Hauptpunkte:

• Frisch entnommenes Gewebe von Interesse sollte sofort fixiert werden, um einen Abbau zu vermeiden.

• 10% neutral gepuffertes Formalin (NBF) oder 4% Paraformaldehyd-Lösung (PFA) werden üblicherweise für die Histologie verwendet. Dies sind wirksame Fixiermittel für H&E und die meisten immunhistochemischen (IHC) Marker und Spezialfärbungen.

• Optimale Fixierung ist der Schlüssel zu besten Ergebnissen in der Histopathologie.

Einführung in die Fixierung von Gewebe

Die grundlegenden Tests in der anatomischen Pathologie und die mikroskopische Untersuchung von Gewebe erfordern eine optimale Fixierung, Verarbeitung, Schnittführung und Färbung von Gewebe. Die Fixierung ist ein kritischer erster Schritt in der Histologie. Eine schlechte Fixierung kann zu zahlreichen ungenauen Ergebnissen führen, auch bei Spezialfärbungen, immunhistochemischen und anderen histologischen Verfahren. Ein gut konserviertes Gewebe behält seine Struktur und Reaktivität für Reagenzien wie Spezialfärbungen, Antikörper für die Immunhistochemie und Nukleinsäuresonden für In-situ-Hybridisierungstests. Sowohl eine Unter- als auch eine Überfixierung kann in der Histologie zahlreiche Probleme verursachen, wobei eine Unterfixierung ein größeres Problem darstellen kann als eine Überfixierung und vermieden werden muss. Die Fixierung von fetthaltigem Gewebe wie Gehirngewebe von Menschen, Ratten oder Mäusen erfordert besondere Aufmerksamkeit. Eine optimale Gewebefixierung gewährleistet die Erhaltung der zellulären und extrazellulären Strukturen, um dünne Schnitte, optimale histochemische Färbungen und eine langfristige Konservierung und Archivierung zu ermöglichen. Im Folgenden werden die wichtigsten Faktoren für eine optimale Fixierung von menschlichem und tierischem Gewebe kurz erörtert.

Was ist Gewebefixierung?

Fixierung ist ein chemischer Prozess, durch den biologisches Gewebe so konserviert wird, dass der In-vivo-Zustand der Probe so weit wie möglich erhalten bleibt. Um eine Gewebeprobe in einem Zustand zu konservieren, der dem Leben so nahe wie möglich kommt, müssen die postmortalen Prozesse der Autolyse, d. h. der Selbstzerstörung durch proteolytische Enzyme, und/oder der Fäulnis, d. h. des Zerfalls organischer Stoffe durch Mikroorganismen, aufgehalten werden. Ein ideales Fixiermittel sollte die gegebene Gewebeprobe in einer Weise konservieren, die repräsentativ für ihre In-vivo-Situation ist; die zelluläre und extrazelluläre Morphologie sollte erhalten bleiben, und das Fixiermittel sollte Proteine, die für die histopathologische Analyse wichtig sind, nicht denaturieren.

Gängige Fixiermittel für die Histologie

Es gibt eine Reihe von Fixiermitteln, und die Verwendung eines bestimmten Typs hängt von der nachfolgenden Analyse ab. Für die Histologie sind die wirksamsten und am häufigsten verwendeten Fixiermittel auf Aldehydbasis. Die folgenden Fixiermittel werden für H&E-Färbungen und die meisten IHC-Marker und Spezialfärbungen empfohlen:

1. Neutral gepuffertes Formalin (NBF): Eine 10%ige Formaldehyd-Pufferlösung mit einem pH-Wert von 7,0-7,4 wird in den meisten Labors verwendet. Unmittelbar nach der Operation wird das Gewebe vollständig in die 10%ige NBF-Lösung getaucht und die Zeit gestoppt. Eine gebrauchsfertige Lösung ist bei verschiedenen Anbietern in den USA erhältlich. Der Zeitpunkt der Fixierung bestimmt die optimale Fixierung, wie weiter unten erläutert wird.

