PARADIGMAS DEL PAPEL DE LAS INTERACCIONES CD40-CD40L EN LA ENFERMEDAD

Transplante. La cirugía de trasplante no habría alcanzado el grado de éxito observado en las últimas décadas sin el desarrollo de agentes inmunosupresores eficaces que minimizan el riesgo de rechazo del trasplante. El anticuerpo monoclonal (MAb) contra el CD40L se ha utilizado como tratamiento inmunosupresor en muchos modelos de trasplante animal. En primates, la administración de MAb anti-CD40L retrasa el rechazo del aloinjerto, mientras que la combinación con CTLA4Ig, una proteína quimérica formada por el dominio extracelular de la molécula de superficie celular CTLA-4 y la región Fc de la IgG1 humana que bloquea la vía CD28-B7, tiene efectos aditivos y sinérgicos. Este tratamiento combinado mantiene la supervivencia del aloinjerto renal en primates y aumenta la supervivencia del injerto cutáneo en ratones (53, 69). El cambio al tratamiento con MAb anti-CD40L, tras 60 días de inmunosupresión convencional con CsA, fue un tratamiento eficaz en un modelo de aloinjerto renal con monos, a pesar de que se sabe que la CsA regula a la baja la expresión de CD40L en las células T (7). Se ha demostrado que la expresión del gen CD40L se multiplica por cuatro en los casos de rechazo agudo. Esto podría servir como método no invasivo para monitorizar la función del aloinjerto y también para determinar la respuesta biológica a los agentes inmunosupresores clásicos como la CsA y el tacrolimus, ambos conocidos por inhibir la inducción de CD40L (54). En modelos de trasplante animal, los inhibidores de la calcineurina suprimen la expresión de CD40L en las células T in vitro pero no en el tejido linfoide, lo que indica que la vía CD40-CD40L sigue siendo funcional durante el tratamiento con estos agentes, lo que puede contribuir al rechazo del aloinjerto en el ámbito clínico (63).

Aterosclerosis. La visión actual de la aterosclerosis, la enfermedad mortal más prevalente en el mundo occidental, es la de una enfermedad crónica, degenerativa e inflamatoria en la que se cree que el sistema inmunitario desempeña un papel importante. El CD40 y el CD40L se sobreexpresan en las lesiones ateroscleróticas experimentales y humanas. La ligadura de CD40 en tipos de células asociadas al ateroma, como las células endoteliales, las células musculares lisas y los macrófagos, conduce a un aumento de la expresión de mediadores para el desarrollo de la aterosclerosis, como citoquinas, quimiocinas, factores de crecimiento y metaloproteinasas. El bloqueo de las interacciones CD40-CD40L con MAb anti-CD40L en ratones da lugar a una disminución de la formación y la progresión del ateroma en ratones, pero también fomenta esos cambios en la biología y la estructura de la lesión, que pueden ser importantes en la estabilización de la placa en la enfermedad humana (52).

Las plaquetas también expresan CD40L y se cree que contribuyen significativamente al reclutamiento de células inflamatorias al endotelio dañado in vivo (5). Las células T activadas que expresan CD40L se localizan dentro de la pared de los vasos ateroscleróticos, un hecho que apoya la hipótesis de que las células T CD4+ activadas pueden orquestar el proceso aterosclerótico (43).

En la Tabla 1 se describen brevemente otras enfermedades en las que el par CD40-CD40L puede desempeñar un papel. A continuación se analiza brevemente el papel de esta interacción en las enfermedades autoinmunes lupus eritematoso sistémico (LES), artritis reumatoide (AR) y polimiositis.

SLE. (i) Expresión de CD40L en el LES humano (Tabla 2). Desai-Mehta et al. han informado de que las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de pacientes con lupus activo presentan un aumento de 21 veces en el porcentaje de células CD40L+ CD4+ en comparación con los sujetos sanos. Tras la estimulación de las PBMC con MAb anti-CD3, el porcentaje de células CD40L+ CD4+ se multiplicó por cinco en los sujetos sanos, pero sólo por 1,4 en los pacientes con LES activo. Sin embargo, el porcentaje de células T CD40L+ siguió siendo mayor en el grupo con LES activo. Las PBMC de pacientes con LES en remisión se comportaron de forma similar a las del grupo de control. Se hicieron observaciones similares en cuanto a la expresión de CD40L por parte de las células T CD8+ recién aisladas de pacientes con LES activo (expresión 22 veces mayor que la del grupo de control). Las células B sobreexpresan CD40L en pacientes con LES activo a niveles comparables a los observados en las células T activadas. Los linfocitos B humanos normales expresan niveles muy bajos de CD40L y sólo cuando son manipulados, en contraste con los linfocitos B del LES activo que expresan CD40L espontáneamente (12).

