Karl Landsteiner wurde am 14. Juni 1868 in Wien geboren. Sein Vater, der promovierte Jurist Leopold Landsteiner, war ein bekannter Journalist und Zeitungsverleger, der starb, als Karl sechs Jahre alt war. Karl wurde von seiner Mutter Fanny Hess erzogen, der er so sehr zugetan war, dass eine Totenmaske von ihr bis zu seinem Tod an seiner Wand hing. Nach dem Schulabschluss studierte Landsteiner Medizin an der Universität Wien und schloss 1891 ab. Schon während seines Studiums begann er mit biochemischen Forschungen und veröffentlichte 1891 eine Arbeit über den Einfluss der Ernährung auf die Zusammensetzung der Blutasche. Um weitere chemische Kenntnisse zu erwerben, verbrachte er die nächsten fünf Jahre in den Laboratorien von Hantzsch in Zürich, Emil Fischer in Würzburg und E. Bamberger in München.

Nach seiner Rückkehr nach Wien nahm Landsteiner sein Medizinstudium am Wiener Allgemeinen Krankenhaus wieder auf. 1896 wurde er Assistent bei Max von Gruber am Hygiene-Institut in Wien. Schon zu dieser Zeit interessierte er sich für die Mechanismen der Immunität und die Natur der Antikörper. Von 1898 bis 1908 war er Assistent an der Pathologisch-anatomischen Universitätsklinik in Wien, deren Leiter Professor A. Weichselbaum war, der die bakterielle Ursache der Hirnhautentzündung und mit Fraenckel die Pneumokokken entdeckt hatte. Hier arbeitete Landsteiner eher an der morbiden Physiologie als an der morbiden Anatomie. Dabei wurde er von Weichselbaum unterstützt, trotz der Kritik von anderen in diesem Institut. Im Jahr 1908 sicherte Weichselbaum seine Ernennung zum Prosektor im Wilhelminaspital in Wien, wo er bis 1919 blieb. 1911 wurde er Professor für pathologische Anatomie an der Universität Wien, allerdings ohne entsprechendes Gehalt.

Bis zum Jahr 1919, nach zwanzig Jahren Arbeit an der pathologischen Anatomie, hatte Landsteiner mit einer Reihe von Mitarbeitern viele Arbeiten über seine Erkenntnisse in der morbiden Anatomie und zur Immunologie veröffentlicht. Er entdeckte neue Tatsachen über die Immunologie der Syphilis, erweiterte die Kenntnisse über die Wassermann-Reaktion und entdeckte die immunologischen Faktoren, die er Haptene nannte (es wurde dann klar, dass die Wirkstoffe in den Extrakten normaler Organe, die für diese Reaktion verwendet wurden, tatsächlich Haptene waren). Er leistete einen grundlegenden Beitrag zur Kenntnis der paroxysmalen Hämoglobinurie.

Er wies auch nach, dass die Ursache der Poliomyelitis auf Affen übertragen werden kann, indem er ihnen Material injizierte, das durch Zerkleinern der Rückenmarkshäute von Kindern, die an dieser Krankheit gestorben waren, hergestellt worden war, und da in Wien keine Affen für weitere Experimente zur Verfügung standen, ging er zum Institut Pasteur in Paris, wo Affen verfügbar waren. Seine dortigen Arbeiten, zusammen mit den von Flexner und Lewis unabhängig voneinander durchgeführten, legten den Grundstein für unser Wissen über die Ursache und die Immunologie der Poliomyelitis.

Landsteiner leistete zahlreiche Beiträge sowohl zur pathologischen Anatomie, Histologie als auch zur Immunologie, die alle nicht nur seine akribische Sorgfalt bei der Beobachtung und Beschreibung, sondern auch sein biologisches Verständnis zeigten. Aber sein Name wird zweifellos immer für seine Entdeckung und seine herausragenden Arbeiten über die Blutgruppen geehrt werden, für die er 1930 den Nobelpreis für Physiologie oder Medizin erhielt.

