Abstract

Detektion och analys av antigen-antikroppsreaktioner är en av de mest kritiska detektionsteknikerna inom medicin, biologi, miljövetenskap och livsmedelssäkerhet. Traditionella och klassiska metoder för att detektera antigen och antikroppar stöter på många problem, t.ex. tidskrävande, hög kostnad och låg noggrannhet. En ny teknik för avbildning av immuna mikrosfärer med hjälp av mikrolinsen används för att testa förändringarna i brytningsindex före och efter en antigen-antikroppsreaktion. Den kan snabbt utföra kvalitativ och kvantitativ bestämning av antigen-antikroppsreaktion utan märkning, förmodifiering, eftertvätt och dyra enzymer. Här presenterar och diskuterar vi dess princip och fördelar, strukturen för ett immunoassayinstrument med mikrolinser och dess potential för mätning av kliniska prover. Det är lovande att utvecklas för tillämpning för diagnos av kliniska sjukdomar.

1. Introduktion

De vanliga tekniker som numera finns tillgängliga för detektion av antigener och antikroppar är bland annat ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay), SPR (surface plasmon resonance), RIA (radioimmunoassay), GICT (colloidal gold immune chromatographic assay), IFA (indirekta immunofluorescensanalyser), CLIA (chemiluminescence immune assay) och PETIA (partikelförstärkt turbidimetrisk immunoassay). ELISA kombinerar förstärkningen av den enzymkatalyserade reaktionen och den specifika reaktionen mellan antigen och antikropp med hög noggrannhet och låg kostnad, men förfarandena är komplicerade med sträng villkorskontroll . SPR utvecklades på 1990-talet för att detektera interaktionen mellan biomolekyler och andra molekyler, och den kräver ingen märkning och kan ge ett snabbt resultat, men utrustningen är dyr och kräver stora provvolymer . RIA har egenskaper som hög känslighet, tillförlitlighet och låga krav på provvolym. Den används i stor utsträckning för att detektera proteiner, enzymer och andra molekyler, men radionukliden är skadlig för hälsan och förändrar även provets biologiska aktiviteter, vilket leder till experimentella fel . Som en ny typ av immunoassayteknik och en av de vanligaste metoderna för att detektera antigen och antikroppar är GICT lätt, enkel och snabb med låg kostnad, men dess provstorlek är begränsad med låg känslighet . CLIA, IFA och PETIA används också i stor utsträckning för att påvisa antigener och antikroppar. Deras gemensamma fördelar är hög noggrannhet, stabilitet, enkelhet och snabbhet, men med hög kostnad och stor provvolym .

En immunmikroskopisk avbildningsteknik för att testa förändringen av brytningsindex kan bryta begränsningarna i de ovannämnda metoderna. Den är snabb, känslig och enkel med icke-förorening och låg kostnad för detektering och förväntas bli allmänt tillämpad på primära medicinska institutioner . Denna teknik består av parallell ljusbestrålning, högupplöst kamera, intelligent analysmjukvara, autofokus och temperaturregleringssystem med en multiwell-mikrolensprovtestplatta och kan uppnå multipass-detektion av antigen och antikroppar . Det högupplösta kamerasystemet kan uppfylla kraven på avbildning av mikrolinser, och användningen av temperaturkontroller, autofokus och automatiska intelligenta analyssystem kan kraftigt minska fel i experiment för noggrann mätning.

2. Principen för immunoassay med mikrolinser

Mikrolinser är en cylindrisk lins med en ände av sfärisk yta och den andra änden är en plan yta. Den har en stark förstärkningseffekt och förbättrar avsevärt avbildningsförmågan hos traditionella optiska mikroskop . När en mikrolins med en radie på och ett brytningsindex (RI) på nedsänks i en lösning av () och belyses med plant ljus blir bilden på grund av brytningseffekten en rund bild med en mörk ring i kanten . Förhållandet mellan radien för den ljusa fläcken i bilden och andra parametrar som , , , och mikrolinsens cylinderhöjd visas enligt följande: där är ljusets infallsvinkel till mikrolinsens sfäriska topp och . På grundval av denna formel kan de omedelbara förändringarna av mediet bestämmas genom att mäta radien för den ljusa fläcken i bilden och radien för mikrolinsen. Eftersom optisk brytning sker med ljusets hastighet kan varje momentan RI-variation i det omgivande mediet för en mikrolins omedelbart framkalla en förändring av radien för den centrala ljusa fläcken. Metoden kan därför övervaka omedelbar RI/koncentrationsförändring med en höghastighetskamera för avbildning (figur 1).

