PARADIGMER AV CD40-CD40L-INTERAKTIONERNAS ROLL I SJUKSAMHETEN

Transplantation. Transplantationskirurgi skulle inte ha nått den grad av framgång som man sett under de senaste decennierna utan utvecklingen av effektiva immunosuppressiva medel som minimerar risken för avstötning av transplantat. Monoklonala antikroppar (MAb) mot CD40L har använts som immunosuppressiv behandling i många djurtransplantationsmodeller. Hos primater fördröjer administrering av anti-CD40L MAb avstötning av allotransplantat, medan kombinationen med CTLA4Ig, ett chimärprotein som består av den extracellulära domänen av cellytemolekylen CTLA-4 och Fc-regionen av humant IgG1 som blockerar CD28-B7-vägen, har additiva och synergistiska effekter. Denna kombinationsbehandling upprätthåller överlevnaden av njurallotransplantat hos primater och ökar överlevnaden av hudtransplantat hos möss (53, 69). Byte till anti-CD40L MAb-behandling, efter 60 dagars konventionell immunsuppression med CsA, var en effektiv behandling i en njurallotransplantatmodell med apor, trots att CsA är känt för att nedreglera CD40L-uttrycket på T-celler (7). Det har visats att CD40L-genuttrycket ökar fyra gånger i fall av akut avstötning. Detta skulle kunna fungera som en icke-invasiv metod för att övervaka allotransplantatfunktionen och även för att fastställa det biologiska svaret på klassiska immunosuppressiva medel som CsA och takrolimus, som båda är kända för att hämma CD40L-induktionen (54). I djurtransplantationsmodeller undertrycker kalcineurinhämmare CD40L-uttrycket på T-celler in vitro men inte i lymfoid vävnad, vilket tyder på att CD40-CD40L-vägen förblir funktionell under behandling med dessa medel, vilket kan bidra till avstötning av allotransplantat i den kliniska miljön (63).

Ateroskleros. Den nuvarande synen på ateroskleros, som är den vanligaste dödliga sjukdomen i västvärlden, är att det rör sig om en kronisk, degenerativ, inflammatorisk sjukdom där immunsystemet tros spela en viktig roll. CD40 och CD40L överuttrycks i experimentella och mänskliga aterosklerotiska lesioner. CD40-ligering på ateromassocierade celltyper, t.ex. endotelceller, glatta muskelceller och makrofager, leder till ökat uttryck av mediatorer för utveckling av ateroskleros, t.ex. cytokiner, kemokiner, tillväxtfaktorer och metalloproteinaser. Blockering av CD40-CD40L-interaktioner med anti-CD40L MAb hos möss resulterar i minskad bildning och progression av musatherom men främjar också sådana förändringar i lesionens biologi och struktur, som kan vara viktiga för plackstabilisering i den mänskliga sjukdomen (52).

Plattor uttrycker också CD40L och tros bidra väsentligt till rekryteringen av inflammatoriska celler till det skadade endotelet in vivo (5). Aktiverade T-celler som uttrycker CD40L finns i den aterosklerotiska kärlväggen, ett faktum som stöder hypotesen att aktiverade CD4+ T-celler kan orkestrera den aterosklerotiska processen (43).

Andra sjukdomar där CD40-CD40L-paret kan spela en roll beskrivs kortfattat i tabell 1. En kort diskussion om den här interaktionens roll i de autoimmuna sjukdomarna systemisk lupus erythematosus (SLE), reumatoid artrit (RA) och polymyosit följer nedan.

SLE. (i) CD40L-uttryck i mänsklig SLE (tabell 2). Desai-Mehta et al. har rapporterat att mononukleära celler i perifert blod (PBMC) från patienter med aktiv lupus uppvisar en 21-faldig ökning av andelen CD40L+ CD4+ celler jämfört med friska personer. Vid ytterligare stimulering av PBMC med anti-CD3 MAb ökade andelen CD40L+ CD4+-celler fem gånger hos friska personer men endast 1,4 gånger hos patienter med aktiv Lupus. Procentandelen CD40L+ T-celler var dock fortfarande högre i gruppen med aktiv SLE. PBMC från patienter med SLE i remission uppförde sig på liknande sätt som i kontrollgruppen. Liknande observationer gjordes när det gäller CD40L-uttryck hos CD8+ T-celler som nyligen isolerats från patienter med aktiv SLE (22 gånger högre uttryck än i kontrollgruppen). B-celler överuttrycker CD40L hos aktiva SLE-patienter på nivåer som är jämförbara med dem som observerats hos de aktiverade T-cellerna. Normala mänskliga B-celler uttrycker mycket låga nivåer av CD40L och endast när de manipuleras, till skillnad från aktiva-SLE B-celler som uttrycker CD40L spontant (12).

