Pääkohdat:

• Tuoreena kerätty kiinnostava kudos on fiksoitava välittömästi hajoamisen välttämiseksi.

• Histologiassa käytetään yleisesti 10-prosenttista neutraalipuskuroitua formaliinia (NBF) tai 4-prosenttista paraformaldehydiliuosta (PFA). Nämä ovat tehokkaita fiksatiiveja H&E:lle ja useimmille immunohistokemiallisille (IHC) merkkiaineille ja erikoisvärjäyksille.

• Optimaalinen fiksaatio on avain parhaisiin histopatologisiin tuloksiin.

Introduction to Tissue Fixation

Kudosten fiksaatio

Anatomisen patologian ja kudosten mikroskooppisen tutkimisen peruskokeet edellyttävät kudosten optimaalista fiksaatiota, käsittelyä, leikekappaleittain leikkaamista ja värjäystä. Fiksaatio on kriittinen alkuvaihe histologiassa. Huono fiksaatio voi johtaa moniin epätarkkoihin tuloksiin, mukaan lukien erikoisvärjäykset, immunohistokemia ja muut histologiset tekniikat. Hyvin säilötty kudos säilyttää rakenteensa ja reaktiivisuutensa reagensseille, kuten erikoisvärjäyksille, immunohistokemiassa käytettäville vasta-aineille ja in situ -hybridisaatiokokeissa käytettäville nukleiinihappokoettimille. Sekä ali- että ylifiksaatio voi aiheuttaa paljon ongelmia histologiassa, mutta alifiksaatio voi kuitenkin olla suurempi ongelma kuin ylifiksaatio, ja sitä on vältettävä. Rasvaisen kudoksen, kuten ihmisen, rotan tai hiiren aivokudoksen, fiksaatio saattaa vaatia erityistä huomiota. Optimaalinen kudoksen fiksaatio varmistaa solu- ja solunulkoisten rakenteiden säilymisen, jotta saadaan aikaan ohutleikkaus, optimaalinen histokemiallinen värjäys ja pitkäaikainen säilytys ja arkistointi. Tässä käsitellään lyhyesti tärkeitä tekijöitä optimaalisen fiksaation saavuttamiseksi sekä ihmis- että eläinperäisten kudosten osalta.

Mitä on kudosten fiksaatio?

Fiksaatio on kemiallinen prosessi, jonka avulla biologinen kudos säilytetään siten, että se edustaa mahdollisimman hyvin näytteen in vivo -tilaa. Jotta kudosnäyte voidaan säilyttää mahdollisimman lähellä elämää olevassa tilassa, on pysäytettävä kuolemanjälkeiset prosessit eli autolyysi, joka on proteolyyttisten entsyymien avulla tapahtuvaa itsestään tapahtuvaa hajoamista, ja/tai mätäneminen, joka on orgaanisen aineen hajoamista mikro-organismien vaikutuksesta. Ihanteellisen fiksatiivin olisi säilytettävä kyseinen kudosnäyte tavalla, joka edustaa sen in vivo -tilannetta; solu- ja solunulkoisen morfologian olisi säilyttävä, eikä fiksatiivin pitäisi denaturoida histopatologisen analyysin kannalta tärkeitä proteiineja.

Yleiset histologian fiksatiivit

Fiksatiiveja on useita, ja tietyn tyypin käyttö määräytyy jatkoanalyysin mukaan. Histologiassa tehokkaimmat ja yleisimmin käytetyt fiksatiivit ovat aldehydipohjaisia. Seuraavia fiksatiiveja suositellaan H&E-värjäykseen sekä useimpiin IHC-markkereihin ja erikoisvärjäyksiin:

1. Neutraalipuskuroitu formaliini (NBF): Useimmissa laboratorioissa käytetään yleisesti 10 %:n formaldehydipuskuriliuosta, pH 7,0-7,4. Välittömästi leikkauksen jälkeen kudos upotetaan kokonaan 10 % NBF-liuokseen ja ajoitetaan. Käyttövalmista liuosta on saatavilla useilta toimittajilta Yhdysvalloissa. Kiinnityksen ajoitus määrittää optimaalisen kiinnityksen, kuten jäljempänä käsitellään.

