Samband mellan CFTR-mutationer och idiopatisk CP i icke-kaukasiska populationer

Då cystisk fibros i allmänhet är vanligare bland kaukasier är det viktigt att ta reda på om CFTR-mutationer/polymorfismer är förknippade med idiopatisk CP hos icke-kaukasiska patienter. I en japansk studie av 65 patienter med CP hittades en hög association av p.Q1352H (12,3 % hos CP-patienter vs 3,7 % hos kontroller) och p.R1453W (6,2 %v 3,1 %), vilket tyder på en association av CFTR-varianter med CP i Japan där CF är mycket sällsynt (30). I den här studien upptäcktes ingen av de vanliga CF-orsakande mutationer som finns i kaukasiska populationer. Mycket nyligen rapporterade Nakano et al (63) en omfattande analys av CFTR-varianter hos japanska patienter med CP med hjälp av nästa generations sekvensering. De fann 10 icke-synonyma CFTR-varianter (p.R31C, p.R31H, p.I125T, p.K411E, p.V470M, p.I556V, p.L957fs, p.L1156F, p.Q1352H och p.R1453W) hos patienter med idiopatisk CP. Frekvensen av varianten p.L1156F var högre hos patienter med idiopatisk CP än hos kontroller (10/121 jämfört med 46/1136, P=0,033). En rapport från Korea visade att den haplotyp som innehåller p.Q1352H visade det starkaste sambandet med bronkiektasi och CP (P=0,02 respektive P=0,008) (48). En annan studie från Japan (45) visade att polythymidintrakten 5T-splicingvarianter av intron 9:s acceptorspliceplats är associerade med CP. I en studie från Kina visade sig förekomsten av onormala CFTR-alleler vara tre gånger så vanlig hos idiopatiska CP-patienter som hos kontroller (22/156 jämfört med 19/400, P <0,0001) (13). 5T-allelen var associerad med tidig debut av idiopatisk CP. Haplotypen som innehåller c.125G/c.1001+11C, (TG)12 repeats, p.470M, c.2694T och c.4521G haplotypen var förknippad med en ökad risk för idiopatisk CP (oddskvot 11,3; 95 % konfidensintervall 2,3-54,6, P=0,008) hos kinesiska patienter. I en studie av indiska patienter med idiopatisk CP fann vi att mindre CFTR-varianter var 5 gånger vanligare jämfört med friska kontroller och sex nya varianter c.2280G>A, c.2988+35A>T, c.3718-41C>G, c.473G>A, c.1680-99C>T och c.1392+4G>T) upptäcktes (58).

Mekanism för CFTR-genmutation och pankreatit

Mekanismen/mekanismerna som är inblandade i orsakandet av pankreatit hos patienter med CFTR-minormutationer är inte känd. En studie visade att jonkanaltransporten, mätt med svettklorid, och den nasala transepiteliala potentialskillnaden varierade hos patienter med pankreatit som hade CFTR-minormutationer, men att jonkanalmätningarna blev sämre med ökande antal och svårighetsgrad av CFTR-mutationer (9). En annan studie visade att det fanns onormal jontransport hos patienter med två CFTR-minormutationer och pankreatit, vilket tyder på att den kvantitativa förlusten av CFTR-funktionen ligger mellan den som observeras hos cystisk fibros-patienter och hos normala bärare (64). En nyligen genomförd studie har visat att p.M348V minor CFTR-mutationen resulterade i minskade Cl- och HCO3-flöden genom xenopus oocystcellen, vilket tyder på möjligheten av en liknande defekt i bukspottkörteln (88). Det är dock inte känt om en sådan förmodad defekt i jonflödet fungerar över akinarcellen eller kanalcellerna, och hur en sådan effekt leder till initiering av pankreatit är inte heller klarlagt. Det är inte känt om det resulterar i en annan jonkoncentration i bukspottkörtelsaften i kanalerna på grund av defekten i kanalcellerna, vilket sedan leder till utfällning av proteiner och obstruktion, eller om en defekt i akinarcellerna leder till störningar i akinarcellernas inre miljö, vilket leder till störningar i enzymaktivering eller sekretion. Eftersom cystisk fibros är en sjukdom som är förknippad med öppna bakterieinfektioner är studier av tarmflorans roll i utvecklingen av CP motiverade.