(a)

(b)

(c)

(d)

(e)

(f)

(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)

Figur 1

Immunmikrosfärer som avbildas i olika lösningar med mikrolinsen. (a) Grundläggande princip för avbildning av immuna mikrosfärer. Bilder av en mikrolins visas i vatten med våglängden 532 nm vid 25 °C (b), i vatten med våglängden 532 nm vid 37 °C (c), i vatten med våglängden 633 nm vid 25 °C (d), i etanol med våglängden 532 nm vid 25 °C (e) respektive i serum med våglängden 633 nm vid 37 °C (f).

3. Struktur och funktioner hos ett instrument för immunoanalys med mikrolinser

Som framgår av figur 2 utgörs ett instrument för immunoanalys med mikrosfärer av en parallell ljuskälla, högupplöst avbildning, automatisk intelligent analys, autofokus- och temperaturregleringssystem samt en testplatta med flera mikrolinser. När den parallella ljuskällan sänder parallellt ljus till mikrolinsen får det högupplösta autofokussystemet en bild i fokus på millisekunder. Därefter analyseras bilden av den immuna mikrosfären av det intelligenta analyssystemet för att härleda värden för och samt koncentrationen av antigen/antikropp. Temperaturkontrollsystemet har till uppgift att justera de olika temperaturer som krävs för olika antigen-antikroppsreaktioner. Hela processen tar inte mer än 2 minuter.

Figur 2

Strukturen för ett immunoassayinstrument med mikrolinser. Det omfattar parallell ljusbestrålning, autofokus, högupplöst avbildning, intelligent analysmjukvara, temperaturkontrollsystem och en testplatta med flera brunnar med mikrolinser.

3.1. System för parallellbelysning

LED som källa för parallellbelysning producerar ett cylindriskt parallellt belysningsområde, som liknar en originalkondensor med fördelarna av låg kostnad, lång livscykel, perfekt ljusprestanda och liten skala. Som visas i figur 3 kan faktiskt parallellt ljus tas emot på grund av linsens brytning . I lysdiodens strålningsområde kan linsen ändra riktning och fördelning av ljuset genom att konfigurera relevant lins så att det faktiska parallella ljuset erhålls (figur 3).

Figur 3

Principen för systemet för parallell ljusstrålning. Linsen 1 och linsen 2 fokuserar det ljus som sänds ut av lysdioder. Därefter går det fokuserade ljuset genom en optisk tunnel och en öppning för att projiceras till linsen 3. Slutligen förvärvas det faktiska parallella ljuset av linsen.

3.2. Autofokusbildsystem med hög upplösning

Detta system består av en digitalkamera med hög hastighet och ett autofokussystem. För närvarande har bildhastigheten hos vissa kommersiella digitalkameror överskridit 10 000 bilder per sekund . Därför kan det högupplösta bildsystemet möjliggöra övervakning i realtid av dynamiska förändringar av RI i lösningen. En CCD-kamera med hög pixelstorlek spelar en viktig roll för att få en högupplöst mikrolinsbild. Autofokussystemets kärnor består av delar för bildidentifiering, bildbehandling och styrning. De bilder som samlas in av kamerasystemet analyseras och klarhetsbedömningen visas. Enligt denna utvärdering drivs systemet automatiskt till ett lämpligt område eller riktning tills upplösningen av de förvärvade bilderna uppfyller det förinställda kravet.

