Hovedsynspunkter:

• Frakt udtaget væv af interesse bør straks fikseres for at undgå nedbrydning.

• 10% Neutralbufferet formalin (NBF) eller 4% Paraformaldehydopløsning (PFA) anvendes almindeligvis til histologi. Disse er effektive fiksatorer til H&E og de fleste immunohistokemiske (IHC) markører og specielle farvestoffer.

• Optimal fiksering er nøglen til de bedste histopatologiske resultater.

Indledning til vævsfiksering

Den grundlæggende test i anatomisk patologi og mikroskopisk undersøgelse af væv kræver optimal fiksering, behandling, sektionering og farvning af væv. Fiksering er et kritisk indledende trin i histologien. Dårlig fiksering kan føre til flere unøjagtige resultater, herunder specielle farvninger, immunohistokemi og andre histologiske teknikker. Et velkonserveret væv bevarer sin struktur og sin reaktivitet over for reagenser som f.eks. specielle farvestoffer, antistoffer til immunohistokemi og nukleinsyresonder til in situ-hybridiseringsanalyser. Både underfiksering og overfiksering kan forårsage en lang række problemer i histologien, men underfiksering kan være et større problem end overfiksering og skal undgås. Fiksering af fedtvæv som f.eks. hjernevæv fra mennesker, rotter eller mus kan kræve særlig opmærksomhed. En optimal vævsfiksering sikrer bevarelse af cellulære og ekstracellulære strukturer med henblik på at opnå tyndsnit, optimal histokemisk farvning og langtidsbevaring og arkivering. Her diskuterer vi kort de vigtige faktorer for at opnå optimal fiksering for både humant og veterinært væv.

Hvad er vævsfiksering?

Fiksering er en kemisk proces, hvorved biologisk væv bevares for at repræsentere prøvens in vivotilstand så meget som muligt. For at bevare en vævsprøve i en tilstand, der ligger så tæt på livet som muligt, skal post mortem-processerne autolyse, som er selvnedbrydning via proteolytiske enzymer, og/eller putrefaction, som er nedbrydning af organisk materiale ved hjælp af mikroorganismer, standses. Et ideelt fiksationsmiddel bør bevare den givne vævsprøve på en måde, der er repræsentativ for dens in vivo-situation; den cellulære og ekstracellulære morfologi bør bevares, og fiksationsmidlet bør ikke denaturere proteiner, der er vigtige for den histopatologiske analyse.

Fælles fiksationsmidler til histologi

Der findes en række fiksationsmidler, og brugen af en bestemt type er dikteret af den efterfølgende analyse. Til histologi er de mest effektive og almindeligt anvendte fiksatorer aldehydbaserede. Følgende fixativer anbefales til H&E-farvning og de fleste IHC-markører og specielle farvestoffer:

1. Neutral buffered formalin (NBF): En 10% formaldehydbufferopløsning, pH 7,0-7,4, anvendes almindeligvis i de fleste laboratorier. Umiddelbart efter operationen nedsænkes vævet fuldstændigt i 10 % NBF-opløsning og tidsbestemmes. En brugsklar opløsning kan fås fra forskellige leverandører i USA. Tidspunktet for fiksering er afgørende for den optimale fiksering, som det diskuteres yderligere.

2. Paraformaldehyd (PFA)-opløsning: Frisk fremstillet 4 % PFA-opløsning giver lignende resultater og er omkostningseffektiv. På grund af dens hurtige nedbrydning fremstilles denne opløsning frisk hver gang før brug.

Virkningsmekanismen og mængden af formaldehyd i begge opløsninger er den samme.

Virkningsmekanisme

Virkningsmekanismen for fiksering er ved hurtigt at afslutte alle igangværende enzymatiske reaktioner og metaboliske aktiviteter ved at denaturere de iboende biomolekyler. Herved denatureres proteolytiske enzymer, som ellers ville fordøje vævsprøven via autolyse, og de autolytiske processer standses. Fixeringsmidler beskytter også prøven mod extrinsisk skade, da de er giftige for de fleste almindelige mikroorganismer (især bakterier), som ellers kan kolonisere en vævsprøve. Desuden ændrer mange fiksationsmidler kemisk det behandlede væv, så det bliver mindre velsmagende for opportunistiske mikroorganismer, hvilket forhindrer forrådnelsesprocessen.

Formaldehyds fikseringsmekanisme er gennem tværbinding, eller skabelse af kovalente kemiske bindinger, mellem aminosyrerester, oftest almindeligvis aminosyre-lysinrester (sidekædens aminogrupper af lysin), hvilket resulterer i methylenbroer. Der kan også ske tværbinding af formaldehyd mellem aminomethylolgrupperne og phenol-, indol- og imidazol-sidekæderne. Desuden virker formaldehyd på en række aminosyrer, f.eks. lysin, arginin, tyrosin, asparagin, histidin, glutamin og serin. Korsbindingsfikseringsmidler bevarer prøvens indre strukturer og skader ikke proteinets struktur væsentligt. Anvendelse af formaldehyd er fordelagtig, da det bevarer vævsprøvens morfologi, og den sekundære og tertiære proteinstruktur er upåvirket og dermed bevaret. Det er blevet foreslået, at formaldehyd er et effektivt fiksationsmiddel på grund af dets hurtige indtrængningshastighed.