Sammanfattningsvis är större och mindre mutationer i CFTR-genen förknippade med idiopatisk CP hos både kaukasiska och icke-kaukasiska patienter.

3. Serine Protease Inhibitor Kazal Type 1 (SPINK1) genen och idiopatisk kronisk pankreatit

SPINK1 är ett akutfasreaktant protein. Det är en naturlig proteashämmare och hämmar aktivt trypsin i acinarcellerna i bukspottkörteln. Det ger således skydd mot ett för tidigt aktiverat trypsin i acinarcellerna. År 2000 rapporterade tre viktiga studier en betydligt högre frekvens av p.N34S-mutationen i exon 3 i SPINK1-genen hos patienter med idiopatisk CP (17, 71, 93). Därefter har många andra studier rapporterat mutationer i SPINK1-genen hos patienter med idiopatisk CP av olika etniskt ursprung. Studier från Indien visade att SPINK1-genmutationer var ganska vanliga hos patienter med idiopatisk (tropisk) CP (7, 11). Förutom N34S-mutationen har en annan mutation p.P55S i SPINK1-genen också visat sig vara vanlig hos patienter med idiopatisk CP (23). Andra sällsynta varianter är p.D50E, p.Y54H, p.R65Q och p.R67C i SPINK1-genen. En nyligen genomförd metaanalys av alla studier om SPINK1-mutationer i CP som publicerats fram till 2007 har visat att denna mutation upptäcktes i 469 av 4 842 patientalleler och i 96 av 9 714 kontrollalleler, vilket ger en sammanlagd oddskvot på 11,00 (95 % C.I. 7,59-15,93) baserad på allelfrekvens för alla etiologier av CP (2). Oddskvoten var högre för idiopatisk CP jämfört med den för alkoholisk CP . En omfattande förteckning över de studier som ingick i metaanalysen finns i denna studie (2).

I en nyare studie av kinesiska patienter med idiopatisk CP från Taiwan visades att SPINK1-mutation är förknippad med 32,4 % av patienterna med tidig debut och 2,1 % av patienterna med sen debut av CP (15). Den vanligaste mutationen var den introniska varianten IVS3+2T>C (c.194+2>C) och inte p.N34S som setts i andra studier. Sambandet mellan IVS3+2T>C och CP rapporterades först hos japanska patienter med CP (41). Denna studie visade en tydlig skillnad mellan tidig och sen CP med avseende på genetisk mutation, vilket tyder på att mutationen leder till tidig och allvarligare form av pankreatit.

I Korea identifierades SPINK1-mutationer, p.N34S och IVS3+2T>C hos 3 respektive 11 av 37 patienter med idiopatisk CP-patienter, inklusive en med sammansatt p.N34S/IVS3+2T>C-heterozygot. Prevalensen av SPINK1 IVS3+2T>C-mutationen var 26,8 % hos patienter med idiopatisk CP (67).

I en japansk studie var frekvensen av p.N34S och IVS3+2T>C i SPINK1-genen betydligt högre hos patienter med idiopatisk CP (10.6 % respektive 11,6 %) än hos kontroller (0,4 % respektive 0 %) (54).

Den högsta frekvensen av SPINK1 p.N34S-mutationen har rapporterats hos indiska patienter med idiopatisk CP. Två studier rapporterade att SPINK1 p.N34S mutation fanns hos 47 % och 44 % av patienterna med idiopatisk (tropisk) CP (7, 11, 58).

Mekanism för SPINK1 mutation och pankreatit

Mekanismen för hur SPINK1 p.N34S mutation orsakar CP är inte väl förstådd (16). En studie visade att p.N34S-mutationen inte var förknippad med alternativ splicing (55). Två andra studier visade nästan samtidigt att de gemensamma p.N34S- och p.P55S-polymorfismerna innebär aminosyresubstitutioner med liknande fysikalisk-kemiska egenskaper, men att de inte orsakar någon signifikant minskning när det gäller uttrycket av SPINK1-mogen peptid (10, 46). Å andra sidan orsakade IVS3+2T>C-mutationen hoppning av hela exon 3, som kodar för den region där trypsinbindningsstället är beläget. Detta leder både till produktion av ett muterat protein och sänkt uttryck till 62 % av det som observerades i den friska kontrollen hos dessa CP-patienter (47). Missense-mutationen p.R65Q innebär att en positivt laddad aminosyra byts ut mot en icke-laddad aminosyra och orsakar en cirka 60-procentig minskning av proteinuttrycket (10). Andra sällsynta polymorfismer p.G48E, p.D50E, p.Y54H och p.R67C involverar laddade aminosyror och leder till fullständig eller nästan fullständig förlust av SPINK1-uttrycket, möjligen på grund av intracellulär retention och nedbrytning (46).