2. Paraformaldehydiliuos (PFA): Tuoreella 4 %:n PFA-liuoksella saadaan samanlaisia tuloksia, ja se on kustannustehokasta. Koska liuos hajoaa nopeasti, se valmistetaan tuoreena joka kerta ennen käyttöä.

Vaikutusmekanismi ja formaldehydin määrä molemmissa liuoksissa ovat samat.

Vaikutusmekanismi

Fiksaation vaikutusmekanismina on kaikkien meneillään olevien entsymaattisten reaktioiden ja aineenvaihduntatoimintojen nopea lopettaminen denaturoimalla luontaiset biomolekyylit. Tällöin proteolyyttiset entsyymit, jotka muutoin hajottaisivat kudosnäytettä autolyysin avulla, denaturoituvat ja autolyyttiset prosessit pysähtyvät. Fixatiivit suojaavat näytettä myös ulkoisilta vaurioilta, sillä ne ovat myrkyllisiä useimmille tavallisille mikro-organismeille (erityisesti bakteereille), jotka muutoin voisivat asettua kudosnäytteeseen. Lisäksi monet fiksatiivit muuttavat käsiteltyä kudosta kemiallisesti siten, että se on vähemmän miellyttävä opportunistisille mikro-organismeille, mikä estää mätänemisprosessin.

Formaldehydin fiksaatiomekanismi perustuu ristisilloittumiseen eli kovalenttisten kemiallisten sidosten luomiseen aminohappojäämien, tavallisimmin aminohappojen lysiinijäämien (lysiinin sivuketjujen aminoryhmien) välille, jolloin syntyy metyleenisiltoja. Formaldehydin ristisilloittumista voi tapahtua myös aminometyyliryhmien ja fenoli-, indoli- ja imidatsoli-sivuketjujen välillä. Lisäksi formaldehydi vaikuttaa useisiin aminohappoihin, kuten lysiiniin, arginiin, tyrosiiniin, asparagiiniin, histidiiniin, glutamiiniin ja seriiniin. Ristisilloittavat fiksatiivit säilyttävät näytteen sisäiset rakenteet eivätkä vahingoita proteiinin rakennetta merkittävästi. Formaldehydin käyttö on suotuisaa, koska se säilyttää kudosnäytteen morfologian ja sekundaarinen ja tertiäärinen proteiinirakenne säilyvät ennallaan. On esitetty, että formaldehydi on tehokas fiksatiivi sen nopean tunkeutumisnopeuden vuoksi.

Fiksaatiotavat

Kudosten kiinnittämiseen on kaksi tapaa: upotus ja transkardiaalinen perfuusio. Immersiivisessä kiinnityksessä tuore kudos asetetaan riittävään määrään kiinnitysainetta. Tämä on yksinkertaisin ja yleisin kiinnitystapa. Transkardiaalisessa perfuusiossa taas käytetään verenkiertojärjestelmää kiinnitysaineen levittämiseen, mikä taitavasti toteutettuna johtaa nopeaan ja tehokkaaseen kiinnitykseen. Tällä tekniikalla saadaan yleensä hyvin säilynyt morfologia, jossa autolyysin tai mädäntymisen aiheuttama hajoaminen on mahdollisimman vähäistä.

Jyrsijöille ja muille pieneläimille transkardiaalinen perfuusio on erittäin suositeltavaa parhaiden tulosten saavuttamiseksi. Transkardiaalisen perfuusion jälkeen kiinnostava(t) elin(t) voidaan upottaa fiksatiiviin täydellisen fiksaation varmistamiseksi.

Fiksaation kesto

Fiksaatioainetta on altistettava kudosnäytteelle niin kauan, että liuos tunkeutuu kokonaan näytteeseen. Uppofiksaatiossa on otettava huomioon tietyt tekijät, kuten kudosnäytteen tiheys, tunkeutumisnopeus ja lämpötila. On tärkeää huomata, että tunkeutumisnopeus ja kiinnittymisnopeus ovat kaksi täysin erilaista fiksatiivin prosessia, joista jälkimmäinen etenee hitaammin kuin edellinen. Yleinen nyrkkisääntö penetraationopeudelle on 1 mm/tunti. NBF-käsitellyille näytteille suositellaan 24 tunnin kiinnitysaikaa.

