Karl Landsteiner föddes i Wien den 14 juni 1868. Hans far, Leopold Landsteiner, doktor i juridik, var en välkänd journalist och tidningsutgivare, som dog när Karl var sex år gammal. Karl uppfostrades av sin mor, Fanny Hess, som han var så fäst vid att en dödsmask av henne hängde på hans vägg tills han dog. Efter att ha lämnat skolan studerade Landsteiner medicin vid Wiens universitet och tog examen 1891. Redan under studietiden hade han börjat bedriva biokemisk forskning och 1891 publicerade han en artikel om kostens inverkan på blodaskans sammansättning. För att få ytterligare kunskaper i kemi tillbringade han de följande fem åren i laboratorier hos Hantzsch i Zürich, Emil Fischer i Wurzburg och E. Bamberger i München.
När Landsteiner återvände till Wien återupptog han sina medicinska studier vid Wiens allmänna sjukhus. År 1896 blev han assistent under Max von Gruber vid hygieninstitutet i Wien. Redan vid denna tid var han intresserad av immunitetens mekanismer och antikropparnas natur. Från 1898 till 1908 var han assistent vid universitetets avdelning för patologisk anatomi i Wien, vars chef var professor A. Weichselbaum, som hade upptäckt den bakteriella orsaken till hjärnhinneinflammation och tillsammans med Fraenckel hade upptäckt pneumokocken. Här arbetade Landsteiner med morbid fysiologi snarare än morbid anatomi. I detta uppmuntrades han av Weichselbaum, trots kritiken från andra inom detta institut. År 1908 säkrade Weichselbaum hans utnämning till prosektor vid Wilhelminaspitalet i Wien, där han stannade till 1919. År 1911 blev han professor i patologisk anatomi vid Wiens universitet, men utan motsvarande lön.
Fram till år 1919, efter tjugo års arbete med patologisk anatomi, hade Landsteiner tillsammans med ett antal medarbetare publicerat många artiklar om sina upptäckter inom morbid anatomi och om immunologi. Han upptäckte nya fakta om syfilisens immunologi, kompletterade kunskapen om Wassermann-reaktionen och upptäckte de immunologiska faktorer som han benämnde haptener (det stod sedan klart att de aktiva substanserna i de extrakt av normala organ som användes i denna reaktion i själva verket var haptener). Han gjorde grundläggande bidrag till vår kunskap om paroxysmal hemoglobinuri.
Han visade också att orsaken till poliomyelit kunde överföras till apor genom att injicera i dem material som framställts genom att mala upp ryggmärgen från barn som hade dött av denna sjukdom, och eftersom han saknade apor i Wien för ytterligare experiment, begav han sig till Pasteur-institutet i Paris, där det fanns apor att tillgå. Hans arbete där, tillsammans med det som Flexner och Lewis utförde oberoende av varandra, lade grunden för vår kunskap om orsaken till och immunologin hos poliomyelit.
Landsteiner gjorde många bidrag till både patologisk anatomi, histologi och immunologi, som alla visade inte bara på hans noggranna noggrannhet i observation och beskrivning, utan också på hans biologiska förståelse. Men hans namn kommer utan tvekan alltid att hedras för hans upptäckt 1901 av, och hans enastående arbete med, blodgrupperna, för vilket han fick Nobelpriset i fysiologi eller medicin 1930.
År 1875 hade Landois rapporterat att när människan får transfusioner av andra djurs blod, klumpas och bryts dessa främmande blodkroppar ihop och sönder i människans blodkärl med frisättning av hemoglobin. 1901-1903 påpekade Landsteiner att en liknande reaktion kan inträffa när blodet från en mänsklig individ transfunderas, inte med blodet från ett annat djur, utan med blodet från en annan människa, och att detta kan vara orsaken till den chock, gulsot och hemoglobinuri som hade följt på vissa tidigare försök till blodtransfusioner.
Hans förslag fick dock liten uppmärksamhet tills han 1909 klassificerade människoblodet i de numera välkända A-, B-, AB- och O-grupperna och visade att transfusioner mellan individer i grupperna A eller B inte leder till att nya blodkroppar förstörs och att denna katastrof endast inträffar när en person transfunderas med blodet från en person som tillhör en annan grupp. Tidigare, 1901-1903, hade Landsteiner föreslagit att eftersom de egenskaper som bestämmer blodgrupperna är ärftliga, kan blodgrupperna användas för att avgöra fall av tveksamt faderskap. En stor del av det arbete som Landsteiner och hans elever senare utförde om blodgrupper och den immunologiska användningen av dem gjordes inte i Wien utan i New York. År 1919 var förhållandena i Wien sådana att laboratoriearbetet var mycket svårt, och eftersom Landsteiner inte såg någon framtid för Österrike, fick han utnämningen till prosektor vid ett litet romersk-katolskt sjukhus i Haag. Här publicerade han 1919-1922 tolv artiklar om nya haptener som han hade upptäckt, om konjugat med proteiner som kunde framkalla anafylaxi och om relaterade problem, samt om den serologiska specificiteten hos hemoglobiner från olika djurarter. Hans arbete i Holland upphörde när han erbjöds en tjänst vid Rockefeller Institute for Medical Research i New York och han flyttade dit tillsammans med sin familj. Det var här som han i samarbete med Levine och Wiener utförde det fortsatta arbetet med blodgrupperna som kraftigt utökade antalet av dessa grupper, och här i samarbete med Wiener studerade han blödningar hos nyfödda, vilket ledde till upptäckten av Rh-faktorn i blodet, som relaterar människoblodet till rhesusapans blod.
Fram till slutet av sitt liv fortsatte Landsteiner att undersöka blodgrupperna och kemin hos antigener, antikroppar och andra immunologiska faktorer som förekommer i blodet. Det var en av hans stora förtjänster att han införde kemin i serologins tjänst.
Rigoröst krävande i de krav han ställde på sig själv, besatt Landsteiner en outtröttlig energi. Under hela sitt liv gjorde han alltid observationer på många andra områden än de där hans huvudsakliga arbete utfördes (han var till exempel ansvarig för att ha infört mörkfältsbelysning i studiet av spirochaeter). Av naturen något pessimistisk föredrog han att leva långt från människor.
Landsteiner gifte sig 1916 med Helen Wlasto. Dr. E. Landsteiner har en son i detta äktenskap.
1939 blev han professor emeritus vid Rockefeller Institute, men fortsatte att arbeta lika energiskt som tidigare och höll sig ivrigt i kontakt med vetenskapens framsteg. Det är karakteristiskt för honom att han dog pipett i handen. Den 24 juni 1943 fick han en hjärtattack i sitt laboratorium och dog två dagar senare på sjukhuset vid det institut där han hade utfört ett så framstående arbete.