Dlouhodobé udržování mnoha forem synaptické plasticity vyžaduje syntézu nových proteinů. Zatímco úloha na zkušenosti závislé transkripce somatických genů v dlouhodobé paměti byla dobře prozkoumána , mnoho mRNA je transportováno do dendritů, což naznačuje další úlohu lokální synaptické kontroly syntézy proteinů. Na aktivitě závislá translace již existující dendritické mRNA v synapsích je totiž nezbytná pro expresi mnoha forem synaptické plasticity . Protein křehké mentální retardace X (FMRP) ovlivňuje tuto synaptickou plasticitu tím, že funguje jako klíčový regulátor translace mRNA .

FMRP byl poprvé charakterizován v souvislosti se syndromem křehké X . Gen FMR1 je u syndromu Fragile X (FX) umlčen a následná ztráta FMRP vede k příznakům této poruchy, často včetně mentálního postižení a autismu. U myšího modelu Fmr1 KO , ztráta FMRP vede ke zvýšené úrovni syntézy proteinů. Předpokládá se, že následné důsledky tohoto zvýšení jsou jádrem patofyziologie FX . Bylo dosaženo rychlého pokroku při charakterizování toho, jak ztráta FMRP ovlivňuje synaptickou funkci a plasticitu, a tyto poznatky vedly k několika strategiím nápravy poruchy, které byly ověřeny u zvířat a nyní se testují u lidí .

Přinášíme stručný přehled důkazů, většinou z myší Fmr1 KO, které naznačují roli FMRP v synaptické plasticitě. Přestože rozlišení není vždy jednoznačné, je koncepčně důležité oddělit poruchy synaptické plasticity, které jsou důsledkem změněného vývoje mozku, od těch poruch synaptické plasticity, které způsobují změnu funkce mozku u Fmr1 KO. Ačkoli jsou pro pochopení patofyziologie onemocnění důležité oba typy, pro otázku, jak FMRP přispívá k synaptické plasticitě v mozku divokého typu, je relevantní pouze ten druhý.

FMRP reguluje translaci

FMRP je protein vázající RNA a represor translace, který je dobře konzervován od myší po člověka. FMRP se spojuje s mRNA prostřednictvím jedné ze tří domén vázajících RNA , v některých případech ve spojení s adaptorovými proteiny. Existují důkazy, že FMRP může potlačovat translaci jak blokováním iniciace, tak elongace . Bodová mutace v jedné FMRP/mRNA vazebné doméně stačí k rekapitulaci fenotypů plasticity pozorovaných u myši Fmr1 KO a nejméně v jednom případě FX u lidského pacienta . Je tedy pravděpodobné, že FMRP reguluje plasticitu především v roli represoru translace.

FMRP je regulován posttranslačními modifikacemi. Fosforylovaný FMRP brzdí translokaci ribozomů a inhibuje translaci, zatímco defosforylace FMRP translaci reguluje . Obousměrná regulace fosforylace FMRP kinázou S6 a proteinfosfatázou 2A (PP2A) v reakci na aktivitu poskytuje potenciální spojení mezi synaptickou stimulací a lokální translací .

FMRP má dobré předpoklady pro regulaci synaptické plasticity

FMRP má dobré předpoklady být klíčovým regulátorem synaptické plasticity ze tří hlavních důvodů. Za prvé, tento protein se nachází v dendritických trnech , důležitých postsynaptických místech indukce a udržování plasticity. Za druhé FMRP reguluje translaci dendritické mRNA , která je nezbytná pro různé formy plasticity. A konečně, samotný FMRP je dynamicky regulován aktivitou: zkušenost a synaptická aktivace mohou kromě výše zmíněné posttranslační regulace spustit jeho lokální translaci a rychlou degradaci. Bylo prokázáno, že více experimentálních manipulací spojených se synaptickou plasticitou zvyšuje hladinu FMRP, včetně vystavení obohacenému prostředí, komplexní učební úlohy a farmakologické aktivace metabotropních glutamátových receptorů skupiny 1 (mGluR) . Důležité je, že FMRP se syntetizuje rychle, ve stejném časovém měřítku (10-30 minut) jako indukce stabilní synaptické plasticity . V hipokampálních kulturách může být zvýšení dendritického FMRP závislé na aktivitě a mGluR spíše výsledkem zvýšeného přenosu stávajícího FMRP než de novo syntézy FMRP . Ať tak či onak, FMRP je ideálním kandidátem na zapojení do regulace synaptické plasticity díky svému rychlému, přechodnému nárůstu v dendritech po dobře charakterizovaných paradigmatech indukce plasticity a také díky své roli inhibitoru translace.