3.3. Automatiskt intelligent bildigenkännings- och analyssystem

Det automatiska intelligenta analyssystemet utför huvudsakligen bildigenkänning och dataanalys på mikrolensbilderna för att övervaka den omedelbara variationen av i dess bild och därigenom härleda brytningsindexförändringen i provlösningen under antigen-antikroppsreaktionsprocessen. Noggrannheten är nära kopplad till bildkvaliteten, och parametrar som pixel, pixelstorlek och upplösning påverkar direkt mätningen av RI . Om CCD-digitalkameran med ≥10 miljoner pixlar och en liten pixelstorlek på mindre än 3 nm och en mikrolins med en radie på 600 μm utnyttjas, bestäms ändringen av brytningsindexet genom förändringar av förhållandet mellan den centrala ljusa fläcken och förhållandet mellan den yttre ringens radie, så att den uppmätta ändringen av brytningsindexet kan uppgå till 10-6 .

3,4. Temperaturkontrollsystem

Temperaturkontrollsystemet är en genomskinlig tavla av härdat glas med en tunn film av indiumtinoxid och styrs med hög noggrannhet av en PID-temperaturregulator (proportionell-integral-derivativ). Det gör det möjligt att snabbt nå upp till ett inställt värde på 2 minuter och att hålla temperaturen på provet i multiwell-mikrolenstestplattan inom 0,1 °C för att göra antigen-antikroppsreaktionen effektiv .

3.5. Mikrolenstestplatta

En multiwell-mikrolensplatta är särskilt utformad för ett mikrolens-immunoassayinstrument. Den är tillverkad av material av polymetylmetakrylat (PMMA) och är i allmänhet framställd som 2 eller 16 trapetsformade brunnar för att uppfylla olika detektionskrav. I varje brunn finns en mikrolins med en radie på flera hundra mikrometer i botten. Genom att applicera mikrolensplattan får man ett objektivt tillstånd för flerkanalsdetektering. Eftersom diametern på brunnens undersida bara är cirka 2 mm räcker det med flera mikroliter provlösning för att dränka mikrolinsen för detektion av antigen-antikroppar.

4. Tillämpning av systemet för avbildning av immuna mikrosfärer

4.1. Mätning av antigen-antikroppsreaktion

Huang och hans kollegor upptäckte olika typer av antigen-antikroppsreaktioner och tog reda på deras regelbundna egenskaper. För det första förändrades brytningsindexet med reaktionstiden i processen för antigen (Ag)-antikroppsreaktion (Ab). För det andra fanns det tre faser i variationen av RI med reaktionstiden, inklusive snabbt ökande, relativt stabila och långsamt minskande perioder. Den första fasen var relaterad till kombinationen av Ag och Ab så att RI ökade plötsligt med den snabba kombinationen av Ag och Ab för att bilda komplex. RI är maximalt i den andra fasen. För det tredje hade koncentrationen av Ag eller Ab ett stort inflytande på RI. Genom att erhålla RI-ändringen som en funktion av Ag- eller Ab-koncentrationen kan deras innehåll i de testade proverna beräknas med hjälp av en passande kurva. För det fjärde skulle olika antikroppar, t.ex. fångavgift och sonderingsavgift, också påverka variationen av RI. Genom att använda denna teknik för att mäta antigen-antikroppsreaktioner med flera Ag-Ab-system har sambanden mellan ändringen av brytningsindex och koncentrationerna av flera typer av antigen-antikroppslösningar (interferon-γ (IFN-γ) Ag-Ab, Placenta alkalisk fosfatas (PAP) Ag-Ab, kallikrein 6 (KLK6) Ag-Ab, humant choriongonadotropin (HCG) Ag-Ab, hjärttroponin (cTnI) Ag-Ab, fettsyrabindande proteiner (FABP) Ag-Ab och C-reaktivt protein (CRP) Ag-Ab-lösningar) kunde erhållas (figur 4). Eftersom vi vet att associeringen och dissocieringen av antigen-antikroppskomplexet är en dynamisk process, kan man utifrån kurvan RI vs. tid och beräkning av derivatan av med tiden, kan man också få information om associations- och dissociationshastighetskonstanter och (figur 4(a)) och andra termodynamiska parametrar genom att använda följande ekvation:

(a)

(b)

(c)

(a)
(b)
(c)