En un estudio publicado por Koshy et al., las PBMC activadas de sujetos sanos o de pacientes de control de la enfermedad mostraron una expresión de alta intensidad de CD40L con una disminución gradual hasta valores cercanos a los de la línea de base a las 48 h, mientras que las PBMC de lupus continuaron demostrando niveles significativamente más altos de CD40L en este punto temporal. En este estudio no se encontró ninguna correlación aparente de la expresión de CD40L con la actividad de la enfermedad (33).

Higuchi et al. confirmaron estos resultados tanto en el LES como en el lupus murino, sugiriendo que la expresión ectópica de CD40L en las células B del lupus puede desempeñar un papel crucial en el desarrollo del LES. Los ratones transgénicos propensos al lupus, que expresan CD40L en las células B, producen espontáneamente autoanticuerpos y, además, la mitad de estos ratones desarrollan glomerulonefritis con depósito de inmunocomplejos (22). Devi et al. también han confirmado la elevada expresión de CD40L en las células T y B del lupus. Más concretamente, el 45% de las células T de pacientes con LES expresan CD40L, en comparación con sólo el 8-18% de las células T de sujetos sanos o de pacientes con AR. Además, el 30% de los 48 pacientes con LES examinados tenían también una mayor expresión de CD40L en las células B (13). Sin embargo, en contraste con los resultados anteriores, hay un informe en el que no se encontraron cambios en la expresión de CD40L en los linfocitos del lupus. En cambio, estos autores informaron de una elevada expresión de CD86 en los linfocitos B del LES, que también es una importante molécula costimuladora (3). Otro estudio ha informado de que los monocitos de pacientes con LES activo expresan CD40L de forma aberrante. Se estudiaron 23 pacientes con LES activo y se compararon con 16 individuos sanos. Los resultados mostraron un aumento de siete veces en la frecuencia de monocitos periféricos que expresan CD40L de pacientes con LES en comparación con sujetos sanos. La expresión de CD40L se verificó tanto a nivel de ARNm como de proteínas y se correlacionó significativamente con la actividad de la enfermedad (28).

CD40L se escinde de la superficie celular de los linfocitos T activados, mediante una metaloproteinasa de la matriz, liberando sCD40L, una molécula de aproximadamente 18 a 20 kDa, que forma homotrímeros. Un informe que estudia el papel funcional de sCD40L concluyó que sCD40L puede inducir la activación y diferenciación de las células B. Los niveles de sCD40L en plasma eran significativamente más altos en pacientes con LES activo que en donantes sanos. Estos niveles se correlacionaron con la actividad de la enfermedad, evaluada por el SLEDAI, y con los títulos de autoanticuerpos circulantes contra el ADN de doble cadena (ADNd). Se ha planteado la hipótesis de que los altos niveles de sCD40L encontrados en pacientes con LES activo pueden desempeñar un papel patogénico en la vasculitis y en la nefritis que se produce en el lupus activo. Los autores propusieron que los niveles de sCD40L podrían servir en el futuro como marcador predictivo de los brotes de la enfermedad del LES (27). Vakkalanka et al. también mostraron concentraciones medias de sCD40L significativamente más altas en los pacientes con lupus que en los controles de la enfermedad y en los sujetos sanos. Más concretamente, se estudiaron 66 pacientes con LES y se compararon con 30 pacientes de control de la enfermedad y 23 individuos sanos. En los sujetos sanos, el sCD40L era casi indetectable, mientras que 38 pacientes con LES tenían un nivel de sCD40L superior a 2 ng/ml (con una concentración media de 2,61 ± 2,15 ng/ml) y sólo 7 pacientes de control de la enfermedad tenían un nivel de sCD40l superior a 1 ng/ml. Los pacientes se dividieron en tres grupos, graves, moderados y leves, según las manifestaciones clínicas. Los pacientes con LES grave tenían una concentración media de sCD40L de 3,93 ± 2,86 ng/ml, aquellos con LES moderado tenían una concentración media de sCD40L de 2,81 ± 1,57 ng/ml y, por último, aquellos con enfermedad leve tenían una concentración media de sCD40L de 1,52 ± 1.06 ng/ml, lo que indica una correlación entre el nivel de sCD40L y la actividad de la enfermedad (62).

