Points principaux :

• Les tissus d’intérêt fraîchement récoltés doivent être immédiatement fixés pour éviter toute dégradation.

• Le formol tamponné neutre (NBF) à 10 % ou la solution de paraformaldéhyde (PFA) à 4 % sont couramment utilisés pour l’histologie. Ce sont des fixateurs efficaces pour H&E, et la majorité des marqueurs d’immunohistochimie (IHC) et des colorations spéciales.

• Une fixation optimale est la clé des meilleurs résultats en histopathologie.

Introduction à la fixation des tissus

Les tests de base en anatomie pathologique et l’examen microscopique des tissus nécessitent une fixation, un traitement, une section et une coloration optimales des tissus. La fixation est une étape initiale critique en histologie. Une mauvaise fixation peut entraîner de nombreux résultats inexacts, notamment en ce qui concerne les colorations spéciales, l’immunohistochimie et d’autres techniques histologiques. Un tissu bien préservé conserve sa structure et sa réactivité aux réactifs tels que les colorants spéciaux, les anticorps pour l’immunohistochimie et les sondes d’acide nucléique pour les tests d’hybridation in situ. La sous-fixation et la sur-fixation peuvent toutes deux causer de nombreux problèmes en histologie, mais la sous-fixation peut être un problème plus important que la sur-fixation et doit être évitée. La fixation des tissus gras comme le tissu cérébral humain, de rat ou de souris peut nécessiter une attention particulière. Une fixation optimale des tissus assure la préservation des structures cellulaires et extracellulaires afin de réaliser des coupes fines, une coloration histochimique optimale et une conservation et un archivage à long terme. Nous discutons ici brièvement des facteurs importants pour obtenir une fixation optimale pour les tissus humains et vétérinaires.

Qu’est-ce que la fixation des tissus ?

La fixation est un processus chimique par lequel les tissus biologiques sont préservés pour représenter autant que possible l’état in vivo de l’échantillon. Pour conserver un échantillon de tissu dans un état aussi proche que possible de la vie, il faut arrêter les processus post-mortem d’autolyse, qui est une autodégradation par des enzymes protéolytiques, et/ou de putréfaction, qui est la décomposition de la matière organique par l’action de micro-organismes. Un fixateur idéal doit préserver l’échantillon de tissu donné d’une manière représentative de sa situation in vivo ; la morphologie cellulaire et extracellulaire doit être préservée, et le fixateur ne doit pas dénaturer les protéines qui sont importantes pour l’analyse histopathologique.

Fixateurs courants pour l’histologie

Un certain nombre de fixateurs existe et l’utilisation d’un type particulier est dictée par l’analyse en aval. Pour l’histologie, les fixateurs les plus efficaces et les plus couramment utilisés sont à base d’aldéhydes. Les fixateurs suivants sont recommandés pour la coloration H&E, et la plupart des marqueurs IHC et des colorations spéciales :

1. Formaline tamponnée neutre (NBF) : Une solution tampon de formaldéhyde à 10%, pH 7,0-7,4 est couramment utilisée dans la plupart des laboratoires. Immédiatement après la chirurgie, le tissu est complètement immergé dans la solution NBF à 10% et chronométré. Une solution prête à l’emploi est disponible auprès de différents fournisseurs aux États-Unis. Le moment de la fixation détermine la fixation optimale comme discuté plus loin.

2. Solution de paraformaldéhyde (PFA) : Une solution de PFA à 4% fraîchement préparée produit des résultats similaires et est rentable. En raison de sa dégradation rapide, cette solution est préparée fraîche à chaque fois avant d’être utilisée.

Le mécanisme d’action et la quantité de formaldéhyde dans les deux solutions sont les mêmes.

Mécanisme d’action

Le mécanisme d’action de la fixation consiste à mettre rapidement fin à toutes les réactions enzymatiques et activités métaboliques en cours en dénaturant les biomolécules intrinsèques. Ce faisant, les enzymes protéolytiques qui, autrement, digéreraient l’échantillon de tissu par autolyse, sont dénaturées, et les processus autolytiques sont arrêtés. Les fixateurs protègent également l’échantillon contre les dommages extrinsèques car ils sont toxiques pour la plupart des micro-organismes courants (en particulier les bactéries) qui pourraient autrement coloniser un échantillon de tissu. En outre, de nombreux fixateurs modifient chimiquement le tissu traité pour qu’il soit moins appétent pour les micro-organismes opportunistes, empêchant ainsi le processus de putréfaction.

Le mécanisme de fixation du formaldéhyde se fait par réticulation, ou création de liaisons chimiques covalentes, entre les résidus d’acides aminés, le plus souvent celui des résidus de lysine des acides aminés (groupes amino à chaîne latérale de la lysine), qui donnent lieu à des ponts méthylène. La réticulation du formaldéhyde peut également se produire entre les groupes aminométhylol et les chaînes latérales de phénol, d’indole et d’imidazole. En outre, le formaldéhyde agit sur une variété d’acides aminés, tels que la lysine, l’arginine, la tyrosine, l’asparagine, l’histidine, la glutamine et la sérine. Les fixateurs réticulants maintiennent les structures internes d’un échantillon et n’endommagent pas la structure de la protéine de manière significative. L’utilisation du formaldéhyde est favorable car il maintient la morphologie de l’échantillon de tissu et les structures secondaires et tertiaires des protéines ne sont pas affectées et sont donc préservées. Il a été proposé que le formaldéhyde soit un fixateur efficace en raison de sa vitesse de pénétration rapide.