I en studie publicerad av Koshy et al. uppvisade aktiverade PBMC från friska försökspersoner eller sjukdomskontrollpatienter ett högintensivt uttryck av CD40L med en gradvis minskning till nästan basala värden vid 48 timmar, medan lupus-PBMC fortsatte att uppvisa signifikant högre nivåer av CD40L vid denna tidpunkt. Ingen uppenbar korrelation mellan CD40L-uttryck och sjukdomsaktivitet hittades i denna studie (33).

Higuchi et al. bekräftade dessa resultat i både SLE och murin lupus, vilket tyder på att ektopiskt CD40L-uttryck i lupus B-celler kan spela en avgörande roll i utvecklingen av SLE. Transgena lupusbenägna möss, som uttrycker CD40L på B-celler, producerar spontant autoantikroppar, och dessutom utvecklar hälften av dessa möss glomerulonefrit med immunkomplexavlagring (22). Devi et al. har också bekräftat det höga uttrycket av CD40L på T- och B-lupusceller. Mer specifikt uttrycker 45 % av T-cellerna från SLE-patienter CD40L jämfört med endast 8-18 % av T-cellerna från friska personer eller RA-patienter. Dessutom hade 30 % av de 48 undersökta SLE-patienterna ett ökat uttryck av CD40L även på B-celler (13). I motsats till ovanstående resultat finns det dock en rapport där man inte fann några förändringar i CD40L-uttrycket i lupuslymfocyter. I stället rapporterade dessa författare ett högt uttryck av CD86 på SLE B-celler, som också är en viktig kostimulerande molekyl (3). I en annan studie har man rapporterat att monocyter från patienter med aktiv SLE uttrycker CD40L på ett avvikande sätt. Tjugotre patienter med aktiv SLE studerades och jämfördes med 16 friska individer. Resultaten visade en sjufaldig ökning av frekvensen av CD40L-uttryckande perifera monocyter från SLE-patienter jämfört med friska personer. CD40L-uttrycket verifierades på både mRNA- och proteinnivå och korrelerade signifikant med sjukdomsaktivitet (28).

CD40L klyvs från cellytan hos aktiverade T-celler, av ett matrismetalloproteinas, vilket frigör sCD40L, en molekyl på cirka 18 till 20 kDa, som bildar homotrimerer. I en rapport om sCD40L:s funktionella roll drogs slutsatsen att sCD40L kan inducera aktivering och differentiering av B-celler. Plasmanivåerna av sCD40L var betydligt högre hos aktiva SLE-patienter än hos friska donatorer. Dessa nivåer korrelerade med sjukdomsaktivitet, bedömd med SLEDAI, och cirkulerande titrar av autoantikroppar mot dubbelsträngat DNA (dsDNA). Hypotesen är att höga nivåer av sCD40L hos aktiva SLE-patienter kan spela en patogen roll vid vaskulit och vid den nefrit som förekommer vid aktiv lupus. Författarna föreslog att sCD40L-nivåer i framtiden skulle kunna fungera som en prediktiv markör för SLE-sjukdomsutbrott (27). Vakkalanka et al. visade också betydligt högre medelkoncentrationer av sCD40L hos lupuspatienter än hos sjukdomskontroller och friska personer. Mer specifikt studerades 66 patienter med SLE och jämfördes med 30 sjukdomskontrollpatienter och 23 friska individer. Hos de friska personerna var sCD40L nästan odetekterbart, medan 38 patienter med SLE hade en sCD40L-nivå över 2 ng/ml (med en medelkoncentration på 2,61 ± 2,15 ng/ml) och endast 7 sjukdomskontrollpatienter hade en sCD40l-nivå över 1 ng/ml. Patienterna delades in i tre grupper, allvarliga, måttliga och milda, enligt kliniska manifestationer. Patienter med svår SLE hade en genomsnittlig sCD40L-koncentration på 3,93 ± 2,86 ng/ml, de med måttlig SLE hade en genomsnittlig sCD40L-koncentration på 2,81 ± 1,57 ng/ml och slutligen hade de med lindrig sjukdom en genomsnittlig sCD40L-koncentration på 1,52 ± 1.06 ng/ml, vilket tyder på en korrelation mellan sCD40L-nivån och sjukdomsaktivitet (62).

