Toukokuun 4. päivänä 1929 Edda van Heemstra Hepburn-Ruston, jonka elokuvaharrastajat tuntevat jonain päivänä Audrey Hepburnina, syntyy Brysselin lähellä Belgiassa.
Hepburn on englantilaisen pankkiirin ja hollantilaisen paronittaren tytär ja käy koulua Lontoossa, kun Euroopassa puhkeaa toinen maailmansota. Sodan aikana natsit miehittivät Hollannin, jossa nuori Audrey ja hänen äitinsä asuivat, ja perhe kärsi monia vastoinkäymisiä. Hepburn jatkoi balettiopintojaan, ja sodan päätyttyä hän palasi Lontooseen, jossa hän oli mallina ja alkoi näytellä pienissä rooleissa näyttämöllä ja valkokankaalla. Vuonna 1951 ranskalainen kirjailija Colette ”löysi” Hepburnin ollessaan Monacossa kuvaamassa elokuvaa. Colette vaati Hepburnia romaaninsa Gigi Broadway-version nimirooliin, ja nuori näyttelijätär debytoi Broadwaylla samana vuonna.
Hepburnin menestys Gigissä johti suoraan siihen, että hänet valittiin päärooliin vuoden 1953 elokuvaan Roman Holiday. Hepburn voitti parhaan naispääosan Oscar-palkinnon roolistaan omapäisenä nuorena prinsessana, joka rakastuu Roomassa vapaalla jalalla olevaan toimittajaan (näyttelijä Gregory Peck). Hän voitti samana vuonna parhaan naispääosan Tony-palkinnon roolistaan elokuvassa Ondine. Seuraavan vuosikymmenen aikana Hepburn osoitti olevansa Hollywoodin parhaiden pääosanesittäjien veroinen muun muassa elokuvissa Sabrina (1954, William Holdenin ja Humphrey Bogartin kanssa), Funny Face (1957, Fred Astairen kanssa) ja Love in the Afternoon (1957, Gary Cooperin kanssa).
Jäljittelemättömänä Holly Golightlynä elokuvassa Aamiainen Tiffanylla (1961) Hepburn sai neljännen Oscar-ehdokkuutensa parhaan naispääosan Oscar-palkinnon saajaksi (hän oli ehdolla myös elokuvista Sabrina ja Nunnan tarina vuodelta 1959). Hän herätti kiistaa, kun hänet valittiin Eliza Doolittlen rooliin My Fair Lady -musikaalin elokuvaversiossa (1964), ja hän voitti Julie Andrewsin, joka oli esittänyt roolin Broadwaylla. Kolme vuotta myöhemmin Hepburn sai viidennen Oscar-ehdokkuuden elokuvasta Wait Until Dark, jonka tuotti hänen silloinen aviomiehensä Mel Ferrer (he menivät naimisiin vuonna 1954). Hepburn jätti pian tämän jälkeen täysipäiväisen näyttelemisen (vaikka hän esiintyikin edelleen satunnaisesti elokuvissa, muun muassa Marian-neitona Sean Conneryn Robin Hoodia vastapäätä elokuvassa Robin ja Marian vuonna 1976) ja vietti suurimman osan ajastaan kotonaan Sveitsissä. Hepburn ja Ferrer, joilla oli yksi poika, erosivat vuonna 1968, ja Hepburn meni seuraavana vuonna naimisiin italialaisen psykiatrin Andrea Dottin kanssa; heillä oli yksi yhteinen poika. Dottista erottuaan Hepburn aloitti suhteen hollantilaisen näyttelijän Robert Woldersin kanssa vuonna 1980.
Puoliksi näyttelemisestä eläkkeelle jääneenä Hepburn käytti suurimman osan energiastaan hyväntekeväisyyteen, erityisesti YK:n lastenrahastoon UNICEFiin, jonka erikoislähettilääksi hänet nimitettiin vuonna 1988. Hepburnin UNICEFin kenttämatkat veivät hänet ympäri maailmaa Guatemalasta, Hondurasista, Venezuelasta ja El Salvadorista Turkkiin, Thaimaahan, Bangladeshiin ja Sudaniin. Hän oli myös järjestön äänenkannattaja, joka auttoi keräämään rahaa ja tietoisuutta järjestön työstä puhumalla muun muassa Yhdysvaltain kongressissa. Vuonna 1992 hänelle myönnettiin presidentin vapaudenmitali.
Hepburn teki viimeisen elokuvaesiintymisensä Steven Spielbergin elokuvassa Always (1989), jossa hän esitti enkeliä. Vuonna 1992, pian palattuaan UNICEFin Somalian-matkalta, Hepburnilla todettiin paksusuolen syöpä. Hänet leikattiin marraskuussa, ja hän kuoli 20. tammikuuta 1993 kotonaan lähellä Lausannea, Sveitsissä, 63-vuotiaana.
Hepburn kuoli 20. tammikuuta 1993.