FMRP reguluje mGluR-LTD prostřednictvím syntézy proteinů

Dlouhodobá potenciace (LTP) a dlouhodobá deprese (LTD) jsou dobře charakterizované formy synaptické plasticity spojené s učením a pamětí. Tyto trvalé změny synaptické síly lze vyvolat různými manipulacemi a mechanismy jejich exprese jsou rozmanité. Různé indukční protokoly spoléhají na různé mechanismy udržování, včetně požadavku na syntézu proteinů. Zvláště přesvědčivým příkladem formy plasticity vyžadující lokální translaci je LTD závislá na metabotropním glutamátovém receptoru (mGluR-LTD) v oblasti CA1 hipokampu. Aktivace mGluRs skupiny 1 (mGluR1 a 5) buď párovou nízkofrekvenční synaptickou stimulací (PP-LFS), nebo selektivním agonistou (S)-3,5-dihydroxyfenylglycinem (DHPG) , vede k trvalému poklesu synaptické síly, který je mechanisticky odlišný od klasického NMDA receptoru (NMDAR) – závislého LTD . Je důležité poznamenat, že za aktivací mGluR existuje několik mechanismů, které mohou potlačit synaptický přenos, a ty se mohou projevovat různě v závislosti na indukčním protokolu, věku, historii chovu a druhu (např. ). Za vhodných experimentálních podmínek však udržení mGluR-LTD vyžaduje rychlou syntézu proteinů během několika minut po indukci . Tato syntéza proteinů je pravděpodobně synaptická, protože mGluR-LTD lze indukovat i v případě, že je dendritická vrstva fyzicky oddělena od vrstvy buněčného těla . mGluR-LTD je částečně exprimován odstraněním AMPA receptorů ze synapsí, což rovněž vyžaduje rychlý překlad de novo . Nová syntéza proteinů může být pro synaptickou plasticitu spíše instruktivní než pouze přípustná, protože aktivace mGluR skupiny 1 rychle stimuluje syntézu proteinů v hipokampálních plátcích , dendritech a synaptoneurosomech .

Fmr1 knockoutované myši vykazují zvýšenou hipokampální mGluR-LTD (tabulka 1). Následná studie zjistila podobné zvýšení u mozečkové mGluR-LTD, která sdílí mnoho stejných mechanismů exprese . V souladu s elektrofyziologickými údaji vede ztráta FMRP k nadměrné internalizaci AMPAR zprostředkované mGluR . Kromě toho mGluR-LTD již nevyžaduje syntézu nových proteinů u myší s Fmr1 KO . Tyto výsledky v kombinaci s tím, co je známo o funkci FMRP, naznačují, že FMRP působí na inhibici syntézy proteinů potřebných pro mGluR-LTD. V nepřítomnosti FMRP jsou tyto „LTD proteiny“ již dostupné nebo nadměrně exprimované v dendritech, což vede ke zvýšenému rozsahu a přetrvávání této formy plasticity nezávislé na syntéze proteinů (obr. 1A) . Naopak postnatální nadměrná exprese FMRP snižuje velikost mGluR-LTD v neuronech divokého typu i Fmr1 KO a obnovuje její závislost na syntéze proteinů . Snížení signalizace mGluR5 u myší Fmr1 KO navíc obnovuje jak míru syntézy proteinů, tak velikost LTD v hipokampu na úroveň divokého typu , což naznačuje, že mGluR5 a FMRP působí ve funkční opozici při udržování optimální úrovně syntézy synaptických proteinů během vývoje a v dospělosti (obr. 1A).