Samtidigt som CD40L-induktionen på aktiverade normala T-celler hämmas i närvaro av CsA är det av intresse att denna effekt inte gäller för SLE T-celler. I en studie av CD40L-uttryck vid mänsklig lupus drogs slutsatsen att CsA inte lyckades hämma det förlängda och ökade CD40L-uttrycket, som observerades in vitro på anti-CD3 MAb-aktiverade lupus-T-celler. Resistensen mot CsA var oberoende av sjukdomsaktivitet. Cirkulerande lupusmonocyter uppvisar också en framträdande resistens mot CsA:s hämmande effekter på CD40L-uttrycket. Dessa resultat tyder på att CD40L-induktion på SLE T-celler kan regleras av en kalcium/kalcineurinoberoende väg (29).

Det är oklart varför CD40L-uttrycket är högre hos patienter med SLE och om detta överuttryck har patogenetiska konsekvenser. Det har föreslagits att SLE T-lymfocyter, när de aktiveras av TCR-engagemang, gynnar en NFAT-dominant profil i stället för en balanserad NFAT-AP-1 transkriptionsfaktorprofil. Denna panel av intracellulära mediatorer främjar transkription och mRNA-stabilitet av vissa gener, däribland CD40L-genen. Tidigt uttryck av CD40L på SLE T-celler kräver den CsA-känsliga NFAT-vägen, men långvarigt uttryck är mer beroende av ett specifikt MAP-kinas, dvs. det extracellulära signalreglerade kinaset. Ökad och ihållande extracellulär signalreglerad kinasaktivitet i lupus T-celler skulle kunna bidra till CD40L-överexpression via aktivering av AP-1-transkriptionsfaktorn och möjligen genom att stabilisera CD40L mRNA (10, 68). Cytoplasmatiska Ca2+ flöden är supranormala i cirkulerande T- och B-celler från patienter med SLE, och det har föreslagits att denna abnormitet kan utgöra den molekylära bakgrunden för det onormala CD40L-uttrycket vid lupus (38, 40, 64). Det finns också belägg för att bristen på TCR ζ-kedjan, som har beskrivits hos SLE-patienter, delvis kan vara ansvarig för det ovan nämnda supranormala Ca2+-svaret (39, 61). Detta samband har förstärkts av den senaste rapporten om att transfektionell korrigering av TCR ζ-kedjans brist i lupus T-celler leder till en normalisering av de cytoplasmatiska Ca2+ flödena (48).

(ii) Användning av anti-CD40L MAb i lupusmodeller och i SLE. CD40/CD40L:s många funktioner i immunsvaret har gjort den till ett attraktivt mål för terapeutisk intervention vid autoimmuna sjukdomar. MAbs mot CD40L testades inledningsvis i murina lupusmodeller. Behandling av New Zealand Black × New Zealand White (NZB×NZW) F1-möss med kontinuerliga anti-CD40L MAb-infusioner resulterade i en fördröjning av sjukdomsdebuten med i genomsnitt 4 månader, en minskning av IgG anti-dsDNA-autoantikroppsnivåerna, en fördröjning av ackumuleringen av T-celler som bär på den aktiverade minnesfenotypen, en minskning av antalet B-celler i mjälten, och ett undertryckande av Ig-klassbyte och somatiska mutationer. Serumnivåerna av IgG anti-dsDNA-antikroppar var 4-10 gånger lägre än hos obehandlade åldersmatchade kontroller. När behandlingen upphörde blev T-cellsfenotypen hos de behandlade mössen omöjlig att skilja från kontrollernas och B-cellerna uppnådde en fullt aktiverad fenotyp med förhöjda IgG anti-dsDNA-titrar och utveckling av proteinuri och progressiv njursjukdom (65).

I en annan studie användes kombinationsbehandling med anti-CD40L-antikropp och CTLA4Ig. Kortvarig kombinationsbehandling av NZB×NZW F1 prenefritiska möss resulterade i en fördröjd uppkomst av njurdysfunktion i cirka 6 månader. Efter uppkomsten av proteinuri kunde en upprepad behandlingskurs framkalla remission hos tidigare behandlade möss men inte hos tidigare obehandlade möss. Nivån av IgG anti-dsDNA-autoantikroppar minskade och murinernas mjälte var tydligt utarmad på B-celler, även 16 till 20 veckor efter infusionen. Det har postulerats att behandling med CTLA4Ig och anti-CD40L MAb kan verka synergistiskt för att blockera antiapoptotiska signaler och därmed underlätta apoptos av B-celler under tidig B-cellsaktivering. Denna behandling orsakade ingen långsiktig global immunsuppression (66).

