Hlavní body:

• Čerstvě odebraná zajímavá tkáň by měla být okamžitě fixována, aby nedošlo k její degradaci.

• Pro histologii se běžně používá 10% neutrální pufrovaný roztok formalínu (NBF) nebo 4% roztok paraformaldehydu (PFA). Jsou to účinná fixativa pro H&E a většinu imunohistochemických (IHC) markerů a speciálních barvení.

• Optimální fixace je klíčem k nejlepším výsledkům histopatologie.

Úvod do fixace tkání

Základní vyšetření v anatomické patologii a mikroskopické vyšetření tkání vyžaduje optimální fixaci, zpracování, řezání a barvení tkání. Fixace je rozhodujícím počátečním krokem v histologii. Špatná fixace může vést k mnoha nepřesným výsledkům včetně speciálních barvení, imunohistochemie a dalších histologických technik. Dobře konzervovaná tkáň si zachovává svou strukturu a reaktivitu na činidla, jako jsou speciální barviva, protilátky pro imunohistochemii a sondy nukleových kyselin pro in situ hybridizační testy. Nedostatečná i nadměrná fixace může v histologii způsobit mnoho problémů, nicméně nedostatečná fixace může být větším problémem než nadměrná fixace a je třeba se jí vyhnout. Zvláštní pozornost může vyžadovat fixace tukové tkáně, jako je lidská, potkaní nebo myší mozková tkáň. Optimální fixace tkáně zajišťuje zachování buněčných a extracelulárních struktur, aby bylo možné dosáhnout tenkého řezu, optimálního histochemického barvení a dlouhodobého uchování a archivace. Zde stručně pojednáme o důležitých faktorech pro dosažení optimální fixace lidských i veterinárních tkání.

Co je to fixace tkání?

Fixace je chemický proces, při kterém se biologická tkáň uchovává tak, aby co nejvíce reprezentovala stav vzorku in vivo. Aby se vzorek tkáně uchoval ve stavu co nejbližšímu životu, je třeba zastavit posmrtné procesy autolýzy, což je autodegradace prostřednictvím proteolytických enzymů, a/nebo hniloby, což je rozklad organických látek působením mikroorganismů. Ideální fixační prostředek by měl daný vzorek tkáně uchovat tak, aby byl reprezentativní pro situaci in vivo; měla by být zachována buněčná a extracelulární morfologie a fixační prostředek by neměl denaturovat proteiny, které jsou důležité pro histopatologickou analýzu.

Obvyklá fixativa pro histologii

Existuje řada fixativ a použití určitého typu je dáno následnou analýzou. Pro histologii jsou nejúčinnější a nejčastěji používaná fixativa na bázi aldehydů. Pro barvení H&E a většinu markerů IHC a speciálních barvení se doporučují následující fixativa:

1. Neutrální pufrovaný formalín (NBF): Roztok 10% pufru formaldehydu o pH 7,0-7,4 se běžně používá ve většině laboratoří. Ihned po operaci se tkáň zcela ponoří do 10% roztoku NBF a načasuje se. Roztok připravený k použití je k dispozici u různých prodejců v USA. Načasování fixace určuje optimální fixaci, jak je uvedeno dále.

2. Roztok paraformaldehydu (PFA): Čerstvě připravený 4% roztok PFA poskytuje podobné výsledky a je cenově výhodný. Vzhledem k jeho rychlé degradaci se tento roztok připravuje pokaždé čerstvý před použitím.

Mechanismus účinku a množství formaldehydu v obou roztocích jsou stejné.

Mechanismus účinku

Mechanismus účinku fixace spočívá v rychlém ukončení všech probíhajících enzymatických reakcí a metabolických aktivit denaturací vnitřních biomolekul. Přitom dochází k denaturaci proteolytických enzymů, které by jinak autolýzou rozkládaly vzorek tkáně, a k zastavení autolytických procesů. Fixativa také chrání vzorek před vnějším poškozením, protože jsou toxická pro většinu běžných mikroorganismů (zejména bakterií), které by jinak mohly kolonizovat vzorek tkáně. Mnohá fixativa navíc chemicky mění ošetřenou tkáň tak, aby byla méně chutná pro oportunní mikroorganismy, a tím zabraňují procesu hniloby.

Formaldehydový mechanismus fixace spočívá v zesíťování neboli vytváření kovalentních chemických vazeb mezi aminokyselinovými zbytky, nejčastěji mezi aminokyselinovými zbytky lysinu (postranní řetězce aminoskupin lysinu), jejichž výsledkem jsou methylenové můstky. K zesíťování formaldehydu může docházet také mezi aminomethylolovými skupinami a postranními řetězci fenolu, indolu a imidazolu. Dále formaldehyd působí na řadu aminokyselin, jako je lysin, arginin, tyrosin, asparagin, histidin, glutamin a serin. Síťující fixační činidla zachovávají vnitřní strukturu vzorku a výrazně nepoškozují strukturu bílkoviny. Použití formaldehydu je výhodné, protože zachovává morfologii vzorku tkáně a sekundární a terciární struktura bílkovin není ovlivněna a zůstává tak zachována. Bylo navrženo, že formaldehyd je účinným fixačním prostředkem díky své rychlosti průniku.