L-LTP se zdá být normální u myší Fmr1 KO

Zatímco účinky inhibice syntézy proteinů na mGluR-LTD lze pozorovat během několika minut, většina forem synaptické plasticity nevyžaduje syntézu de novo až do několika hodin po indukci. To nejlépe charakterizuje pozdní fáze LTP (L-LTP), trvalá forma potenciace trvající nejméně 4 hodiny. Pozdní udržovací fáze L-LTP vyžaduje syntézu proteinů, ale počáteční indukce ne . Vzhledem k předpokládané roli FMRP v regulaci translace byla L-LTP jednou z prvních forem plasticity studovaných u myší s Fmr1 KO . Je zajímavé, že u myší s Fmr1 KO nebyl zjištěn žádný rozdíl ve velikosti L-LTP . Skutečnost, že odstranění FMRP ovlivňuje LTD závislou na syntéze proteinů, ale ne LTP, naznačuje, že FMRP může specificky regulovat translaci proteinů potřebných pro expresi LTD (obr. 1B). Nicméně zatímco velikost L-LTP se nemění, je možné, že L-LTP je kvalitativně odlišná ve svých požadavcích na syntézu nových proteinů, když FMRP chybí, jako je tomu v případě mGluR-LTD (a primingu LTP, viz níže). Proto bude důležité otestovat závislost L-LTP na syntéze proteinů u myší s Fmr1 KO, aby se ukázalo, že FMRP skutečně nehraje roli v regulaci přetrvávání LTP.

Alternativně může být FMRP vyžadována pro regulaci lokální, ale nikoli somatické translace v kontextu L-LTP (obr. 1C). L-LTP je tradičně indukována několikanásobnými řetězci vysokofrekvenční tetanické nebo theta burst stimulace, což jsou protokoly, které se spoléhají na celobuněčnou transkripci a translaci . L-LTP byla charakterizována u myši Fmr1 KO pomocí těchto klasických paradigmat . Použití méně intenzivního indukčního protokolu však vede k L-LTP, která je udržována specificky lokální dendritickou translací . Tato forma L-LTP, podobně jako mGluR-LTD, je citlivá na inhibitory translace, ale ne transkripce, a může být udržována v izolovaných dendritech. Bude zajímavé zjistit, zda je tato lokálně exprimovaná forma L-LTP regulována FMRP.

FMRP reguluje priming LTP

Přestože role FMRP v L-LTP je nejasná, je známo, že se FMRP podílí na LTP v jiných kontextech. Konkrétně se FMRP podílí na regulaci formy metaplasticity závislé na mGluR, která stanovuje práh pro LTP. Původně byla popsána u potkanů , slabá aktivace mGluR skupiny 1, která sama o sobě nestačí k indukci LTD, usnadňuje následnou indukci LTP („LTP priming“). Stejně jako u mGluR-LTD vyžaduje toto usnadnění translaci, ale ne transkripci . To podnítilo zkoumání role FMRP v LTP primingu . mGluR-dependentní priming LTP je srovnatelného rozsahu u WT a Fmr1 KO myší; avšak zatímco LTP priming vyžaduje akutní stimulaci syntézy proteinů u WT myší, u Fmr1 KO již není na syntéze proteinů závislý. Zatímco tedy mGluR-LTD a LTP priming jsou kvalitativně odlišné funkční důsledky syntézy proteinů stimulované Gp1 mGluR v hipokampu, oba procesy jsou odstraněním FMRP změněny (obr. 1D). Tyto výsledky naznačují, že mRNA pod translační kontrolou FMRP může kódovat proteiny potřebné pro obousměrné změny synaptické síly. Proteiny regulované FMRP by tedy měly být pojímány spíše jako strážci plasticity než pouze jako „LTD proteiny“.

Prah indukce LTP a STD-LTP je u myší Fmr1 KO zvýšen

V hipokampálních řezech Fmr1 KO je indukce LTP nedostatečná při slabém protokolu 5 theta burst, ale je normální při silném protokolu 10 theta burst (obr. 2A) . Kromě toho FMRP moduluje práh indukce dlouhodobé potenciace závislé na čase hrotu (STD-LTP). Tato forma hebbovské plasticity je indukována časově rozloženou presynaptickou a postsynaptickou aktivitou ve velmi krátkém okně . V somatosenzorické a prefrontální kůře je STD-LTP u neuronů Fmr1 KO nedostatečná . Pokud se však síla postsynaptického stimulu zvýší z jednoho hrotu na sérii pěti hrotů, STD-LTP se u KO neuronů objeví (obr. 2A) . FMRP tedy není nutný pro expresi STD-LTP, ale v jeho nepřítomnosti je práh zvýšen. Možný mechanismus probíhající regulace prahu LTP pomocí FMRP je diskutován dále v tomto přehledu.

