DR. EDWIN B. ASTWOOD var en visionär inom den moderna endokrinologin. Roy Greeps och Monte Greers biografiska minnesanteckningar slutade: ”Utöver sina specifika forskningsbidrag lyckades dr Edwin B. Astwood i en utsträckning som få har uppnått genom att spänna över det breda området mellan naturvetenskap och klinisk medicin”. För mig är detta den högsta kallelsen inom endokrinologin.

Slutet av 1960-talet och början av 1970-talet präglades av de otroliga prestationerna av två grupper, doktorerna Andrew Schally och Roger Guillemin, som isolerade, karakteriserade och sekvenserade de hypotalamiska reglerande hormonerna. Det första hypotalamiska regleringshormonet som sekvenserades var TRH (en tripeptid), det andra var gonadotropinfrisättande hormon (en dekapeptid) och det tredje var somatostatin med 14 aminosyror. Förekomsten av GHRH hade föreslagits i början av 1960-talet genom några klassiska experiment av Reichlin (1); han gjorde lesioner i hypotalamus och visade att innehållet av GH i hypofysen minskade. Baserat på dessa data föreslog han att det måste finnas en GHRH i hypotalamus.

Jag gjorde min läkarutbildning i London, England, med min endokrinologiska utbildning under professor G. Michael Besser. En av de roligaste konferenser vi regelbundet deltog i var presentationen av kliniska fall vid Royal Society of Medicine. Det som etsade sig fast i mitt minne var det faktum att varje gång en patient med akromegali presenterades, frågade professor Peter Sonksen om patienten hade några tecken på en karcinoid tumör eller inte. Uppfattningen i publiken var ”Varför ställer den här mannen alltid den här frågan?” eftersom sådana fall förmodligen inte existerar eller, om så är fallet, mycket sällan!

År 1977 flyttade jag från St. Bartholomew’s Hospital (London, England) till University of Virginia. Mitt huvudintresse vid den tiden var PRL-sekretande hypofysetumörer och deras medicinska behandling.

I oktober 1980 hänvisades en 21-årig patient till mig av dr Ann Johanson. Denna patient hade amenorré och galaktorré samtidigt som hon tog ett oralt preventivmedel för gonadisk steroidersättning. Hon hade gonadal agenesi från Turners syndrom.

Hennes utvärdering visade en förstorad hypofysfossa på skallröntgen, en hypofysmassa med blygsam suprasellär utbredning på datortomografi och ett förhöjt serum-PRL på 68 μg/L. Hennes förhöjda serum GH på 95 μg/L minskade inte med oral glukos, ökade med TRH och minskade med en dopamininfusion. Hennes serumnivå av insulinliknande tillväxtfaktor (IGF)-I var förhöjd till 11 U/mL (normal, 0,41-2,2 U/mL).

Baserat på dessa resultat var diagnosen akromegali klar. Det är av intresse att patientens längd var 5’3″, vilket är mycket lång för en patient med Turners syndrom. I detta avseende var det tur att sera hade sparats från de föregående 7 åren. Hennes GH-koncentrationer i serum hade varit förhöjda under hela denna tidsperiod (tabell 1).

Patienten remitterades för transsfenoidal kirurgi, som genomfördes den 15 januari 1981. Sju veckor efter operationen visade det sig att hon fortfarande hade akromegali; serum GH var 52 μg/L och IGF-I var fortfarande förhöjt till 7,7 U/mL.

Som en del av ett pågående samarbete hade hypofysens patologiska prover skickats till dr Kalman Kovacs (St. Michael’s Hospital, Toronto, Kanada). Något senare ringde dr Kovacs för att ge mig resultaten av sin undersökning av vävnaden. Hans rapport visade att patienten hade somatotrof hyperplasi och inte en hypofysetumör. De skäl som ledde till denna diagnos var följande: 1) retikulinmönstret var bevarat (det förstörs i tumörer) (fig. 1), 2) somatotroferna dominerade, även om thyrotrofer, gonadotrofer och kortikotrofer var inblandade, och 3) elektronmikroskopi av somatotroferna avslöjade ett välutvecklat endoplasmatiskt retikulum och en välutvecklad Golgiapparat, vilket tyder på aktiv hormonsyntes (fig. 2). Eftersom somatotroferna var tätt packade med sekretoriska granuler föreslog detta för mig att detta avspeglade en hämning av hormonfrisättningen på grund av återkoppling av utsöndrat GH, förmodligen genom att öka somatostatinsekretionen (och/eller IGF-I).