Fixeringsmetoder

Der er to måder at fiksere væv på – nedsænkning og transkardial perfusion. Fiksering ved nedsænkning indebærer, at nyudtaget væv anbringes i en passende mængde fiksationsmiddel. Dette er den enkleste og mest almindelige måde at fiksere på. Ved transkardial perfusion anvendes derimod kredsløbssystemet til at sprede fikseringsmidlet, hvilket, når det udføres dygtigt, resulterer i hurtig og effektiv fiksering. Denne teknik resulterer generelt i en velbevaret morfologi med minimal nedbrydning som følge af autolyse eller forrådnelse.

For gnavere og andre små dyr anbefales transkardial perfusion stærkt for at opnå de bedste resultater. Efter transkardial perfusion kan de(t) høstede organ(er) af interesse nedsænkes i fixeringsmidlet for at sikre fuldstændig fiksering.

Længde af fiksering

Et fikseringsmiddel bør udsættes for vævsprøven så længe, som det er nødvendigt, for at opløsningen kan trænge helt ind i prøven. Ved nedsænkningsfiksering skal der tages hensyn til visse faktorer som f.eks. vævsprøvens tæthed, indtrængningshastighed og temperatur. Det er vigtigt at bemærke, at indtrængningshastighed og fiksationshastighed er to helt forskellige processer i et fiksationsmiddel, idet sidstnævnte foregår langsommere end førstnævnte. En generel tommelfingerregel for indtrængningshastigheden er 1 mm/time. En fiksationstid på 24 timer anbefales for NBF-behandlede prøver.

Underfiksering (tidlig tilbagetrækning af fiksationsmidlet fra det behandlede væv) kan føre til dårlig morfologisk bevarelse, mens overfiksering (sen tilbagetrækning af fiksationsmidlet fra det behandlede væv) kan føre til fiksationsartefakter, tab af signal eller øgede uspecifikke baggrundssignaler (“støj”). Generelt anbefales det ikke at fiksere vævet i mere end 36 timer for at undgå overfiksering. Begge problemer kræver deres egne løsninger og skal undgås ved fiksering af en vævsprøve. Varigheden af en prøves eksponering for fiksationsmidlet er således et meget vigtigt spørgsmål, som skal kalibreres omhyggeligt.

Efter fikseringsprocessen kan der forekomme artefakter, når prøven tørrer. Disse artefakter kan være i form af tab af organeller, kerne-krympning og artefaktuel sammenklumpning, så det er afgørende at holde den behandlede prøve fugtig med fosfatbuffer/saltopløsning for fortsat at bevare prøven nøjagtigt.

Størrelse af væv og volumen af fiksationsmiddel

Fiksationsmidler er dårlige buffere; derfor har opløsningens pH-værdi tendens til at ændre sig under fikseringsprocessen. En stor mængde fiksationsmiddel vil sikre en optimal fiksering. Den anvendte mængde fiksationsmiddel bør være ca. 15-20 gange vævets volumen. En stor mængde har tendens til at give en passende fiksering og samtidig holde reagenset stabilt. For at opnå de bedste resultater bør vævet skæres i stykker, der ikke er mere end 4-5 mm tykke i den ene dimension. Hvis det væv af interesse er nødvendigt til andre formål/anvendelser (molekylære tests osv.), kan det skæres op og snap-frosses separat inden fiksering.

Summarum

• Fiksering skal udføres umiddelbart efter operation/dissektion.

• Fiksering af væv i 10% neutral bufferformaldehyd (NBF) opløsning eller frisk fremstillet 4% paraformaldehydopløsning. Formaldehydbaserede fiksationsmidler foretrækkes til langtidskonservering af væv og er kendt for at give de bedste resultater ved sektionering, morfologi (H&E), specielle farvninger og immunohistokemi.

• Skær vævet i mindre stykker (max. 4-5 mm), og brug rigelig mængde fixeringsmiddel, idet du sørger for, at vævet er helt nedsænket i fixeringsmidlet.

• Fixeringen må ikke vare mere end 24-36 timer afhængigt af vævets størrelse. Timing af eksponeringen af en prøve for fixeringsmidlet er vigtig og skal kalibreres.

• Fixeret væv skal overføres til PBS eller 70 % ethanol og sendes til behandling for at forberede vævsblokke.

Konsulter venligst laboratoriepersonalet, hvis du har brug for at opbevare fikseret væv i længere tid eller har brug for yderligere rådgivning om fiksering og/eller forsendelse af vævsprøver. Spørgsmål kan sendes pr. e-mail til [email protected].

Skrevet af: Hannah Bashar

Redigeret af: Hannah Bashar

Redigeret af: Rajni Sharma, Ph.D.