Sammanfattningsvis är SPINK1-genmutationer, särskilt pN34S, associerade med idiopatisk CP, mer frekvent hos patienter med CP från Indien.

4. Mutationer i andra gener och idiopatisk CP

Då mutationer i den kationiska trypsinogengenen var signifikant förknippade med ärftlig pankreatit, testades även mutationer i anjonisk trypsinogen hos patienter med CP. Det visade sig dock att anjonisk trypsinogen (PRSS2) p.G191R faktiskt kan ge skydd mot CP hos européer. Dess skyddande roll har dock ifrågasatts i andra populationer (52, 81).

Chymotrypsinogen C (CTRC) bryter ned trypsinogen och dess förlust av funktionsvarianter har hittats hos europeiska patienter med CP. Hos indiska och japanska patienter med idiopatisk CP hittades ursprungligen inget signifikant samband med CTRC-varianter (21), men en unik funktionsförlustvariant p.R29Q har identifierats hos japanska patienter och ett signifikant samband har visats även hos indiska patienter med CP (21, 57, 69).

En mutation i genen för kalciumsensingreceptorn (CASR) har föreslagits spela en roll vid idiopatisk CP hos tyska patienter (26). Även i en amerikansk population var CASR-exon 7 p.R990G-polymorfismen signifikant förknippad med CP (OR, 2,01; 95 % CI, 1,12-3,59; P=0,015) (61). Sambandet mellan CASR p.R990G och CP var starkare hos personer som rapporterade måttlig eller kraftig alkoholkonsumtion (OR, 3,12; 95 % CI, 1,14-9,13; P=0,018). Även hos indiska patienter med idiopatisk (tropisk) CP observerades ett samband med CASR-genmutationen (62).

Pankreasstensprotein (PSP) ansågs vara en viktig proteinkomponent i bukspottkörtelns stenar vid CP. PSP är ett sekretoriskt stressprotein (8). Det mänskliga PSP- eller Reg-proteinet kodas av genen reg1a (regenerationsgen). Polymorfismer i reg1a genen, inklusive de regulatoriska varianterna visade sig dock inte vara associerade med idiopatisk (tropisk) CP (51).

Angiotensin-converting enzyme (ACE) aktivitet kan vara relaterad till aktivering av pankreatiska stellatceller och pankreatisk fibros. Inga signifikanta skillnader hittades dock i prevalensen av frekvenser av ACE-deletionsgenotypen när patienter med alkoholisk (27,5 %), icke-alkoholisk (26,4 %) och akut pankreatit (32,7 %) jämfördes med kontroller (26,9 %) i en nyligen genomförd europeisk studie (39).

HFE-genen är en viktig riskfaktor för ärftlig hemokromatos, men det är inte känt om den skulle kunna öka mottagligheten för CP. Inga signifikanta skillnader hittades i heterozygositet för p.C282Y och p.H63D bland patienter med alkoholisk (8,0, 21,5 %), idiopatisk (7,3, 24,5 %) eller familjär (9,8, 23,0 %) pankreatit, eller pankreasadenokarcinom (5.4, 28,6 %) och friska (6,2, 24,8 %) och alkoholiska (7,0, 25,0 %) kontroller i en nyligen genomförd studie (38).

I en studie från Taiwan visades polymorfism i TNF-alfa-genen vara en riskfaktor för CP. Allelen 2863A i TNF-alfa-promotorn var förknippad med en ökad risk för CP (oddskvot 4,949 (95 % KI 2,678-9,035)). I multivariat analys var 2863A och 21031C oberoende förknippade med högre känslighet för CP (P<0,0001) (12).