Baserat på hypofysens histologi stod det klart att hypofysen stimulerades av en extrinsisk faktor. Det var osannolikt att detta berodde på en mutation i GHRH-receptorn eller en konstitutiv aktivering av det G-protein som är kopplat till GHRH-receptorn, eftersom detta sannolikt skulle inträffa i en enskild cell, vilket skulle leda till tumörutveckling och nedbrytning av retikulinmönstret. Därför var det mycket troligare att hypofysen stimulerades av en yttre faktor, antingen GHRH som kom från hypotalamus eller från periferin. För det andra gjorde den ihållande akromegali det absolut nödvändigt att hitta orsaken till denna patients akromegali. Vid denna tidpunkt rapporterades i en artikel av Frohman et al. (2) den partiella reningen och karakteriseringen av en peptid med GH-frisättande aktivitet från extrapituitära tumörer från akromegaliska patienter.

En datortomografisk undersökning av buken visade en tumör med en diameter på 5 cm i bukspottkörtelns svans. Den 26 augusti 1981 avlägsnades tumören. Den var väl inkapslad och vid histologin fastställdes det att det var en tumör med ö-celler. Tumören var dock varken en β- eller α-cellstumör. Den var starkt positiv för neuronspecifikt enolas och vid immunfärgning var den negativ för GH, insulin, glukagon, kalcitonin och ACTH, med tvetydig färgning för somatostatin.

Tumören innehöll inget GH vid immunocytokemi. Under de första 2 timmarna efter avlägsnandet av tumören skedde en snabb minskning av GH-nivåerna i serum från 70 μg/L till 3 μg/L (fig. 3) (3). Patienten har nu följts i 18 år och är fortfarande botad från sin akromegali.

Nästa fråga var vad man skulle göra med tumören i bukspottkörteln. På den tiden hade jag turen att ha framlidne dr Michael Cronin som kollega vid University of Virginia. Michael kom till operationssalen med mig för att hjälpa till att genomföra vår noggrant utarbetade strategi för att hantera tumören. Hälften av tumören styckades i tärningar och lades omedelbart i flytande kväve, och den andra hälften förbereddes för vävnadskultur. Den senare skickades till flera grupper som var experter på att etablera stabila cellinjer. Michael Cronin kunde visa att det medium som badade i denna tumör innehöll GHRH-aktivitet och stimulerade adenylatcyklas (4). Tumören lämnades först till dr Wylie Vale vid Salk Institute (La Jolla, CA), och han gav senare en del av den till dr Guillemin. De två grupperna fann oberoende av varandra att den innehöll hög GHRH-aktivitet och kunde isolera GHRH från tumören, karakterisera den och sekvensera den (5-8). GHRH från denna tumör var en peptid med 40 aminosyror, som har homologi med medlemmar av glukagon/sekretin/VIP-familjen av peptider.

Jag valde endokrinologi som min specialitet eftersom mina mentorer inpräntade på mig betydelsen av fysiologins tillämpning för förståelsen av patofysiologin och terapi av patienter med endokrina sjukdomar.

Varje patient som man träffar är ett experiment av naturen. Jag hade stor tur att bli hänvisad till denna patient som gjorde det möjligt för mig och mina kollegor att tillhandahålla tumören till två ledande grupper som sedan kunde isolera, karakterisera och sekvensera det länge eftersökta GHRH. Faktum är att GHRH var ett av de första hypotalamiska hormonerna som man sökte efter, men det hade varit många falska starter.