Způsoby fixace

Existují dva způsoby fixace tkáně – imerze a transkardiální perfuze. Ponorná fixace spočívá v umístění čerstvě odebrané tkáně do přiměřeného množství fixativa. Jedná se o nejjednodušší a nejběžnější způsob fixace. Transkardiální perfuze naproti tomu využívá oběhový systém k rozptýlení fixativa, což při šikovném provedení vede k rychlé a účinné fixaci. Tato technika obvykle vede k dobře zachované morfologii s minimální degradací způsobenou autolýzou nebo hnilobou.

U hlodavců a jiných malých zvířat se pro dosažení nejlepších výsledků doporučuje transkardiální perfuze. Po transkardiální perfuzi lze odebraný(é) zájmový(é) orgán(y) ponořit do fixativa, aby byla zajištěna úplná fixace.

Délka fixace

Fixační činidlo by mělo být vystaveno vzorku tkáně tak dlouho, jak je potřeba, aby roztok zcela pronikl do vzorku. Při imerzní fixaci je třeba vzít v úvahu určité faktory, jako je hustota vzorku tkáně, rychlost pronikání a teplota. Je důležité si uvědomit, že rychlost penetrace a rychlost fixace jsou dva zcela odlišné procesy fixačního prostředku, přičemž druhý z nich probíhá pomaleji než první. Obecné pravidlo pro rychlost penetrace je 1 mm/hod. U vzorků ošetřených NBF se doporučuje doba fixace 24 hodin.

Nedostatečná fixace (časné stažení fixativa z ošetřené tkáně) může vést ke špatnému morfologickému zachování, zatímco přílišná fixace (pozdní stažení fixativa z ošetřené tkáně) může vést k fixačním artefaktům, ztrátě signálu nebo zvýšení nespecifických signálů pozadí („šumu“). Obecně se nedoporučuje fixovat tkáň déle než 36 hodin, aby se zabránilo nadměrné fixaci. Oba tyto problémy vyžadují vlastní řešení a je třeba se jim při fixaci vzorku tkáně vyhnout. Doba vystavení vzorku fixačnímu činidlu je tedy velmi důležitou otázkou, která musí být pečlivě kalibrována.

Po procesu fixace se mohou objevit artefakty, jakmile vzorek vyschne. Tyto artefakty mohou mít podobu ztráty organel, jaderného smršťování a arteficiálního shlukování, takže je nezbytné udržovat ošetřený vzorek vlhký fosfátovým pufrem/roztokem soli, aby byl vzorek i nadále přesně konzervován.

Velikost tkáně a objem fixativa

Fixativa jsou špatné pufry, proto má pH roztoku během procesu fixace tendenci se měnit. Velký objem fixativa zajistí optimální fixaci. Objem použitého fixativa by měl být přibližně 15-20x větší než objem tkáně. Velký objem má tendenci provádět fixaci přiměřeně a zároveň udržovat stabilitu činidla. Pro dosažení nejlepších výsledků by měla být tkáň rozřezána na kousky, které nejsou silnější než 4-5 mm v jednom rozměru. Pokud je tkáň, která vás zajímá, potřebná pro jiné účely/aplikace (molekulární testy atd.), lze ji před fixací rozříznout a samostatně zmrazit.

Souhrn

• Fixaci je třeba provést ihned po operaci/pissekci.

• Tkáň fixujte v 10% roztoku neutrálního pufru formaldehydu (NBF) nebo v čerstvě připraveném 4% roztoku paraformaldehydu. Fixativa na bázi formaldehydu jsou upřednostňována pro dlouhodobé uchování tkáně a je známo, že poskytují nejlepší výsledky pro řezání, morfologii (H&E), speciální barvení a imunohistochemii.

• Nakrájejte tkáň na menší kousky (max. 4-5 mm) a použijte dostatečné množství fixativa a ujistěte se, že je tkáň zcela ponořena ve fixativu.

• Fixace nesmí trvat déle než 24-36 hodin v závislosti na velikosti tkáně. Načasování vystavení vzorku fixativu je důležité a musí být kalibrováno.

• Fixovaná tkáň by měla být přenesena do PBS nebo 70% etanolu a odeslána ke zpracování za účelem přípravy tkáňových bloků.

Pokud potřebujete fixovanou tkáň skladovat delší dobu nebo potřebujete další rady ohledně fixace a/nebo zasílání vzorků tkání, obraťte se na pracovníky laboratoře. Dotazy můžete zasílat na e-mailovou adresu [email protected].

Napsal: Mgr: Hannah Bashar

Redakce: Hannah Bashar

Redakce: Hannah Bashar Rajni Sharma, Ph.D.