Modes de fixation

Il existe deux façons de fixer les tissus – l’immersion et la perfusion transcardiaque. La fixation par immersion consiste à placer les tissus fraîchement prélevés dans une quantité adéquate de fixateur. C’est la méthode de fixation la plus simple et la plus courante. La perfusion transcardiaque, quant à elle, utilise le système circulatoire pour répandre le fixateur, ce qui, lorsqu’elle est réalisée avec compétence, permet une fixation rapide et efficace. Cette technique permet généralement d’obtenir une morphologie bien préservée avec une dégradation minimale causée par l’autolyse ou la putréfaction.

Pour les rongeurs et autres petits animaux, la perfusion transcardiaque est fortement recommandée pour obtenir les meilleurs résultats. Après la perfusion transcardiaque, le ou les organes d’intérêt récoltés peuvent être immergés dans le fixateur pour assurer une fixation complète.

La durée de la fixation

Un fixateur doit être exposé à l’échantillon de tissu aussi longtemps que nécessaire pour que la solution pénètre complètement dans l’échantillon. Pour la fixation par immersion, certains facteurs tels que la densité de l’échantillon de tissu, le taux de pénétration et la température doivent être pris en considération. Il est important de noter que la vitesse de pénétration et la vitesse de fixation sont deux processus complètement différents d’un fixateur, le second se déroulant plus lentement que le premier. Une règle générale à appliquer pour la vitesse de pénétration est de 1 mm/heure. Un temps de fixation de 24 heures est recommandé pour les échantillons traités au NBF.

Une sous-fixation (retrait précoce du fixateur du tissu traité) peut entraîner une mauvaise préservation morphologique, tandis qu’une sur-fixation (retrait tardif du fixateur du tissu traité) peut entraîner des artefacts de fixation, une perte de signal ou une augmentation des signaux de fond non spécifiques (« bruit »). En général, il n’est pas recommandé de fixer le tissu pendant plus de 36 heures pour éviter la sur-fixation. Ces deux problèmes nécessitent leurs propres solutions et doivent être évités lors de la fixation d’un échantillon de tissu. La durée d’exposition d’un échantillon au fixateur est donc une question très importante qui doit être soigneusement calibrée.

Après le processus de fixation, des artefacts peuvent être introduits lorsque l’échantillon sèche. Ces artefacts peuvent se présenter sous la forme d’une perte d’organelles, d’un rétrécissement nucléaire et d’un agglutinement artéfactuel, il est donc vital de garder l’échantillon traité humide avec un tampon phosphate/solution saline pour continuer à préserver précisément l’échantillon.

Taille du tissu et volume du fixateur

Les fixateurs sont de mauvais tampons ; par conséquent, le pH de la solution a tendance à changer pendant le processus de fixation. Un grand volume de fixateur assurera une fixation optimale. Le volume de fixateur utilisé doit être approximativement 15-20x le volume du tissu. Un grand volume aura tendance à effectuer la fixation de manière adéquate tout en gardant le réactif stable. Pour de meilleurs résultats, le tissu doit être coupé en morceaux dont l’épaisseur ne dépasse pas 4-5 mm dans une dimension. Si le tissu d’intérêt est nécessaire à d’autres fins/applications (tests moléculaires, etc.), il peut être coupé et congelé instantanément séparément avant la fixation.

Summary

• La fixation doit être effectuée immédiatement après la chirurgie/dissection.

• Fixer le tissu dans une solution tampon neutre de formaldéhyde (NBF) à 10% ou dans une solution de paraformaldéhyde à 4% fraîchement préparée. Les fixateurs à base de formaldéhyde sont préférés pour la conservation à long terme des tissus et sont connus pour donner les meilleurs résultats pour la coupe, la morphologie (H&E), les colorations spéciales et l’immunohistochimie.

• Coupez les tissus en plus petits morceaux (4-5 mm maximum) et utilisez une quantité suffisante de fixateur, en vous assurant que les tissus sont complètement immergés dans le fixateur.

• La fixation doit être effectuée pendant un maximum de 24-36 heures en fonction de la taille du tissu. Le chronométrage de l’exposition d’un échantillon au fixateur est important et doit être calibré.

• Les tissus fixés doivent être transférés dans du PBS ou de l’éthanol à 70% et envoyés pour traitement afin de préparer des blocs de tissus.

Veuillez consulter le personnel du laboratoire si vous devez conserver les tissus fixés pendant une période plus longue ou si vous avez besoin de conseils supplémentaires sur la fixation et/ou l’expédition des échantillons de tissus. Les questions peuvent être envoyées par courriel à [email protected].

Écrit par : Hannah Bashar

Éditée par : Rajni Sharma, Ph.D.