Aunque la inducción de CD40L en las células T normales activadas se inhibe en presencia de CsA, es interesante que este efecto no se aplique a las células T del LES. Un estudio sobre la expresión de CD40L en el lupus humano concluyó que la CsA no pudo inhibir la expresión prolongada y aumentada de CD40L, observada in vitro en las células T de lupus activadas con MAb anti-CD3. La resistencia a la CsA era independiente de la actividad de la enfermedad. Los monocitos circulantes del lupus también muestran una importante resistencia a los efectos inhibidores de la CsA sobre la expresión de CD40L. Estos resultados indican que la inducción de CD40L en las células T del LES puede estar regulada por una vía independiente del calcio/calcineurina (29).

No está claro por qué la expresión de CD40L es mayor en los pacientes con LES y si esta sobreexpresión tiene implicaciones patogénicas. Se ha propuesto que los linfocitos T del LES, cuando se activan por el compromiso del TCR, favorecen un perfil dominante de NFAT en lugar de un perfil equilibrado de factores de transcripción NFAT-AP-1. Este panel de mediadores intracelulares promueve la transcripción y la estabilidad del ARNm de ciertos genes, incluido el gen CD40L. La expresión temprana de CD40L en las células T del LES requiere la vía NFAT sensible a la CsA, pero la expresión prolongada depende más de una quinasa MAP específica, es decir, la quinasa regulada por la señal extracelular. El aumento y la persistencia de la actividad de la quinasa regulada por la señal extracelular en las células T lúpicas podría contribuir a la sobreexpresión de CD40L mediante la activación del factor de transcripción AP-1 y posiblemente mediante la estabilización del ARNm de CD40L (10, 68). Los flujos citoplasmáticos de Ca2+ son supranormales en las células T y B circulantes de pacientes con LES, y se ha propuesto que esta anormalidad puede representar el trasfondo molecular de la expresión anormal de CD40L en el lupus (38, 40, 64). También hay pruebas de que la deficiencia de la cadena ζ del TCR, que se ha descrito en pacientes con LES, puede ser en parte responsable de la respuesta supranormal de Ca2+ mencionada anteriormente (39, 61). Esta correlación se ha visto reforzada por el reciente informe de que la corrección transfeccional de la deficiencia de la cadena TCR ζ en las células T lúpicas conduce a la normalización de los flujos de Ca2+ citoplásmicos (48).

(ii) Uso de MAb anti-CD40L en modelos de lupus y en el LES. Las múltiples funciones de CD40/CD40L en la respuesta inmunitaria lo han convertido en una atractiva diana para la intervención terapéutica en las enfermedades autoinmunes. Los MAbs contra CD40L se probaron inicialmente en modelos murinos de lupus. El tratamiento de ratones New Zealand Black × New Zealand White (NZB×NZW) F1 con infusiones continuas de MAb anti-CD40L produjo un retraso en la aparición de la enfermedad durante una media de 4 meses, una disminución de los niveles de autoanticuerpos IgG anti-dsDNA, un retraso en la acumulación de células T con fenotipo de memoria activado, una disminución del número de células B en el bazo y una supresión del cambio de clase de Ig y de las mutaciones somáticas. Los niveles séricos de anticuerpos IgG anti-dsDNA fueron de 4 a 10 veces inferiores a los de los controles no tratados de la misma edad. Tras el cese del tratamiento, el fenotipo de las células T de los ratones tratados se volvió indistinguible del de los controles y las células B alcanzaron un fenotipo totalmente activado con elevación de los títulos de IgG anti-dsDNA y desarrollo de proteinuria y enfermedad renal progresiva (65).

Otro estudio empleó un tratamiento combinado con anticuerpos anti-CD40L y CTLA4Ig. El tratamiento combinado a corto plazo de ratones prenefríticos NZB×NZW F1 dio lugar a un retraso en la aparición de la disfunción renal durante aproximadamente 6 meses. Tras la aparición de la proteinuria, la repetición del tratamiento fue capaz de inducir la remisión en los ratones previamente tratados, pero no en los no tratados. Hubo una disminución en el nivel de autoanticuerpos IgG anti-dsDNA, y los bazos murinos estaban marcadamente agotados de células B, incluso 16 a 20 semanas después de la infusión. Se ha postulado que el tratamiento con CTLA4Ig y MAb anti-CD40L puede actuar de forma sinérgica para bloquear las señales antiapoptóticas y, por tanto, facilitar la apoptosis de las células B durante la activación temprana de las células B. Este tratamiento no causó una inmunosupresión global a largo plazo (66).