Figur 4

Refektivt index ändras med antigen-antikroppsreaktioner. (a) Samband mellan det refraktiva indexet för IFN-γ- eller PAP-antigen-antikroppsreaktionen och dess tid. (b) Förhållanden mellan och KLK6- eller CRP-antigenkoncentrationer bestämdes respektive när dess monoklonala Ab eller polyklonala Ab tillsattes till motsvarande antigen. (c) Förhållanden mellan och HCG- och cTnI- eller FABP-antigenkoncentrationer analyserades respektive när dess capture Ab eller probing Ab tillsattes till motsvarande antigen. Ag: antigen; Ab: antikropp; : förändring av brytningsindex; IFN-γ: interferon-γ; PAP: placenta alkalisk fosfatas; KLK6: kallikrein 6; HCG: humant choriongonadotropin; cTnI: hjärttroponin; FABP: fettsyrabindande proteiner; CRP: C-reaktivt protein.

4.2. Mätning av kliniska prover

Den immuna mikrosfärsavbildningstekniken användes vidare för att testa kliniska prover. 36 kliniska prover detekterades av denna för koncentrationer av CRP Ag. Dess relativa standardavvikelse är cirka 2-10 % i jämförelse med immunokromatografi, och korrelationskoefficienten mellan de resultat som förvärvats på de två sätten når så högt som 0,989 (figur 5). Det är väl känt att kliniskt hemolyserade serumprover i hög grad kan påverka noggrannheten hos de resultat som upptäcks med traditionella metoder. Däremot är bilderna av mikrolinsen i hemolyserade prover fortfarande tydliga genom denna teknik. De relativa felen mellan de upptäckta antigenvärdena i proverna med hemolys och proverna utan hemolys är bara omkring 2 %, vilket tyder på att de hemolyserade serumproverna har mindre inflytande på resultatets noggrannhet .

Figur 5

Mätning av 36 kliniska prover med avseende på antigenet C-reaktivt protein med hjälp av immunmikroskopisk avbildning i jämförelse med immunokromatografi.

5. Genomförbarhet av immunmikrosfärsavbildning för detektion av antigener och antikroppar

De flesta antigener är proteiner medan några få är polysackarider, nukleinsyror och andra ämnen, och alla antikroppar är proteiner. Eftersom proteinet innehåller en stor mängd amido och karboxyl, orsakar dessa polära grupper att de kolloidala partiklarna producerar en elektrisk laddning på grund av den elektrostatiska verkan, och partiklarna med samma laddning stöts bort från varandra. Samtidigt reagerar de polära grupperna som är starkt hydrofila med vattenmolekyler och bildar ett hydreringsskikt för att producera en hydrofil kolloid, vilket säkerställer att proteinet inte agglomererar och bildar en utfällning, så att de kolloidala partiklarna är jämnt spridda i en lösning .

När antigenet kombineras med antikropp minskar eller försvinner den elektriska laddningen hos de kolloidala partiklarna, och hydreringsskiktet försvinner också eller blir tunt. Proteinet förändras från hydrofil till hydrofob kolloid . I elektrolytens miljö agglomererar kolloidala partiklar ytterligare för att bilda antigen-antikroppskomplex som kan förverkligas med ögonen . Brytningsindexen för den hydrofila och den hydrofoba kolloiden är anmärkningsvärt olika. Denna teknik kan därför övervaka dynamiska förändringar av brytningsindexet för att bedöma om det förekommer antigen- och antikroppsreaktioner i en lösning. En standardkurva kan upprättas i enlighet med förhållandet mellan antigen- och antikroppskoncentrationen och deras reaktionstid. Komplexet blir större i takt med antigen-antikroppsreaktionen, och förändringen av brytningsindexet blir också tydligare. Med hjälp av standardkurvan är det lätt att kvantifiera koncentrationen av detekterad antikropp eller antigen.

