Fő pontok:

• A frissen begyűjtött, érdekes szöveteket azonnal rögzíteni kell a lebomlás elkerülése érdekében.

• A szövettanhoz általában 10%-os semleges pufferelt formalin (NBF) vagy 4%-os paraformaldehid oldatot (PFA) használnak. Ezek hatékony fixálószerek a H&E, valamint az immunhisztokémiai (IHC) markerek és speciális festékek többségéhez.

• A legjobb szövettani eredmények eléréséhez kulcsfontosságú az optimális fixálás.

Bevezetés a szövetek fixálásába

Az anatómiai patológia és a szövetek mikroszkópos vizsgálata során végzett alapvető vizsgálatokhoz a szövetek optimális fixálása, feldolgozása, metszése és festése szükséges. A fixálás a szövettan egyik kritikus kezdeti lépése. A rossz fixálás számos pontatlan eredményhez vezethet, beleértve a speciális festéseket, az immunhisztokémiát és más szövettani technikákat. A jól konzervált szövet megőrzi szerkezetét és reakcióképességét az olyan reagensekkel szemben, mint a speciális festékek, az immunhisztokémiai antitestek és az in situ hibridizációs vizsgálatokhoz használt nukleinsavszondák. Mind az alul-, mind a túlfixálás számos problémát okozhat a szövettanban, azonban az alulfixálás nagyobb problémát jelenthet, mint a túlfixálás, és el kell kerülni. A zsíros szövetek, például az emberi, patkány vagy egér agyszövetek fixálása különleges figyelmet igényelhet. Az optimális szövetfixálás biztosítja a sejtes és extracelluláris struktúrák megőrzését a vékony szelvényezés, az optimális hisztokémiai festés, valamint a hosszú távú megőrzés és archiválás érdekében. Az alábbiakban röviden tárgyaljuk az optimális fixálás elérésének fontos tényezőit mind a humán, mind az állatgyógyászati szövetek esetében.

Mi a szövetfixálás?

A fixálás olyan kémiai folyamat, amellyel a biológiai szöveteket úgy konzerváljuk, hogy a minta in vivo állapotát a lehető legjobban reprezentálják. Annak érdekében, hogy egy szövetmintát a lehető legközelebbi, az élethez hasonló állapotban lehessen megőrizni, meg kell állítani az autolízis, azaz a proteolitikus enzimek általi önlebontás, és/vagy a rothadás, azaz a szerves anyag mikroorganizmusok általi bomlása posztmortális folyamatait. Az ideális fixálónak úgy kell megőriznie az adott szövetmintát, hogy az reprezentálja annak in vivo helyzetét; a sejtes és extracelluláris morfológiának meg kell maradnia, és a fixálónak nem szabad denaturálnia a szövettani elemzés szempontjából fontos fehérjéket.

Gyakori fixálószerek a szövettanhoz

Számos fixálószer létezik, és egy adott típus használatát a későbbi elemzés diktálja. A szövettanban a leghatékonyabb és leggyakrabban használt fixálószerek aldehid alapúak. A következő fixálószerek ajánlottak H&E festéshez, valamint a legtöbb IHC markerhez és speciális festéshez:

1. Semleges pufferolt formalin (NBF): A legtöbb laboratóriumban általánosan használt 10%-os formaldehid pufferoldat, pH 7,0-7,4. Közvetlenül a műtét után a szövetet teljesen belemártjuk a 10%-os NBF-oldatba és időzítjük. Az Egyesült Államokban különböző gyártók kész oldatot kínálnak. A fixálás időzítése határozza meg az optimális fixálást, amint azt a továbbiakban tárgyaljuk.

2. Paraformaldehid (PFA) oldat: A frissen készített 4%-os PFA-oldat hasonló eredményt ad, és költséghatékony. Gyors lebomlása miatt ezt az oldatot használat előtt minden alkalommal frissen kell elkészíteni.

A hatásmechanizmus és a formaldehid mennyisége mindkét oldatban azonos.

Hatásmechanizmus

A fixálás hatásmechanizmusa az összes folyamatban lévő enzimatikus reakció és metabolikus tevékenység gyors leállítása révén, az intrinsikus biomolekulák denaturálásával. Ennek során a proteolitikus enzimek, amelyek egyébként autolízis útján emésztenék a szövetmintát, denaturálódnak, és az autolitikus folyamatok leállnak. A fixálószerek megvédik a mintát a külső károsodástól is, mivel toxikusak a legtöbb gyakori mikroorganizmusra (különösen a baktériumokra), amelyek egyébként megtelepedhetnek a szövetmintában. Ezenkívül számos fixálószer kémiailag úgy módosítja a kezelt szövetet, hogy az kevésbé ízletes legyen az opportunista mikroorganizmusok számára, ezáltal megakadályozza a rothadási folyamatot.

A formaldehid fixálási mechanizmusa az aminosav-maradványok, leggyakrabban az aminosav-lizin-maradványok (a lizin oldalláncú aminocsoportjai) közötti keresztkötés, vagyis kovalens kémiai kötések létrehozása, amelyek metilénhidakat eredményeznek. A formaldehid keresztkötése az aminometilolcsoportok és a fenol-, indol- és imidazol-oldalláncok között is létrejöhet. A formaldehid továbbá számos aminosavra, például lizinre, argininre, tirozinra, aszparaginra, hisztidinre, glutaminra és szerinre hat. A térhálósító fixálószerek megőrzik a minta belső szerkezetét, és nem károsítják jelentősen a fehérje szerkezetét. A formaldehid használata kedvező, mivel megőrzi a szövetminta morfológiáját, és a másodlagos és harmadlagos fehérjeszerkezetet nem befolyásolja, így az megmarad. Azt javasolták, hogy a formaldehid gyors behatolási sebessége miatt hatékony fixálószer.