Los prometedores resultados obtenidos en estudios experimentales con animales no se confirmaron en el LES. En el lupus humano, la ciclofosfamida sigue siendo el «patrón de oro» para el tratamiento de la afectación de órganos importantes. La ciclofosfamida es un agente alquilante que provoca una inhibición inespecífica de la respuesta inmunitaria y una inmunosupresión clínicamente significativa. Tiene importantes efectos secundarios, como el cáncer de vejiga y la insuficiencia gonadal, por lo que es necesario buscar nuevas intervenciones terapéuticas. La administración de ciclofosfamida ha sido un tratamiento establecido para la nefritis lúpica, una complicación común y temible del LES y una de las principales causas de morbilidad y mortalidad.

Se han publicado dos estudios de administración de MAb anti-CD40L en lupus humano. En el primero, un estudio de fase 2, doble ciego, controlado con placebo y multicéntrico, se inscribieron 85 pacientes con LES de leve a moderadamente activo y recibieron 6 inyecciones de IDEC-1 (MAb anti-CD40L) o placebo en el transcurso de 16 semanas. La eficacia se evaluó en la semana 20, principalmente mediante el uso del SLEDAI. Los resultados mostraron que el tratamiento con IDEC-1 fue seguro y bien tolerado, pero no pudo demostrar la eficacia en comparación con el placebo (19, 26).

El segundo ensayo evaluó a pacientes con nefritis lúpica proliferativa probada por biopsia mediante el uso de BG9588 (MAb anti-CD40L). Se inscribieron 28 pacientes con nefritis lúpica proliferativa activa que recibieron 20 mg de BG9588/kg de peso corporal a intervalos quincenales durante las tres primeras dosis y a intervalos mensuales durante cuatro dosis adicionales. Los resultados mostraron una reducción del 50% de la proteinuria (cuando estaba presente) sin empeoramiento de la función renal, la desaparición de la hematuria y un aumento de la concentración sérica de C3. Los títulos de autoanticuerpos anti-ADNds disminuyeron después de la terapia, con reducciones medias de 38,8, 50,1 y 25,3% a los 1, 2 y 3 meses después del tratamiento, respectivamente (4). Este estudio se interrumpió prematuramente debido a complicaciones tromboembólicas. Más concretamente, se notificaron dos casos de infarto de miocardio. Los efectos trombóticos que complicaron este régimen de tratamiento plantearon cuestiones importantes en relación con futuros estudios con seres humanos. Cabe señalar que ninguno de los pacientes que sufrieron un evento trombótico tenía anticuerpos antifosfolípidos demostrables. El papel de la interacción CD40-CD40L en estas complicaciones trombóticas sigue siendo poco claro e hipotético.

Un estudio de 5 pacientes con nefritis lúpica que recibieron terapia anti-CD40L mostró que un curso corto de este tratamiento conduce a una reducción del número de células B productoras de anticuerpos IgG anti-DNA. Estos cambios persistieron durante varios meses tras el cese del tratamiento (25). Un estudio similar de cuatro pacientes con nefritis lúpica activa que recibieron tratamiento con anti-CD40L (BG9588) mostró que las células B que expresaban CD38, CD5 y CD27, que se consideran marcadores de diferenciación de las células B, desaparecieron de la periferia durante el tratamiento con anti-CD40L. Estos cambios se asociaron a una disminución de los niveles de anticuerpos antidsDNA, de la proteinuria y del índice de actividad de la enfermedad del LES (20).

RA. (i) Expresión de CD40L en la AR (Tabla 2). La AR es una enfermedad reumática sistémica autoinmune común caracterizada por un proceso destructivo tisular crónico atribuido a una posible respuesta inmunitaria continua impulsada por antígenos. Como se cree que las células T activadas desempeñan un papel clave, no es sorprendente que se hayan estudiado las interacciones CD40-CD40L en el contexto de la AR.

