggeli Tiffanynál (1961) utánozhatatlan Holly Golightly szerepében Hepburn negyedik Oscar-díját kapta a legjobb színésznőnek (a Sabrináért és az 1959-es Egy apáca történetéért is jelölték). Vitát váltott ki, amikor a My Fair Lady (1964) című musical filmváltozatában Eliza Doolittle szerepére őt választották, és ezzel megelőzte Julie Andrewst, aki a Broadwayn játszotta a szerepet. Három évvel később Hepburn ötödik Oscar-jelölését kapta a Várj sötétedésig című filmért, amelynek producere akkori férje, Mel Ferrer volt (1954-ben házasodtak össze). Nem sokkal ezután felhagyott a főállású színészettel (bár szórványosan továbbra is szerepelt filmekben, például Marian szobalányként Sean Connery Robin Hoodjával szemben az 1976-os Robin és Marianban), és ideje nagy részét svájci otthonában töltötte. Hepburn és Ferrer, akiknek egy fiuk született, 1968-ban elváltak, és Hepburn a következő évben hozzáment Andrea Dotti olasz pszichiáterhez; egy közös fiuk született. Miután elvált Dottitól, Hepburn 1980-ban kapcsolatot kezdett Robert Wolders holland színésszel.
A színészkedéstől való félig visszavonulása alatt Hepburn a legtöbb energiáját jótékony céloknak szentelte, leginkább az UNICEF-nek, az ENSZ gyermekalapjának, amelynek 1988-ban különleges nagykövetévé nevezték ki. Hepburn az UNICEF-nek tett kirándulásai során bejárta az egész világot, Guatemalától, Hondurastól, Venezuelától és El Salvadortól Törökországig, Thaiföldig, Bangladesig és Szudánig. A szervezet ékesszóló hangja volt a nyilvánosság előtt is, és többek között az amerikai kongresszus előtt felszólalva segített pénzt gyűjteni és felhívni a figyelmet a szervezet munkájára. 1992-ben megkapta az Elnöki Szabadságérmet.
Hepburn utolsó filmes szereplése Steven Spielberg Mindig (1989) című filmjében volt, amelyben egy angyalt alakított. 1992-ben, nem sokkal azután, hogy visszatért egy szomáliai UNICEF-utazásról, Hepburnnél vastagbélrákot diagnosztizáltak. Miután novemberben megműtötték, 1993. január 20-án, a svájci Lausanne melletti otthonában, 63 éves korában meghalt.