FMRP a další formy plasticity závislé na translaci

Kromě své role ve formách Hebbovské plasticity závislých na translaci může FMRP také modulovat některé formy homeostatické plasticity. Synaptické škálování je forma homeostatické plasticity, která působí na udržení síly synapsí ve funkčním rozmezí v reakci na extrémní změny aktivity. Obecně lze říci, že snížení aktivity vede k následnému zvýšení synaptické síly v celé buňce („škálování nahoru“) a zvýšení aktivity vede ke snížení synaptické síly („škálování dolů“) . V kultuře hipokampálních plátků byly popsány dva typy zvyšování: jeden, který vyžaduje transkripci, a druhý, který vyžaduje lokální translaci . Zajímavé je, že pouze forma synaptického škálování závislá na translaci je u neuronů s nedostatkem FMRP nedostatečná. Postsynaptická virová exprese FMRP koriguje nedostatečné škálování závislé na translaci u neuronů Fmr1 KO . Bylo také pozorováno snížení synapse v reakci na vysokou aktivitu (po dlouhodobé blokádě inhibice), které vyžaduje aktivaci mGluR5 . Úloha FMRP a lokální syntézy proteinů při snižování rozsahu však nebyla přímo zkoumána.

Přestože úloha FMRP byla nejlépe charakterizována u forem plasticity závislých na mGluR, není pro tyto receptory specifická. Odstranění FMRP okluduje zvýšení syntézy proteinů zprostředkované TrkB a mění další formy LTD a LTP závislé na receptorech spřažených s G proteinem (GPCR) . Společným znakem těchto procesů je jejich závislost na lokální dendritické translaci. Důkazy skutečně naznačují, že FMRP může být specificky důležitá spíše pro regulaci lokální než somatické translace (obr. 1C), protože odstranění FMRP ovlivňuje translaci, ale ne formy Hebbovy a homeostatické plasticity závislé na transkripci.

FMRP a plasticita nezávislá na translaci

Zatímco mnoho forem synaptické plasticity závislé na translaci je u myší s Fmr1 KO abnormální, jiné formy hipokampální plasticity, včetně NMDAR-dependentní LTD a časné fáze LTP, jsou normální . Tato pozorování naznačují, že FMRP reguluje plasticitu především v roli regulátoru translace. Bylo však prokázáno, že odstranění FMRP ovlivňuje také některé formy synaptické plasticity, které nevyžadují de novo translaci, jako je LTP v časné fázi v jiných oblastech mozku, včetně kůry a amygdaly . Některé z těchto účinků lze vysvětlit modulací prahů plasticity závislých na syntéze proteinů pomocí FMRP; zdá se však pravděpodobné, že mnohé z nich představují konečné důsledky změněného synaptického vývoje u Fmr1 KO.

Příkladem je změněná LTP v amygdale. U stejných synapsí, které vykazovaly narušenou LTP, byl zaznamenán značný deficit v bazálním přenosu . Snížená synaptická konektivita mohla být příčinou defektní LTP a mohla vzniknout jako důsledek zvýšené syntézy proteinů závislých na FMRP během vývoje obvodů amygdaly.

Kandidátní proteiny bránící plasticitě regulované FMRP

Aby bylo možné určit, jak FMRP reguluje synaptickou plasticitu, musíme identifikovat synaptické proteiny, jejichž translace je regulována FMRP. FMRP má širokou škálu cílů – bylo prokázáno, že selektivně váže přibližně 4 % mRNA v mozku savců . Nedávno bylo pomocí nového vysokokapacitního imunoprecipitačního testu s křížovou vazbou (HITS-CLIP) identifikováno více než 800 cílů vazby FMRP na mRNA . Tyto cíle zahrnují geny kódující pre a postsynapticky exprimované proteiny: 27 % mRNA presynaptických proteinů (90 genů) a 23 % mRNA postsynaptických proteinů (257 genů) jsou cíli FMRP . Studie HITS-CLIP konkrétně zjistila, že 31 % mRNA kódujících proteiny v komplexu NMDAR (58 genů), 62 % v komplexu mGluR5 (32 genů) a 33 % v komplexu AMPAR (3 geny) je cílem FMRP. Tyto tři receptorové komplexy jsou důležité pro indukci a udržování synaptické plasticity, což naznačuje, že FMRP pravděpodobně působí široce jako translační regulátor a nereguluje pouze jeden nebo dva „proteiny plasticity“.