Berner et al. estudiaron la expresión de CD40L en células T de pacientes con AR. Se estudiaron 62 pacientes con AR y 20 sujetos sanos. CD40L se expresaba fuertemente en el >10% de las células T en el 29% de los pacientes con AR, pero en el 0% de las células T en los controles sanos. Los pacientes con AR con >10% de células T CD4+ CD40L+ tenían una enfermedad más activa. El 83% de los pacientes de este grupo presentaban un aumento de los niveles de proteína C reactiva, el 89% eran positivos al factor reumatoide (FR) y ninguno de ellos cumplía los criterios del Colegio Americano de Reumatología para la remisión clínica completa, lo que sugiere una fuerte correlación entre la actividad de la enfermedad y la expresión de CD40L (2). La expresión de CD40L en niveles elevados puede reflejar una activación aumentada y prolongada de los linfocitos que da lugar a una actividad inflamatoria mayor y prolongada. La expresión de CD40L funcional en niveles elevados en células T de pacientes con AR también fue demostrada por MacDonald et al. (42).

Otro estudio abordó el papel de la señalización CD40-CD40L en la producción de FR. En el sistema inmunitario sano, se eliminan las células B autoreactivas de alta afinidad. En los individuos sanos, existen células B productoras de FR de baja afinidad en los ganglios linfáticos, pero el FR de alta afinidad es indetectable. En la AR, las células B productoras de FR de alta afinidad se acumulan en la sinovia inflamada. Los resultados de este estudio indican que la interacción entre el CD40L de los linfocitos T activados y el CD40 de los linfocitos B productores de FR es crucial, no sólo para la supervivencia de estos linfocitos B autorreactivos, sino también para la síntesis de FR. Se descubrió que las dos señales necesarias y suficientes para la inducción de la síntesis de FR de alta afinidad in vivo eran la IgG y la interacción CD40-CD40L. En ausencia de la interacción CD40-CD40L, las células B de RF se eliminaron (35).

Cho et al. estudiaron el papel de la interacción CD40-CD40L en la producción del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF). En la AR, la sinovia inflamada tiene características de tumor. La perpetuación y la expansión del pannus reumatoide dependen de la neovascularización, ya que la extensa migración de células mononucleares a la sinovia y el sobrecrecimiento del pannus dependen de la existencia de un lecho vascular rico. El VEGF, una glicoproteína dimérica que se une a la heparina, es un mediador central de la angiogénesis e induce la proliferación de las células endoteliales y la permeabilidad capilar. Se ha demostrado que la ligadura del CD40 en los fibroblastos sinoviales por el CD40L en las células T activadas da lugar a un aumento de la producción de VEGF, que se incrementa aún más en presencia de IL-1, TNF-α y factor de crecimiento transformante β (8). La ligadura del CD40 en los sinoviocitos de la AR por el CD40L en las células T activadas dentro de la sinovia aumenta significativamente la producción de TNF-α de forma dependiente de la dosis (21). El TNF-α es una citocina clave en la patogénesis de la AR. Además del TNF-α, la producción de IL-10 también aumenta a través de las interacciones CD40-CD40L (15). Las células T del líquido sinovial de pacientes con AR expresan niveles elevados de CD40L en comparación con las células T de la sangre periférica de donantes sanos, y tras la activación in vitro, muestran una expresión prolongada y de alto nivel de CD40L. Los resultados mostraron que el 8,71% de las células T del líquido sinovial de los pacientes con AR eran CD40L+ frente al 1,74% del grupo de control (41). El papel potencial de la interacción CD40-CD40L en la patogénesis de la AR condujo a los esfuerzos de manipulación farmacológica de este eje como enfoque terapéutico en pacientes con AR.

(ii) Uso de MAb anti-CD40L en modelos animales de AR. El tratamiento con MAb anti-CD40L suprime el desarrollo de la artritis inducida por colágeno, que es un modelo animal de AR. Más concretamente, se bloqueó el desarrollo de la inflamación articular y se disminuyó la infiltración de células inflamatorias en el tejido subsinovial y la erosión del cartílago (14). En ratones transgénicos K/B×N, un modelo de artritis mediada por Ig, el tratamiento con MAb anti-CD40L disminuyó significativamente el desarrollo de la artritis cuando se administró una semana antes del inicio de la enfermedad clínicamente aparente, pero el tratamiento no tuvo éxito cuando se administró en la enfermedad establecida (36).

Dermatomiositis/polimiositis. En un estudio en el que se analizaron 9 pacientes con polimiositis y dermatomiositis, se observó que las células T que infiltran el músculo eran CD40L+ en los 9 casos, lo que sugiere un posible papel de las interacciones CD40-CD40L en las entidades clínicas mencionadas (58).