Alifiksaatio (fiksatiivin aikainen poistaminen käsitellystä kudoksesta) voi johtaa huonoon morfologiseen säilymiseen, kun taas ylifiksaatio (fiksatiivin myöhäinen poistaminen käsitellystä kudoksesta) voi johtaa fiksaatioartefakteihin, signaalin häviämiseen tai epäspesifisten taustasignaalien (”kohinan”) lisääntymiseen. Yleisesti ottaen ei ole suositeltavaa fiksoida kudosta yli 36 tuntia, jotta vältetään liiallinen fiksaatio. Molemmat ongelmat vaativat omat ratkaisunsa, ja niitä on vältettävä kudosnäytettä kiinnitettäessä. Näytteen fiksatiiville altistamisen kesto on siis erittäin tärkeä asia, joka on kalibroitava huolellisesti.

Fiksaatioprosessin jälkeen näytteen kuivuessa voi syntyä artefakteja. Nämä artefaktit voivat ilmetä organellien häviämisenä, ydinkudoksen kutistumisena ja artefaktuaalisena paakkuuntumisena, joten on elintärkeää pitää käsitelty näyte kosteana fosfaattipuskuriliuoksella/suolaliuoksella, jotta näyte säilyy edelleen tarkasti.

Kudoksen koko ja fiksatiivin määrä

Fiksatiivit ovat huonoja puskureita, joten liuoksen pH pyrkii muuttumaan fiksaation aikana. Suuri määrä fiksatiivia takaa optimaalisen fiksaation. Käytettävän fiksatiivin tilavuuden tulisi olla noin 15-20 kertaa kudoksen tilavuus. Suurella tilavuudella on taipumus suorittaa fiksaatio asianmukaisesti ja pitää reagenssi vakaana. Parhaiden tulosten saavuttamiseksi kudos olisi leikattava paloiksi, jotka ovat enintään 4-5 mm paksuja yhdessä ulottuvuudessa. Jos kiinnostavaa kudosta tarvitaan muihin tarkoituksiin/sovelluksiin (molekyylitestit jne.), se voidaan leikata ja pakastaa erikseen ennen fiksaatiota.

Yhteenveto

• Fiksaatio on suoritettava välittömästi leikkauksen/leikkauksen/leikkauksen jälkeen.

• Fiksaatio 10 %:n neutraali puskurimuodostumaliuoksessa (NBF-liuoksessa, neutraali puskurimuodostuma, NBFiliuoksessa) tai tuoretta valmistettua 4 %:n parafylliuosta. Formaldehydipohjaisia fiksatiiveja suositaan kudosten pitkäaikaiseen säilyttämiseen, ja niiden tiedetään tuottavan parhaat tulokset leikkelyssä, morfologiassa (H&E), erityisvärjäyksissä ja immunohistokemiassa.

• Paloittele kudos pienemmiksi paloiksi (enintään 4-5 mm) ja käytä runsaasti fiksatiivia varmistaen, että kudos on täysin upotettu fiksatiiviin.

• Fiksaatio saa kestää enintään 24-36 tuntia kudoksen koosta riippuen. Näytteen fiksatiiville altistamisen ajoitus on tärkeää, ja se on kalibroitava.

• Fiksoitu kudos on siirrettävä PBS:ään tai 70-prosenttiseen etanoliin ja lähetettävä käsiteltäväksi kudosblokkien valmistamiseksi.

Konsultoi laboratoriohenkilökuntaa, jos haluat säilyttää fiksoitua kudosta pidempään tai tarvitset lisäneuvoja fiksoinnista ja/tai kudosnäytteiden lähettämisestä. Kysymykset voi lähettää sähköpostitse osoitteeseen [email protected].

Kirjoittanut: Hannah Bashar

Kirjoittanut: Hannah Bashar

Toimittanut: Rajni Sharma, Ph.D.