Det fanns flera anledningar till att det 1982 var möjligt att framgångsrikt karaktärisera och sekvensera GHRH. För det första hade metoderna för att bedöma aktiviteten hos tumörextrakt förfinats och var mycket känsligare. För det andra hade metoderna för mikrosekvensering förbättrats avsevärt under de föregående tio åren. Men det tredje, och förmodligen viktigaste, skälet var att denna tumör innehöll höga koncentrationer av GHRH och mycket lite somatostatin. Somatostatin hämmar GH-frisättning i bioassay, och dess närvaro försvårade därför övervakningen av reningen av GHRH. Extraktet från denna tumör förenklade processen avsevärt (eftersom det innehöll höga koncentrationer av GHRH och lite somatostatin), jämfört med tidigare försök där man använde hundratusentals hypothalami från djur som var rika på somatostatin och innehöll mycket små koncentrationer av GHRH. Detta var det första exemplet på en enda mänsklig tumör som användes för att identifiera och isolera ett hormon. PTH-relaterat protein isolerades med en liknande teknik med hjälp av en mänsklig tumörcellinje.

Som kliniker har vi alla ansvar för att identifiera naturens experiment och ta vara på möjligheterna att ställa frågor som skulle vara mycket svåra att besvara på något annat sätt. Naturens experiment är ofta unika, och säkerligen gav de 15 eller 20 patienter som kom före den här patienten ledtrådar om att en tumör från en patient med ektopisk GHRH-sekretion skulle kunna besvara frågan om GHRH:s natur och struktur. Faktum är att dr Guillemins grupp senare fick kännedom om en annan tumör från dr Genevieve Sassolas (Centre de Medecine Nucleaire, Hôpital Cardiologique, Lyon, Frankrike), och eftersom de hade mer vävnad från den tumören studerade de den mer aggressivt än den från Charlottesville. Det var dock den ursprungliga tumören från Charlottesville som antydde att en sådan tumör skulle kunna erbjuda nyckeln till sökandet efter GHRH.

Den efterföljande studien av GHRH:s fysiologi och dess terapeutiska potential som behandling av GH-brist hos barn har stått i fokus för vår grupps arbete under de senaste 17 åren (9, 10). Inledningsvis administrerade vi GHRH till normala frivilliga och visade dess effektivitet och specificitet när det gäller att öka GH-koncentrationerna i serum (11). Därefter fastställde vi GH-svaret på en akut injektion av GHRH hos barn med idiopatisk GH-brist (fig. 4). Många av barnen hade en mycket kraftig ökning av GH, medan det hos vissa fanns en liten eller ingen ökning (12); svaret på GHRH var större än på arginin och l-dopa. Baserat på dessa resultat föreslog vi att många barn med idiopatisk GH-brist egentligen lider av GHRH-brist.

En multicenterstudie av GHRH-behandling inleddes sedan. Detta verkade särskilt lämpligt eftersom det GH som användes för att behandla GH-brist härrörde från kadaver och hade varit inblandat i överföringen av Jacob Creutzfelds sjukdom. Totalt 24 barn behandlades; hos 10 barn användes en pump för att ge en GHRH-bolus var tredje timme. Denna väg och dos valdes för att efterlikna den normala fysiologin med ungefär en GH-puls var tredje timme hos växande barn. Dessutom behandlades 10 barn med pumpen var tredje timme endast över natten, och 4 barn fick två gånger dagligen sk-injektioner av GHRH. Tillväxthastigheterna hos barnen före och vid 6 månaders behandling visas i figur 5 (13).

Baserat på resultaten av denna studie inledde Serono Laboratories, Inc. en 12-månaders multicenterstudie med GHRH(1-29)-NH2 administrerat sc en gång dagligen (14). De barn som växte långsammast hade den största ökningen av tillväxthastigheten (fig. 6). Detta tyder på att GHRHH kan återställa fysiologisk GH-sekretion. GHRH är godkänt av Food and Drug Administration för diagnostisk användning samt för behandling av GH-brist hos barn. GHRH är säkert och påskyndar effektivt tillväxthastigheten hos majoriteten av patienter med GH-brist.

