Föreläsning av Elizabeth Burke

Torsdag 9 augusti 2016

Vetenskapsmän använder en mängd olika laboratorietekniker för att undersöka den genetiska orsaken till mänskliga sjukdomar. I forskningen används ofta patienters celler eller vävnadsprover, men för att avgöra om en mutation i en specifik gen kan orsaka en patients symtom behöver vi ofta experimentella djurmodeller.

Men medan möss och råttor tidigare har varit vanliga val för att modellera mänskliga sjukdomar, ökar användningen av zebrafiskar snabbt i popularitet. Förvånar detta dig? Låt mig förklara.

Vad är zebrafiskar?

Zebrafiskar är tropiska sötvattenfiskar i familjen älgört. I naturen finns de i floder och dammar i Indien, men nu finns de ofta i djuraffärer. Namnet ”zebrafisk” kommer från de horisontella blå ränderna på varje sida av deras kroppar.

Zebrafiskar, som fått sitt namn på grund av sina ränder, föredrar att leva i stora grupper som kallas för stim.

Hur kan man modellera en mänsklig sjukdom i fiskar?

Och även om vi människor kan tyckas vara extremt annorlunda än zebrafiskar, så är vi faktiskt mycket mer lika dem än vad du kanske tror. Faktum är att 70 procent av de mänskliga generna finns i zebrafiskar.

För övrigt har zebrafiskar två ögon, en mun, hjärna, ryggmärg, tarm, bukspottkörtel, lever, gallgångar, njurar, matstrupe, hjärta, öra, näsa, muskler, blod, ben, brosk och tänder. Många av de gener och kritiska vägar som krävs för att utveckla dessa egenskaper är i hög grad bevarade mellan människor och zebrafiskar. Därför kan alla typer av sjukdomar som orsakar förändringar i dessa kroppsdelar hos människor teoretiskt sett modelleras i zebrafiskar.

Varför använda zebrafiskar när man kan använda möss?

Men även om möss evolutionärt sett liknar människan mer eftersom de är däggdjur har zebrafiskar flera fördelar jämfört med sina lurviga konkurrenter.

En viktig fördel med zebrafiskar är att de vuxna djuren är små och föredrar att hållas i stora grupper, eller ”stim”. Därför kräver de mycket mindre utrymme och är billigare att underhålla än möss.

The NIH Zebrafish Core inhyser hundratusentals zebrafiskar i en toppmodern anläggning.

En annan fördel är att vuxna zebrafiskar förökar sig lätt (ungefär var tionde dag) och kan producera så många som 50 till 300 ägg åt gången. Detta skiljer sig helt från möss som i allmänhet producerar kullar med en till tio ungar och bara kan föda ungefär tre kullar under sin livstid. Vetenskapliga experiment upprepas i allmänhet flera gånger för att bevisa att resultaten är korrekta, så det är bra att ha ett djur som kan producera ett stort antal avkommor om och om igen.

Zebrafiskembryon läggs och befruktas också externt, vilket gör att de lätt kan manipuleras på en mängd olika sätt. In vitro-befruktning kan utföras vid behov. De befruktade äggen i ett cellstadium kan lätt injiceras med DNA eller RNA för att permanent ändra deras genetiska sammansättning för att generera transgena eller knock-out zebrafisklinjer. Att arbeta med möss på detta sätt är mycket mer komplicerat. Musembryon utvecklas inuti modern, och för att komma åt och manipulera dem måste modern offras. För att hålla embryona vid liv efter befruktning eller injektion skulle de också behöva transplanteras till en annan mushona.

Zebrafisklarver, utvecklingsstadiet från tre till trettio dagar efter befruktning, växer i längd från cirka 3,5 till 8 millimeter.

För övrigt är zebrafiskembryon genomskinliga, vilket gör det möjligt för forskarna att se hur de befruktade äggen växer till färdigbildade fiskungar i ett mikroskop. Deras transparens gör det också möjligt att visualisera fluorescerande märkta vävnader i transgena zebrafiskembryon. Musembryon är inte genomskinliga och utvecklas inuti modern, så det är inte möjligt att observera levande embryoutveckling som i zebrafiskar.

Det finns dock en gräns för vilka typer av sjukdomar som kan studeras i zebrafiskar. Mänskliga sjukdomar som orsakas av gener som inte finns i zebrafiskar kräver en annan djurmodell. Dessutom är zebrafiskar inte användbara modeller för mänskliga sjukdomar som huvudsakligen äger rum i en vävnadstyp eller kroppsdel som zebrafiskar inte har (t.ex. prostata, bröstkörtlar, lungor).