5. Genome Wide Association Studies

Det var känt att hypotesdrivna undersökningar kan ta lång tid och ändå inte ge tillfredsställande resultat. I mer komplexa polygena sjukdomar som CP bidrar således flera gener till patogenesen genom kvantitativa snarare än kvalitativa förändringar. Därför inleddes ett hypotesoberoende tillvägagångssätt genom genome wide association studies (GWAS) för att hitta gener som påverkar sjukdomsrisken genom GWAS (36). Genom att tillämpa GWAS-metoden identifierade Whitcomb et al. två loci vid PRSS1-PRSS2 och X-linked CLDN2 som var starkt associerade med återkommande akut pankreatit och alkoholrelaterad CP hos personer av europeisk härstamning (91). Senare studier har bekräftat att dessa loci är förknippade med idiopatisk CP hos patienter av olika ursprung, dvs. kineser, européer, japaner och indier (20, 33, 56, 85).Mycket nyligen visade en annan genomomfattande associationsstudie ett nytt samband mellan alkoholisk CP och polymorfismer i generna som kodar för fucosyltransferas 2 som inte är sekretorstatus (FUT2 locus rs632111 och rs601338) och blodgrupp B (ABO locus rs8176693) (86).

Är idiopatisk kronisk pankreatit en genetisk sjukdom?

I en studie av 381 patienter med CP hade 32 % 166 muterade CFTR-alleler, inklusive 12 nya CFTR-varianter: c.4243-20A>G4375-20 A>G, p.F575Y, p.K598E, p.L1260P, p.G194R, p.F834L, p.S573C, c.2657+17C>T2789 + 17 C>T, 621+83 A>G, p.T164S, c.489+25A>G 621+25 A>G och c.3368-19G>A3500-19 G>A… SPINK1-mutationen sågs hos 14,5 % (55/381) och PRSS1-mutationen fanns hos 8,1 % (31/381) av patienterna (42). Således hade 49 % (185/381) av patienterna en eller flera mutationer. Hos 242 indiska patienter med idiopatisk CP hade upp till 66 % av patienterna antingen SPINK1- eller CFTR- eller båda mutationerna (58). Dessa observationer ger starkt stöd för konceptet att majoriteten av fallen av idiopatisk CP har en underliggande genetisk predisposition. Dessutom måste det dock finnas miljöinfluenser som modulerar sjukdomens uppenbara presentation och fenotyp. Det verkar således som om termen ”idiopatisk CP” inte längre är berättigad och en mer meningsfull term som ”CP-G ” föreslås, där ”G” betecknar genetisk känslighet.

6. Genetiska mutationer/polymorfismer och alkoholisk bukspottkörtelinflammation

Efter upptäckten av en mängd olika genmutationer vid idiopatisk och ärftlig CP trodde man att detsamma skulle kunna gälla för alkoholrelaterad CP. Men till skillnad från idiopatisk CP har genetiska mutationer i de vanligtvis misstänkta generna SPINK1, PRSS1 och CFTR inte påträffats hos patienter med alkoholrelaterad CP.

En studie av europeiska patienter visade inte på något signifikant samband med någon av de tre generna CFTR, PRSS1 och SPINK1 (70). Både CFTR- och kationiska trypsinogenmutationer visade sig inte vara predisponerande riskfaktorer för alkoholrelaterad pankreatit i en studie från USA (60). CFTR-mutationer tycktes inte spela någon viktig roll vid alkoholisk CP (89). I en studie från USA fann man inte heller någon SPINK1 p.N34S-mutation som var vanligare i alkoholisk pankreatismus än i kontroller (6,3 % jämfört med 1,1 % i kontroller; P>0,05) (76). Studier från andra delar av världen rapporterade också liknande resultat. I en studie från Korea fann man inget samband mellan kronisk alkoholisk pankreatit och CFTR- eller SPINK1-genmutationer (49).

Polymorfismer vid de kända loci i TNF-alfa-, TGF-beta(1)-, IL-10- och IFN-gamma-generna, som är involverade i inflammation, visade sig inte ha något samband med alkoholisk CP (73). Man trodde ursprungligen att pankreatitassocierat protein (PAP) kunde vara inblandat i CP:s patogenes. Det fanns dock inga bevis för polymorfism i PAP-genen hos patienter med alkoholisk pankreatit (43).