2. Paraformaldehyd (PFA)-Lösung: Eine frisch zubereitete 4 %ige PFA-Lösung führt zu ähnlichen Ergebnissen und ist kostengünstig. Da sie sich schnell abbaut, wird diese Lösung jedes Mal vor der Verwendung frisch zubereitet.

Der Wirkmechanismus und die Menge des Formaldehyds in beiden Lösungen sind gleich.

Wirkmechanismus

Der Wirkmechanismus der Fixierung besteht in der schnellen Beendigung aller laufenden enzymatischen Reaktionen und Stoffwechselaktivitäten durch Denaturierung der intrinsischen Biomoleküle. Dabei werden proteolytische Enzyme denaturiert, die sonst die Gewebeprobe durch Autolyse verdauen würden, und autolytische Prozesse werden gestoppt. Fixiermittel schützen die Probe auch vor extrinsischen Schäden, da sie für die meisten gängigen Mikroorganismen (insbesondere Bakterien), die sich sonst in einer Gewebeprobe ansiedeln könnten, toxisch sind. Darüber hinaus verändern viele Fixiermittel das behandelte Gewebe chemisch so, dass es für opportunistische Mikroorganismen weniger schmackhaft ist, wodurch der Prozess der Fäulnis verhindert wird.

Der Fixierungsmechanismus von Formaldehyd beruht auf der Vernetzung, d. h. der Schaffung kovalenter chemischer Bindungen zwischen Aminosäureresten, meist den Lysinresten (Seitenkettenaminogruppen von Lysin), die zu Methylenbrücken führen. Die Vernetzung von Formaldehyd kann auch zwischen den Aminomethylolgruppen und den Phenol-, Indol- und Imidazol-Seitenketten stattfinden. Darüber hinaus wirkt Formaldehyd auf eine Vielzahl von Aminosäuren, wie Lysin, Arginin, Tyrosin, Asparagin, Histidin, Glutamin und Serin. Vernetzende Fixiermittel erhalten die inneren Strukturen einer Probe und schädigen die Struktur des Proteins nicht wesentlich. Die Verwendung von Formaldehyd ist vorteilhaft, da die Morphologie der Gewebeprobe erhalten bleibt und die sekundäre und tertiäre Proteinstruktur nicht beeinträchtigt wird und somit erhalten bleibt. Es wurde vorgeschlagen, dass Formaldehyd aufgrund seiner schnellen Penetrationsgeschwindigkeit ein wirksames Fixiermittel ist.

Fixierungsmethoden

Es gibt zwei Arten der Fixierung von Gewebe – Immersion und transkardiale Perfusion. Bei der Immersionsfixierung wird frisch entnommenes Gewebe in eine ausreichende Menge Fixiermittel gelegt. Dies ist die einfachste und häufigste Art der Fixierung. Bei der transkardialen Perfusion hingegen wird das Fixiermittel über den Blutkreislauf verteilt, was bei geschickter Ausführung zu einer schnellen und wirksamen Fixierung führt. Diese Technik führt im Allgemeinen zu einer gut erhaltenen Morphologie mit minimaler Degradation durch Autolyse oder Fäulnis.

Bei Nagetieren und anderen Kleintieren wird die transkardiale Perfusion dringend empfohlen, um die besten Ergebnisse zu erzielen. Nach der transkardialen Perfusion kann das entnommene Organ bzw. können die entnommenen Organe in das Fixiermittel getaucht werden, um eine vollständige Fixierung zu gewährleisten.

Fixierungsdauer

Ein Fixiermittel sollte so lange auf die Gewebeprobe aufgetragen werden, bis die Lösung vollständig in die Probe eingedrungen ist. Bei der Immersionsfixierung müssen bestimmte Faktoren wie die Dichte der Gewebeprobe, die Durchdringungsgeschwindigkeit und die Temperatur berücksichtigt werden. Es ist wichtig zu beachten, dass die Penetrationsrate und die Fixierungsrate zwei völlig unterschiedliche Prozesse eines Fixierungsmittels sind, wobei der letztere langsamer abläuft als der erstere. Als allgemeine Faustregel für die Penetrationsrate gilt 1 mm/Stunde. Für NBF-behandelte Proben wird eine Fixierungszeit von 24 Stunden empfohlen.