De lovande resultat som erhållits i experimentella djurstudier har inte bekräftats i SLE. Vid lupus hos människor förblir cyklofosfamid ”gold standard ” för behandling av större organpåverkan. Cyklofosfamid är ett alkylerande medel som orsakar ospecifik hämning av immunsvaret och kliniskt signifikant immunosuppression. Det har betydande biverkningar, bl.a. urinblåsecancer och gonadfel, vilket gör det nödvändigt med nya terapeutiska åtgärder. Administrering av cyklofosfamid har varit en etablerad behandling av lupusnefrit, en vanlig och fruktad komplikation till SLE och en av de främsta orsakerna till sjuklighet och dödlighet.

Två studier av administrering av anti-CD40L MAb vid mänsklig lupus har publicerats. I den första, en fas 2, dubbelblind, placebokontrollerad multicenterstudie, rekryterades 85 patienter med mild till måttligt aktiv SLE och fick 6 injektioner av IDEC-1 (anti-CD40L MAb) eller placebo under 16 veckor. Effektiviteten bedömdes vid vecka 20, främst med hjälp av SLEDAI. Resultaten visade att behandlingen med IDEC-1 var säker och väl tolererad men att effekten inte kunde påvisas jämfört med placebo (19, 26).

Den andra studien utvärderade patienter med biopsibekräftad proliferativ lupusnefrit med hjälp av BG9588 (anti-CD40L MAb). Tjugoåtta patienter med aktiv proliferativ lupus nefrit rekryterades och fick 20 mg BG9588/kg kroppsvikt med två veckors intervall under de tre första doserna och med månadsintervall under ytterligare fyra doser. Resultaten visade en 50-procentig minskning av proteinuri (där sådan fanns) utan försämring av njurfunktionen, försvinnande av hematuri och en ökning av C3-koncentrationen i serum. Anti-dsDNA autoantikroppstitrar minskade efter behandlingen, med genomsnittliga minskningar på 38,8, 50,1 och 25,3 % vid 1, 2 respektive 3 månader efter behandlingen (4). Denna studie avslutades i förtid på grund av tromboemboliska komplikationer. Mer specifikt rapporterades två fall av hjärtinfarkt. De trombotiska effekterna som komplicerade denna behandlingsregim väckte viktiga frågor när det gäller framtida studier på människor. Det bör noteras att ingen av de patienter som drabbades av en trombotisk händelse hade påvisbara antifosfolipidantikroppar. CD40-CD40L-interaktionens roll i dessa trombotiska komplikationer är fortfarande oklar och hypotetisk.

En studie av fem patienter med lupusnefrit som fick anti-CD40L-behandling visade att en kort behandling med denna behandling leder till en minskning av antalet IgG-anti-DNA-antikroppsproducerande B-celler. Dessa förändringar kvarstod i flera månader efter det att behandlingen avslutats (25). En liknande studie av fyra patienter med aktiv lupusnefrit som fick anti-CD40L-behandling (BG9588) visade att B-celler som uttrycker CD38, CD5 och CD27, som anses vara B-cellsdifferentieringsmarkörer, försvann från periferin under anti-CD40L-behandlingen. Dessa förändringar var förknippade med en minskning av nivåer av anti-dsDNA-antikroppar, proteinuri och SLE-sjukdomsaktivitetsindex (20).

RA. (i) CD40L-uttryck i RA (tabell 2). RA är en vanlig autoimmun systemisk reumatisk sjukdom som kännetecknas av en kronisk vävnadsdestruktiv process som tillskrivs ett eventuellt pågående antigendrivet immunsvar. Eftersom aktiverade T-celler antas spela en nyckelroll är det inte förvånande att CD40-CD40L-interaktioner har studerats i samband med RA.