Polymorfism i gener som är relaterade till metabolismen av oxidativa föreningar, såsom NADPH-kinonoxidoreduktas 2 (NQO2), multiresistens 1 (MDR1) och lipoproteinlipas (LPL), analyserades i alkoholisk CP. Man fann dock ingen signifikant skillnad mellan patienter och kontroller när det gäller dessa gener (53). På samma sätt har polymorfismer i andra metaboliserande enzymer såsom glutation-S-transferas P1 (GSTP1) och mangan-superoxiddismutas (MnSOD) och avgiftande fas II-biotransformationsenzymer såsom UDP-glukuronosyltransferaser inte befunnits ha något samband med känslighet för alkoholisk CP (68, 83). En studie visade dock ett signifikant samband med UDP-glukuronosyltransferaser och CP med en ökad risk med UGT1A7*3-allelen (K129-K131-R208) (OR, 1,76; 95 % CI, 1,26-2,46; P=0,0009). Dessutom var UGT1A7*3-allelen specifikt förknippad med undergruppen av patienter med alkoholisk pankreatit, varav 89 % var rökare (OR, 2,24; 95 % KI, 1,46-3,43; P = 0,0001) (65).

Polymorfismer i monocytkemotaktiskt protein-1 (MCP-1) och heat-shock-protein 70-2 (HSP70-2) visade sig inte heller vara associerade med alkoholisk CP (50).

Då alkohol anses orsaka toxisk skada på bukspottkörteln har polymorfismer i de alkoholmetaboliserande enzymerna studerats som en grund för individuell känslighet för att utveckla pankreatit. I genen för alkoholdehydrogenas 1B (ADH1B) visade sig frekvensen av ADH1B*1-allelen av vildtyp vara betydligt lägre hos alkoholister med CP jämfört med alkoholister utan CP (35). Ingen signifikant skillnad hittades mellan patient- och kontrollgrupperna i aldehyddehydrogenasenzymets ADH2-genotyper. Men en signifikant skillnad hittades mellan de två grupperna i acetaldehyddehydrogenasenzymets ALDH2-locus i en annan studie (44). Frekvensen av ALDH2*1-allelen av vildtyp visade sig vara 0,681 och frekvensen av ALDH2*2-allelen (p.E504K) var 0,319 hos kontrollerna, medan dessa värden var 0,935 respektive 0,065 hos patienterna . De flesta av patienterna (27 av 31) var ALDH2*1/*1, endast fyra var ALDH2*1/*2 och ingen av patienterna var ALDH2*2/*2. Den genetiska polymorfismen i ALDH2-genen kan således påverka risken för att utveckla alkoholisk pankreatit (44). I en annan studie skilde sig inte frekvenserna av ADH3- och CYP2E1 c1c2-genotyperna mellan CP-patienter, alkoholister och friska kontroller (84). I en polsk studie var ADH2*1, ADH3*1-alleler och ADH2*1/*1, ADH3*1/*1-genotyper statistiskt sett vanligare bland patienter med alkoholisk CP än bland kontrollerna (18). I en annan studie från Australien var alkoholisk cirros, men inte alkoholisk CP, förknippad med ADH3*2/*2 och kanske med ADH2*1/*1 (28). Det finns alltså motsägelsefulla och varierande rapporter och uppgifterna hittills tyder inte på något definitivt samband mellan polymorfismer i antingen alkoholmetaboliserande eller avgiftande enzymer.

7. Genetiska mutationer vid andra typer av kronisk pankreatit

En del av de specifika orsakerna till CP är relaterade till metaboliska störningar eller anatomiska defekter, och man tror i allmänhet att dessa abnormiteter är den enda orsaken till pankreatit. Nya studier har dock fört in den roll som genetisk predisposition spelar hos sådana patienter.

I en studie av patienter med primär hyperparatyreoidism bar 4 (16 %) av 25 patienter med pankreatit på p.N34S-mutationen i SPINK1-genen, medan alla 50 kontroller (hyperparatyreoidism utan pankreatit) inte uppvisade någon mutation i SPINK1- eller PRSS1-gener (P < 0,05 jämfört med kontroller, P < 0,001 jämfört med allmänbefolkningen) (25). Dessutom fanns CFTR-mutationer hos fyra patienter (P < 0,05 jämfört med allmänbefolkningen), medan en patient bar på en 5T-allel. En patient var transheterozygot (SPINK1: p.N34S/CFTR: p.R553X). Viktigt är att de genomsnittliga serumkalciumnivåerna hos patienter med pankreatit inte skiljde sig signifikant från genomsnittet hos patienter utan pankreatit, vilket ifrågasätter värdet av serumkalciumnivåerna vid orsakande eller initiering av pankreatit. Författarna drog slutsatsen att genetiska mutationer signifikant ökade risken för pankreatit hos patienter med hyperparatyreoidism.