Unterfixierung (frühzeitiges Abziehen des Fixiermittels aus dem behandelten Gewebe) kann zu einer schlechten morphologischen Erhaltung führen, während Überfixierung (spätes Abziehen des Fixiermittels aus dem behandelten Gewebe) zu Fixierungsartefakten, Signalverlust oder verstärkten unspezifischen Hintergrundsignalen („Rauschen“) führen kann. Im Allgemeinen wird empfohlen, das Gewebe nicht länger als 36 Stunden zu fixieren, um eine Überfixierung zu vermeiden. Beides sind Probleme, die eigene Lösungen erfordern und bei der Fixierung einer Gewebeprobe vermieden werden müssen. Die Dauer, die eine Probe dem Fixiermittel ausgesetzt ist, ist daher ein sehr wichtiger Punkt, der sorgfältig kalibriert werden muss.

Nach dem Fixierprozess können Artefakte auftreten, wenn die Probe trocknet. Diese Artefakte können in Form von Organellenverlust, Kernschrumpfung und artefaktischer Verklumpung auftreten. Daher ist es von entscheidender Bedeutung, die behandelte Probe mit Phosphatpuffer/Salzlösung feucht zu halten, um die Probe weiterhin genau zu konservieren.

Größe des Gewebes und Volumen des Fixiermittels

Fixiermittel sind schlechte Puffer; daher neigt der pH-Wert der Lösung dazu, sich während des Fixierungsprozesses zu verändern. Ein großes Volumen des Fixiermittels gewährleistet eine optimale Fixierung. Das Volumen des Fixiermittels sollte etwa das 15- bis 20-fache des Volumens des Gewebes betragen. Ein großes Volumen führt zu einer angemessenen Fixierung und hält das Reagenz stabil. Um optimale Ergebnisse zu erzielen, sollte das Gewebe in Stücke geschnitten werden, die in einer Dimension nicht mehr als 4-5 mm dick sind. Wird das betreffende Gewebe für andere Zwecke/Anwendungen (molekulare Tests usw.) benötigt, kann es vor der Fixierung geschnitten und separat eingefroren werden.

Zusammenfassung

• Die Fixierung muss unmittelbar nach der Operation/Dissektion erfolgen.

• Gewebe in 10%iger Neutralpuffer-Formaldehyd-Lösung (NBF) oder frisch zubereiteter 4%iger Paraformaldehyd-Lösung fixieren. Fixiermittel auf Formaldehydbasis werden für die Langzeitkonservierung von Gewebe bevorzugt und sind dafür bekannt, dass sie beste Ergebnisse für Schnitte, Morphologie (H&E), spezielle Färbungen und Immunhistochemie liefern.

• Gewebe in kleinere Stücke schneiden (max. 4-5 mm) und reichlich Fixiermittel verwenden, wobei darauf zu achten ist, dass das Gewebe vollständig in das Fixiermittel eingetaucht ist.

• Die Fixierung darf je nach Größe des Gewebes nicht länger als 24-36 Stunden dauern. Der Zeitpunkt, zu dem eine Probe dem Fixiermittel ausgesetzt wird, ist wichtig und muss kalibriert werden.

• Fixiertes Gewebe sollte in PBS oder 70 %iges Ethanol überführt und zur Verarbeitung für die Herstellung von Gewebeblöcken geschickt werden.

Bitte wenden Sie sich an das Laborpersonal, wenn Sie fixiertes Gewebe länger aufbewahren müssen oder zusätzliche Beratung zur Fixierung und/oder zum Versand von Gewebeproben benötigen. Fragen können per E-Mail an [email protected] gerichtet werden.

Geschrieben von: Hannah Bashar

Bearbeitet von: Rajni Sharma, Ph.D.