När GHRH syntetiserades fanns det ett stort intresse för nedreglering av gonadotropinsvaret på gonadotropinfrisättande hormon. Vi fascinerades av en observation hos en annan patient med ektopisk GHRHH-sekretion från en metastaserad karcinoidtumör som gav upphov till akromegali. Trots ihållande förhöjda GHRH-nivåer under hela 24-timmarsperioden var mönstret för GH-frisättning fortfarande pulserande, vilket tyder på att det förmodligen finns andra faktorer som är inblandade i regleringen av det pulserande mönstret för GH-sekretion (15). Det har föreslagits att detta kan bero på att somatostatin dras tillbaka. Ektopisk GHRH-sekretion visar således entydigt att en långverkande GHRH-agonist kan öka den pulserande GH-sekretionen. Studier av kontinuerlig iv GHRH-infusion hos normala personer visar på samma fenomen, och det är därför uppenbart att ett depåpreparat av GHRH kan vara ett användbart terapeutiskt medel.

Vår grupp (16) och Mayo (17) klonade GHRH-receptorn. Det är intressant att GHRH-receptorn tillhör B-klassen av G-proteinkopplade receptorer, som inkluderar receptorerna för glukagon/sekretin-familjen av peptider samt CRH, kalcitonin och parathormon. Deras struktur skiljer sig helt från strukturen hos de större receptorerna för rhodopsin (A-familjen). Det finns dock också sju transmembranöverskridande domäner i denna receptorfamilj.

GHRH:s kritiska roll påvisas av dvärglitmusen som har en punktmutation i GHRH-receptorn (18, 19). Wajnrajch et al. (20) beskrev en nonsensmutation (Glu 72stop) i den mänskliga GHRH-receptorn som orsakar tillväxtsvårigheter och GH-brist hos två barn från samma indiska muslimska släkt. Maheshwari et al. (21) har beskrivit en släkt i Sindh-dalen i Pakistan med samma mutation. Medlemmarna i denna släkt är extremt kortväxta. En annan mutation i receptorn har beskrivits i en stor brasiliansk släkt som omfattar över 110 individer med allvarlig GH-brist och extrem kortväxthet (22). Dessa experiment i naturen visar att en defekt i GHRH-receptorn försämrar den normala tillväxten och understryker GHRH:s vitala betydelse.

En teckning av GHRH-receptorn visas i figur 7 (10). Asparaginsyra på position 60 från startkodonet är platsen för den lit musmutationen. Western blotting med hjälp av ett C-terminalt GHRH-receptor-antiserum som uppväckts mot en peptid baserad på sekvensen för den humana GHRH-receptorn användes för att studera membran från HEK293-celler som transfekterats med komplementärt DNA för GHRH-receptorn. Undersökningarna tyder på att receptorn från den ljusa musen översätts till protein och faktiskt finns i membranen i hypofyscellerna hos den ljusa musen. Vi har föreslagit att denna mutation leder till en förändring i receptorns tertiärstruktur, vilket förhindrar bindning (23). Med hjälp av fotoaffinitetssonder tyder våra bevis på att andra platser finns i nära anslutning till bundet GHRH, vilket tyder på att flera interaktionsplatser troligen krävs för signaltransduktion. Tillgången till rekombinant receptor gör det möjligt att söka efter icke-peptidagonister till GHRH.

Slutsatsen är att den kunskap som inhämtats genom noggrann observation av en enda patient med akromegali ledde till isolering, karakterisering och syntes av GHRH. Ytterligare studier ledde till införandet av GHRH-behandling av GH-brist. Därefter kunde vi och andra klona receptorn för GHRH. Studier med GHRH har bekräftat att det är nödvändigt för GH-syntesen och normal tillväxt. Denna ståndpunkt bekräftas nu av observationer att mutationer i GHRH-receptorn, som leder till att den inaktiveras, leder till djupgående GH-brist och allvarlig kortväxthet, vilket fullbordar vår förståelse av GH-regleringen genom GHRH.