Berner et al. studerade uttrycket av CD40L på T-celler från patienter med RA. Sextiotvå patienter med RA och 20 friska personer studerades. CD40L uttrycktes starkt på >10 % av T-cellerna hos 29 % av RA-patienterna men på 0 % av T-cellerna hos de friska kontrollerna. RA-patienter med >10 % CD4+ CD40L+ T-celler hade mer aktiv sjukdom. Åttiotre procent av patienterna i denna grupp hade förhöjda nivåer av C-reaktivt protein, 89 % var positiva till reumatoid faktor (RF) och ingen av dem uppfyllde American College of Rheumatology-kriterierna för fullständig klinisk remission, vilket tyder på en stark korrelation mellan sjukdomsaktivitet och CD40L-uttryck (2). CD40L-uttryck på höga nivåer kan återspegla en ökad och långvarig aktivering av lymfocyter som resulterar i en ökad och långvarig inflammatorisk aktivitet. Uttrycket av funktionell CD40L på höga nivåer på T-celler från patienter med RA påvisades också av MacDonald et al. (42).

En annan studie behandlade CD40-CD40L-signaleringens roll i RF-produktionen. I det friska immunsystemet är autoreaktiva B-celler med hög affinitet borttagna. Hos friska individer finns lågaffinitets-RF-producerande B-celler i lymfkörtlarna, men högaffinitets-RF är odetekterbar. Vid RA ackumuleras RF-producerande B-celler med hög affinitet i den inflammerade synovia. Resultaten av denna studie tyder på att interaktionen mellan CD40L på aktiverade T-celler och CD40 på RF-producerande B-celler är avgörande, inte bara för överlevnaden av dessa autoreaktiva B-celler utan också för RF-syntesen. De två signaler som är nödvändiga och tillräckliga för induktion av RF-syntes med hög affinitet in vivo visade sig vara IgG och CD40-CD40L-interaktion. I avsaknad av CD40-CD40L-interaktion var RF B-celler borttagna (35).

Cho et al. studerade CD40-CD40L-interaktionens roll i produktionen av vascular endothelial growth factor (VEGF). Vid RA har den inflammerade synovia tumörliknande egenskaper. Den reumatoida pannusens vidmakthållande och expansion är beroende av neovaskularisering, eftersom den omfattande migrationen av mononukleära celler in i synovia och pannusöverväxten är beroende av att det finns en rik kärlbädd. VEGF, ett heparinbindande dimeriskt glykoprotein, är en central mediator för angiogenes och inducerar endotelcellsproliferation och kapillärpermeabilitet. Det visades att CD40-ligering på synovialfibroblaster genom CD40L på aktiverade T-celler resulterade i ökad produktion av VEGF, vilket ytterligare ökas i närvaro av IL-1, TNF-α och transformerande tillväxtfaktor β (8). Ligering av CD40 på RA-synoviocyter genom CD40L på aktiverade T-celler i synovia ökar signifikant produktionen av TNF-α på ett dosberoende sätt (21). TNF-α är en viktig cytokin i RA-patogenesen. Förutom TNF-α ökar även produktionen av IL-10 via CD40-CD40L-interaktioner (15). T-celler i synovialvätska från patienter med RA uttrycker höga nivåer av CD40L jämfört med T-celler från perifert blod från friska donatorer, och efter in vitro-aktivering uppvisar de ett långvarigt, högt uttryck av CD40L. Resultaten visade att 8,71 % av T-cellerna i synovialvätska från RA-patienter var CD40L+ jämfört med 1,74 % i kontrollgruppen (41). Den potentiella rollen för CD40-CD40L-interaktionen i RA-patogenesen ledde till försök med farmakologisk manipulation av denna axel som ett terapeutiskt tillvägagångssätt för patienter med RA.

(ii) Användning av anti-CD40L MAb i djurmodeller av RA. Behandling med anti-CD40L MAb undertrycker utvecklingen av kollageninducerad artrit, som är en djurmodell för RA. Mer specifikt blockerades utvecklingen av ledinflammation, och infiltration av inflammatoriska celler i den subsynoviala vävnaden och broskerosion minskade (14). Hos K/B×N transgena möss, en modell för Ig-medierad artrit, minskade behandling med anti-CD40L MAb signifikant utvecklingen av artrit när den administrerades en vecka före uppkomsten av kliniskt uppenbar sjukdom, men behandlingen misslyckades när den administrerades vid etablerad sjukdom (36).

Dermatomyosit/polymyosit. I en studie där man analyserade 9 patienter med polymyosit och dermatomyosit observerades att muskelinfiltrerande T-celler var CD40L+ i alla 9 fallen, vilket tyder på en potentiell roll för CD40-CD40L-interaktioner i de ovannämnda kliniska entiteterna (58).