Zjištění, že mnoho cílů FMRP kóduje presynaptické proteiny, je zajímavé a poučné. Ve zralém nervovém systému jsou důkazy o lokální syntéze proteinů v axonech nebo axonálních zakončeních zatím skoupé; předpokládá se však, že během raného vývoje axonů a tvorby synapsí hraje lokální syntéza proteinů důležitou roli při výběru drah a cílů . Absence regulace syntézy proteinů FMRP během raného vývoje tedy velmi pravděpodobně mění synaptickou konektivitu dlouho před nástupem postnatální plasticity závislé na zkušenosti. Kromě toho mimo CNS hraje lokální kontrola translace v senzorických aferentních terminálech roli v nociceptivní senzibilizaci a neuropatické bolesti . FMRP je lokalizován v těchto terminálech a myši s Fmr1 KO vykazují změněnou nociceptivní senzitizaci . Tyto výsledky naznačují, že v míše může presynaptická FMRP inhibovat lokální translaci a může regulovat plasticitu bolesti i v dospělosti.

Probírali jsme dvě hlavní kategorie defektů plasticity u myší Fmr1 KO: (1) formy plasticity vyžadující FMRP/lokální translaci pro jejich udržení (mGluR-LTD) a (2) formy plasticity, kde FMRP reguluje práh jejich indukce (STD-LTP). Probereme několik proteinů v obou kategoriích, které jsou pravděpodobně zapojeny vzhledem k jejich regulaci FMRP a jejich známým rolím při udržování plasticity a nastavování prahu v synapsích divokého typu. Tyto „kandidátské proteiny“ mají sloužit jako příklady toho, jak může FMRP regulovat synaptickou plasticitu.

Proteiny udržující plasticitu: MAP1B, Arc a STEP

Nedávná práce identifikovala proteiny, jejichž translace je regulována FMRP a které se podílejí na mGluR-LTD, včetně proteinu 1B asociovaného s mikrotubuly (MAP1B) a proteinu asociovaného s cytoskeletem regulovaným aktivitou (Arc) . MAP1B je nezbytný pro endocytózu AMPA receptorů závislou na mGluR , což je mechanismus, kterým se mGluR-LTD projevuje. FMRP se spojuje s mRNA MAP1B a potlačuje její translaci , a myši Fmr1 KO vykazují zvýšenou expresi MAP1B v hipokampu . Mohou však existovat rozdíly v tom, jak FMRP reguluje translaci MAP1B, specifické pro myší kmeny a oblasti. Například v mozečku a hipokampu myší FVB může FMRP pozitivně regulovat expresi MAP1B .

Arc se podílí na endocytóze AMPAR a je regulován v dendritech po aktivaci mGluR a chování . Arc je nutný pro hipokampální mGluR-LTD a L-LTP, které jsou závislé na syntéze proteinů, a Arc-/- myši mají četné deficity učení . FMRP váže Arc mRNA a potlačuje její translaci. Výsledkem je zvýšená exprese Arc v dendritech Fmr1 KO . Vzhledem k tomu, že (a) mGluR-LTD je u myší Fmr1 KO zvýšený, (b) Arc je zvýšený v dendritech Fmr1 KO a (c) Arc je nutný pro mGluR-LTD, zdá se pravděpodobné, že FMRP reguluje mGluR-LTD prostřednictvím Arc. Tato hypotéza byla testována přímo pomocí myší s dvojitým knockoutem Fmr1/Arc, které vykazují nedostatek (spíše než přehnaný) mGluR-LTD . Toto zjištění naznačuje, že zvýšená exprese Arc může částečně vysvětlovat zvýšený mGluR-LTD pozorovaný u myší s Fmr1 KO.

Mechanicky je pro rychlé zvýšení proteinu Arc zprostředkované mGluR nutná defosforylace FMRP fosfatázou PP2A. U neuronů s Fmr1 KO jsou však hladiny Arc bazálně zvýšené, což vylučuje další účinek léčby DHPG. Akutní virová reintrodukce FMRP do neuronů Fmr1 KO normalizuje dendritické hladiny Arc a obnovuje rychlou syntézu Arc zprostředkovanou mGluR. To poskytuje další důkaz, že akutní ztráta FMRP, spíše než vývojová abnormalita, je základem fenotypů synaptické plasticity u Fmr1 knockoutované myši. eregulace translace.