A rögzítés módjai

A szövetek rögzítésének két módja van: az impregnálás és a transzkardiális perfúzió. A merítéses rögzítés során a frissen begyűjtött szövetet megfelelő mennyiségű fixálószerbe helyezik. Ez a rögzítés legegyszerűbb és leggyakoribb módja. A transzkardiális perfúzió ezzel szemben a keringési rendszert használja a fixálószer szétterítésére, ami ügyes kivitelezés esetén gyors és hatékony fixálást eredményez. Ez a technika általában jól megőrzött morfológiát eredményez, az autolízis vagy rothadás okozta minimális romlással.

Rágcsálók és más kis állatok esetében a transzkardiális perfúzió erősen ajánlott a legjobb eredmények elérése érdekében. A transzkardiális perfúziót követően az érdeklődésre számot tartó szerv(ek)et be lehet meríteni a fixálószerbe a teljes fixálás biztosítása érdekében.

A fixálás időtartama

A fixálószert annyi ideig kell a szövetmintának kitenni, amennyi ahhoz szükséges, hogy az oldat teljesen behatoljon a mintába. A merítéses fixálásnál figyelembe kell venni bizonyos tényezőket, például a szövetminta sűrűségét, a behatolás sebességét és a hőmérsékletet. Fontos megjegyezni, hogy a penetráció sebessége és a fixálás sebessége a fixálószer két teljesen különböző folyamata, az utóbbi lassabban megy végbe, mint az előbbi. A penetrációs sebességre vonatkozó általános ökölszabály az 1 mm/óra. Az NBF-kezelt minták esetében 24 óra fixálási idő ajánlott.

Az alulfixálás (a fixálószer korai kivonása a kezelt szövetből) rossz morfológiai megőrzéshez vezethet, míg a túlfixálás (a fixálószer késői kivonása a kezelt szövetből) fixálási artefaktumokhoz, jelvesztéshez vagy nem specifikus háttérjelek (“zaj”) növekedéséhez vezethet. Általában nem ajánlott a szövetet 36 óránál tovább fixálni a túlfixálás elkerülése érdekében. Mindkét probléma külön megoldást igényel, és el kell kerülni a szövetminta rögzítésekor. A minta fixálószerrel való expozíciójának időtartama tehát nagyon fontos kérdés, amelyet gondosan kalibrálni kell.

A fixálási folyamat után a minta száradásával artefaktumok jelenhetnek meg. Ezek az artefaktumok organellavesztés, magzsugorodás és artifaktikus csomósodás formájában jelentkezhetnek, ezért a minta további pontos megőrzése érdekében elengedhetetlen a kezelt minta foszfátpuffer/sóoldattal történő nedvesen tartása.

A szövet mérete és a fixálószer mennyisége

A fixálószerek rossz pufferek, ezért az oldat pH-ja a fixálás során hajlamos megváltozni. Nagy mennyiségű fixálószer biztosítja az optimális fixálást. Az alkalmazott fixálószer térfogatának körülbelül 15-20-szorosának kell lennie a szövet térfogatának. A nagy térfogat általában megfelelően elvégzi a fixálást, miközben a reagens stabil marad. A legjobb eredmény elérése érdekében a szövetet olyan darabokra kell vágni, amelyek egy dimenzióban legfeljebb 4-5 mm vastagok. Ha az érdeklődésre számot tartó szövetre más célokra/alkalmazásokra (molekuláris vizsgálatok stb.) van szükség, a fixálás előtt külön is fel lehet vágni és lefagyasztani.

Összefoglaló

• A fixálást közvetlenül a műtét/felboncolás után kell elvégezni.

• A szövetet 10%-os semleges puffer formaldehid (NBF) oldatban vagy frissen készített 4%-os paraformaldehid oldatban kell fixálni. A formaldehid alapú fixálószerek előnyben részesülnek a hosszú távú szövetkonzerváláshoz, és ismertek arról, hogy a legjobb eredményeket adják a metszetek, a morfológia (H&E), a speciális festések és az immunhisztokémia esetében.

• Vágja a szövetet kisebb darabokra (max. 4-5 mm), és használjon bőséges mennyiségű fixálószert, ügyelve arra, hogy a szövet teljesen elmerüljön a fixálószerben.

• A fixálást a szövet méretétől függően legfeljebb 24-36 órán keresztül kell végezni. A minta fixálószerrel való expozíciójának időzítése fontos, és azt kalibrálni kell.

• A fixált szövetet át kell helyezni PBS-be vagy 70%-os etanolba, és el kell küldeni feldolgozásra a szövetblokkok elkészítéséhez.

Kérje a laboratórium munkatársainak tanácsát, ha a fixált szöveteket hosszabb ideig kell tárolni, vagy további tanácsokra van szüksége a fixálással és/vagy a szövetminták szállításával kapcsolatban. A kérdéseket a [email protected] e-mail címre küldheti:

Az alábbi címre: Rajni Sharma, Ph.D.