I hypertriglyceridemi (HTG) relaterad CP har Chang et al (14) visat en högre frekvens av CFTR-genmutationer vilket tyder på att mekanismen för pankreatit kan vara relaterad till genetisk predisposition. I deras studie av 126 HTG-patienter bar 13 (10,3 %) en CFTR-mutation (alla var p.I556V), CFTR-genmutationsfrekvensen var signifikant högre hos dem med än hos dem utan pankreatit (26,1 % (12 av 46) jämfört med 1,3 % (1 av 80); P <0,0001). En multivariat analys av HTG-patienterna visade att triglycerider, CFTR 470Val och TNF-promotor 863A var oberoende riskmarkörer för HTG-associerad pankreatit.

Det råder stor oenighet om huruvida pancreas divisum orsakar återkommande pankreatit eller inte (72). Hos patienter med pancreas divisum som uppvisar återkommande pankreatit visade en studie lägre nasal transepitelial potentialskillnad, vilket tyder på att en funktionell defekt i CFTR-genen kan förklara risken för pankreatit vid pancreas divisum (32). En annan fallrapport visade förekomst av mindre CFTR-mutationer hos två patienter med PD som uppvisade återkommande pankreatit (22). En annan studie visade att SPINK1-genmutationer var signifikant förknippade med pancreas divisum i samband med pankreatit jämfört med kontroller. SPINK1-mutationer fanns hos 38 % av patienterna med pankreas divisum och återkommande pankreatit jämfört med 2 % hos friska kontroller, vilket tyder på att pankreas divisum ensamt sannolikt inte orsakar pankreatit och att pankreatit kan vara ett resultat av både genetisk predisposition och anatomisk defekt, en 2-hit-teori (31).

Genisk mutation har inte visat sig vara associerad med CP

Polymorfismer i tumörnekrosfaktor (TNF)-promotorregionen och hela den kodande regionen i den motsvarande TNF-receptor 1 (TNFR1)-genen var inte associerade med ärftlig, familjär eller idiopatisk CP (77).

Funktionella polymorfismer i genen för transforming growth factor-beta1, interleukin-10-genen och i interferon-gamma-genen visade sig inte vara associerade med ärftlig, familjär eller sporadisk pankreatit (74).

Mutationer i generna som kodar för glutation s-transferaser – MGST1 och GSTM3-gener eller gemensamma deletioner i GSTT1- och GSTM1-gener var inte heller associerade med ärftlig pankreatit (78).

Mutationer i generna som kodar för keratin 8-gener visade sig inte vara associerade med vare sig ärftlig eller idiopatisk CP (75).

8. Framtidsutsikter

Och även om det har skett betydande framsteg i vår förståelse av den genetiska predispositionen hos patienter med CP, finns det lika betydande luckor i vår kunskap. Sålunda är för närvarande kända genetiska mutationer förknippade med 50-60 % av fallen av idiopatisk CP (42, 58). Dessutom är den orsakande rollen för genetiska mutationer vid initiering och utveckling av pankreatit inte heller klarlagd. SPINK1 p.N34S-mutationen, som är den vanligaste mutationen som rapporterats hos patienter med CP, leder till exempel inte till någon funktionell förlust av enzymaktivitet. Hur detta leder till pankreatit är okänt. Om det bara är en åskådare eller modifierare och inte den orsakande mutationen återstår att fastställa. När det gäller alkoholrelaterad pankreatit vet man inte varför endast <5-10 % av alkoholisterna utvecklar pankreatit. Den genetiska predispositionen för alkoholrelaterad pankreatit har hittills inte gett mycket information.

Den blygsamma effekten av vanliga variationer, som ligger till grund för den nuvarande GWAS-screeningtekniken, på många mänskliga sjukdomar och relaterade egenskaper gör att intresset riktas mot studier av mer sällsynta varianter med större effekter på sjukdomsutfallet. Ett strikt urval av kliniska fenotyper och prioritering av mindre patientkohorter för direkt sekvensering av hela arvsmassan kan därför vara den bästa lösningen för att identifiera varianter som kan vara orsakande.