Kromě MAP1B a Arc byla u Fmr1 KO myši identifikována řada dalších kandidátních proteinů LTD. Jedním ze zajímavých příkladů je proteinová tyrozinfosfatáza obohacená o striatum (STEP). Translace STEP je během mGluR-LTD zvýšená a mRNA STEP se váže na FMRP . Genetické snížení STEP koriguje behaviorální fenotypy u myši Fmr1 KO; není však známo, zda jsou ovlivněny odpovídající fenotypy LTD . Mezi další kandidátní proteiny patří APP , OPHN1 , CaMKIIα , PSD-95 a PI3K .

Proteiny regulující práh plasticity: Kv4.2

Nedávný přehled pojednávající o úloze draslíkových kanálů u fragilního X poskytuje náhled na to, jak může FMRP regulovat excitabilitu . FMRP přímo reguluje translaci nejméně tří draslíkových kanálů: Kv4.2, Kv3.1b a Slack . Kontrola translace Kv4.2 ze strany FMRP může mít nepřímé důsledky na regulaci prahu pro indukci LTP a STD-LTP.

Kv4.2 je draslíkový kanál typu A, který reguluje dendritickou excitabilitu a rozsah zpětného šíření akčního potenciálu . Proudy typu A působí na tlumení dendritické excitability a zpětného šíření AP (obr. 2B). Bylo také prokázáno, že Kv4.2 moduluje sílu zpětného šíření a reguluje práh pro LTP a STD-LTP . V nepřítomnosti Kv4.2 jsou dendrity více excitabilní a dochází ke snížení prahu pro indukci LTP .

Myši s Fmr1 KO mají zvýšený práh pro indukci LTP a STD-LTP, jak bylo uvedeno dříve (obr. 2A) . Jednou z možných hypotéz tohoto jevu je, že FMRP inhibuje translaci Kv4.2 a myši Fmr1 KO mají nadměrně syntetizovaný protein Kv4.2 v dendritech. FMRP se skutečně přímo spojuje s mRNA Kv4.2 a negativně reguluje její translaci . Vysvětluje to však změněný práh LTP/STD-LTP u myší Fmr1 KO? Farmakologická inhibice Kv4.2 u myší Fmr1 KO skutečně napravuje nedostatečnou hipokampální LTP při slabých podnětech, zatímco LTP při silných podnětech zůstává nezměněna (obr. 2C). Toto zjištění naznačuje, že zvýšený práh LTP u myší Fmr1 KO může být vysvětlen zvýšenou translací draslíkového kanálu Kv4.2.

Zajímavé je, že jiná skupina nedávno prokázala, že za jejich podmínek FMRP pozitivně reguluje translaci Kv4.2 . Tato studie se nezabývala možnými důsledky snížení hladiny Kv4.2 u Fmr1 KO na synaptickou plasticitu. Dalo by se očekávat zvýšení dendritické excitability, které bylo již dříve zaznamenáno v jiných souvislostech , a snížení prahu LTP. Bude důležité určit přesné experimentální a in vivo podmínky, za kterých může dojít ke každému z těchto protichůdných vzorců regulace, ale je jasné, že regulace Kv4.2 FMRP v obou směrech by měla důležité důsledky pro plasticitu.

FMRP, synaptická plasticita a učení

Dlouhodobá synaptická potenciace a deprese byly dlouho považovány za potenciální nervové koreláty učení a paměti. Ve spojení s úlohou FMRP v synaptické plasticitě v mnoha oblastech mozku je FMRP důležitá také pro širokou škálu behaviorálních úkolů učení u myší. Myši s Fmr1 KO vykazují nedostatečnou amygdalární stopovou paměť strachu , mozečkové učení , inhibiční vyhýbavé učení a mají potíže s prefrontálním úkolem kognitivního učení . Drosophila mutanti postrádající FMRP mají také narušenou dlouhodobou paměť . Celkově jsou deficity učení a paměti u myší s Fmr1 KO pravděpodobným behaviorálním důsledkem abnormální synaptické plasticity.

.