Hur exakt använder man zebrafiskar för att undersöka mänskliga sjukdomar?

Ofta sekvenseras en patients DNA för att hitta en mutation i en gen som potentiellt skulle kunna orsaka sjukdomssymptomen hos honom eller henne. För att avgöra om funktionsförlust i den genen kan orsaka de symtom som ses hos patienten muteras eller ”slås ut” samma gen i zebrafiskar, och sedan undersöks fiskarna för att se om de har liknande symtom. Även om det är mycket svårare att göra kan den exakta mutationen som patienten har också föras in i zebrafiskar – detta kallas ”knock-in”.

Om ett eller flera av patientens symtom observeras i zebrafiskens knock-out- eller knock-in-modell kan zebrafiskarna användas för ytterligare studier för att hjälpa till att fastställa varför mutationen i den genen orsakar sjukdomen. Exempelvis kan muskelfibrernas struktur undersökas i mikroskop för att upptäcka avvikelser om patienten har en muskelsjukdom. Eller om patientens sjukdomssymptom började under utvecklingen i livmodern kan knock-out eller knock-in zebrafiskembryon undersökas för förändringar i genuttrycket (jämfört med embryon utan mutationen) som kan leda till onormal utveckling. För en patient med en neurologisk sjukdom kan neuronerna i knock-out-embryon märkas med fluorescens för att se om de bildas felaktigt.

Förutom att använda zebrafiskens sjukdomsmodeller för att karakterisera mänskliga sjukdomar kan forskarna också identifiera och testa nya läkemedel för att behandla de sjukdomar som modelleras. Zebrafiskens förmåga att generera många embryon varje gång de förökar sig gör dem särskilt användbara för högflödesscreening av läkemedel.

Vilka exempel på mänskliga sjukdomar som framgångsrikt har modellerats i zebrafiskar?

Generering av en knock-out av dystrofingenen i zebrafiskar har visat sig likna allvarlighetsgraden och utvecklingen av den mänskliga sjukdomen Duchennes muskeldystrofi. Patienter med Duchennes muskeldystrofi har visat sig bära på mutationer i dystrofin och uppvisar muskelsvaghet under barndomen som blir progressivt värre. Hos både människor och zebrafiskmodellen leder förlusten av dystrofin gradvis till nekrotiska muskelfibrer som ersätts av inflammatoriska celler, fibros och onormalt stora muskelfibrer.

Denna figur visar visuella skillnader i muskulaturen mellan zebrafisklarver av vildtyp (A, B, C) och distrofiska larver (A’, B’, C’). Källa: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3484855/

Mänskligt melanom har också framgångsrikt modellerats i zebrafiskar. Den vanligaste identifierade mutationen i mänskliga melanom – en förändring av en enda aminosyra i genen BRAF – skapades i zebrafiskar för att göra en knock-in-modell. Eftersom cancer orsakas av en kombination av flera genetiska förändringar användes denna knock-in zebrafisklinje för att screena andra potentiella cancerframkallande mutationer. När en annan vanligt förekommande melanommutation i genen SETDB1 lades till BRAF-knock-in zebrafisken utvecklades snabbt ett melanom. Dessa resultat bidrog till att fastställa att SETDB1 är en viktig gen för melanomtillväxt.

Dessa exempel på hur människor och zebrafiskar kan manifestera samma sjukdom trots hur olika vi ser ut gör att det är lätt att förstå varför zebrafiskar håller på att bli en väl accepterad djurmodell. Här i NIH:s program för odiagnostiserade sjukdomar utför vi studier med hjälp av zebrafiskar som ett av flera tillvägagångssätt för att undersöka den potentiella inblandningen av förändrade gener i våra patienters extremt sällsynta sjukdomar. Tidigare har möss varit den dominerande djurmodellen mellan bänk och säng, men nyligen genomförda studier har visat att zebrafiskar har potential att fungera som ett lätthanterligt alternativ till möss. Tidpunkten för antagandet av zebrafiskar som en ny modellorganism kunde inte vara bättre, eftersom studier på möss ofta inte går att överföra till människor. Även om inget djur kan modellera en mänsklig sjukdom på ett perfekt sätt, tror jag att dessa små randiga simmare har stor potential att främja medicinsk forskning i framtiden.

Om du vill veta mer om hur zebrafiskar bidrar till den biomedicinska vetenskapen och till människors hälsa kan du besöka webbsidorna för Trans-NIH Zebrafish Initiative website och NICHD Zebrafish Core.