1875 hatte Landois berichtet, dass, wenn der Mensch Transfusionen von Blut anderer Tiere erhält, diese fremden Blutkörperchen in den Blutgefäßen des Menschen unter Freisetzung von Hämoglobin verklumpen und zerfallen. 1901-1903 wies Landsteiner darauf hin, dass eine ähnliche Reaktion auftreten kann, wenn das Blut eines menschlichen Individuums nicht mit dem Blut eines anderen Tieres, sondern mit dem eines anderen Menschen transfundiert wird, und dass dies die Ursache für Schock, Gelbsucht und Hämoglobinurie sein könnte, die nach einigen früheren Bluttransfusionsversuchen aufgetreten waren.

Seine Vorschläge fanden jedoch wenig Beachtung, bis er 1909 das menschliche Blut in die heute bekannten Gruppen A, B, AB und O einteilte und zeigte, dass Transfusionen zwischen Personen der Gruppen A oder B nicht zur Zerstörung neuer Blutzellen führen und dass diese Katastrophe nur eintritt, wenn eine Person mit dem Blut einer Person transfundiert wird, die einer anderen Gruppe angehört. Zuvor, in den Jahren 1901-1903, hatte Landsteiner vorgeschlagen, dass die Blutgruppen zur Feststellung von Zweifeln an der Vaterschaft herangezogen werden können, da die Merkmale, die die Blutgruppen bestimmen, vererbt werden. Ein Großteil der Arbeiten, die Landsteiner und seine Schüler in der Folge über Blutgruppen und deren immunologische Verwendung durchführten, wurde nicht in Wien, sondern in New York durchgeführt. Denn 1919 waren die Bedingungen in Wien so, dass die Laborarbeit sehr schwierig war, und da Landsteiner keine Zukunft für Österreich sah, erhielt er die Ernennung zum Prosektor an einem kleinen römisch-katholischen Krankenhaus in Den Haag. Hier veröffentlichte er von 1919 bis 1922 zwölf Arbeiten über von ihm entdeckte neue Haptene, über Konjugate mit Proteinen, die Anaphylaxie auslösen können, und über damit zusammenhängende Probleme, sowie über die serologische Spezifität der Hämoglobine verschiedener Tierarten. Seine Arbeit in Holland endete, als ihm eine Stelle am Rockefeller Institute for Medical Research in New York angeboten wurde und er mit seiner Familie dorthin zog. Hier führte er in Zusammenarbeit mit Levine und Wiener weitere Arbeiten über die Blutgruppen durch, die die Zahl dieser Gruppen erheblich erweiterten, und hier untersuchte er in Zusammenarbeit mit Wiener Blutungen bei Neugeborenen, was zur Entdeckung des Rhesusfaktors im Blut führte, der das menschliche Blut mit dem Blut des Rhesusaffen in Beziehung setzt.

Bis zu seinem Lebensende fuhr Landsteiner fort, Blutgruppen und die Chemie von Antigenen, Antikörpern und anderen immunologischen Faktoren, die im Blut vorkommen, zu untersuchen. Es war eines seiner großen Verdienste, dass er die Chemie in den Dienst der Serologie stellte.

Streng in den Anforderungen, die er an sich selbst stellte, besaß Landsteiner unermüdliche Energie. Sein ganzes Leben lang machte er immer wieder Beobachtungen auf vielen anderen Gebieten als denen, auf denen seine Hauptarbeit geleistet wurde (er war z.B. dafür verantwortlich, dass die Dunkelfeldbeleuchtung in die Untersuchung von Spirochaeten eingeführt wurde). Von Natur aus etwas pessimistisch, zog er es vor, abseits der Menschen zu leben.

Landsteiner heiratete Helen Wlasto im Jahr 1916. Dr. E. Landsteiner ist ein Sohn aus dieser Ehe.

1939 wurde er als Professor am Rockefeller Institute emeritiert, arbeitete aber weiterhin so energisch wie zuvor und hielt eifrig Kontakt mit dem Fortschritt der Wissenschaft. Es ist bezeichnend für ihn, dass er mit einer Pipette in der Hand starb. Am 24. Juni 1943 erlitt er in seinem Labor einen Herzinfarkt und starb zwei Tage später im Krankenhaus des Instituts, in dem er so hervorragende Arbeit geleistet hatte.