Det visades att en antikropp som är komplementär till epitoper av olika antigener verkligen skulle inducera liknande RI-ökning i Ag-Ab-reaktionen med den avbildande immunoanalysen med mikrolinser. Som framgår av figurerna 4 b och 4 c utfördes antigenmätningar med hjälp av fångst-AB och probing-AB eller monoklonal-AB och polyklonal-AB för ett visst antigen. Av kurvorna framgår att det inte fanns någon signifikant skillnad mellan de två typerna av antikroppar när det gäller att inducera förändringar under Ag-Ab-reaktionen, vilket tyder på att immunoassayet med mikrolinsavbildning kan använda olika typer av antikroppar, antingen fånga eller sondera Ab och monoklonalt eller polyklonalt Ab för detektion. Icke desto mindre är monoklonal Ab att föredra för immunoassay med mikroskopisk avbildning, eftersom den inte bara inducerar en större reaktion genom sin högre affinitet till antigenet utan också minskar risken för falskt positiva korsreaktioner, så att antigener kan detekteras vid lägre koncentrationer . Sammantaget är korsreaktioner teoretiskt sett oundvikliga för denna teknik, liksom för andra metoder som används vid immunoassay. Med andra ord beror den immuna mikrolinsavbildningens specificitet helt och hållet på specifikationen av de utvalda antikropparna mot målantigenet. Därför är det mycket viktigt att screena ut lämpliga antikroppar och optimera Ag-Ab-reaktionssystemet.

6. Slutsatser

Denna teknik för immunmikroskopisk avbildning kan snabbt och noggrant mäta RI för olika prover och övervaka förändringar av RI i realtid under processen för antigen- och antikroppsreaktion. RI förändras med förändringar av koncentrationen av Ag eller Ab. Enligt RI-förändringen som en funktion av Ag- eller Ab-koncentrationen kan innehållet i proverna således beräknas kvalitativt och kvantitativt utan märkning, förmodifiering, eftertvätt och dyra enzymer. Jämfört med konventionella detektionsmetoder är fördelarna med denna metod exakta, tillförlitliga, snabba (färdiga inom några minuter) och enkla utan föroreningar. Dessutom är dess detektionsgräns så låg som pg/ml, vilket bara kräver att flera μl räcker för att utföra detektion och den är också lämplig för hemolyserade kliniska prover som är svåra att detektera med traditionella metoder. Dessutom är den inte störande för proverna. Det parallella ljusbestrålningssystemet, det högupplösta kamerasystemet, det automatiska intelligenta analyssystemet, autofokussystemet, temperaturregleringssystemet och detekteringskortet med porösa mikrolinser utgör instrumentet för immunoassay med mikrosfärer. Det är litet och lätt att bära.

Det är väl känt att antigen-antikroppsreaktionen i hög grad påverkas av sin egen koncentration, temperatur, pH och elektrolytlösning. Av denna anledning tas dessa faktorer i beaktande i mikrolinsavbildningssystemet för att hålla data stabila genom att balansera deras förändringar. Detta system kan till exempel optimeras genom att välja lämpliga material för en testplatta som erbjuder en antigen-antikroppsreaktionsplats och genom att göra plattan hydrofil för att undvika hydrofobisk interferens. Detektionsnoggrannheten kan förbättras ytterligare genom att justera proportionen antigen-antikropp, screena lämpliga utspädningsmedel, modifiera dem med metalljoner och så vidare.

Detektering av antigen och antikroppar är relativt betydelsefullt inom områdena biomedicinsk utredning, klinisk diagnostik, läkemedelsanalys, livsmedelssäkerhet och miljöövervakning. Med människors oro för miljöhälsa, livsmedelssäkerhet och hälsovård har utvecklingen av ett känsligt instrument med låg kostnad, hög noggrannhet, liten storlek, bärbarhet och enkel drift blivit ett angeläget samhälleligt behov. Således är denna immuna mikrolinsbildteknik lovande att tillämpas brett på olika områden och lämplig att särskilt populariseras i samhället och på landsbygden.

Intressekonflikter

Författarna förklarar att det inte finns någon intressekonflikt när det gäller publiceringen av den här artikeln.

Författarnas bidrag

Jiahui Liang och Xiaotian Ye bidrog i lika stor utsträckning till detta arbete.

Acknowledgments

Vi är tacksamma mot Guangzhou City Science and Technology Program Synergistic Innovation Major Project (bidragsnummer: 201604020146) och National Natural Science Foundation of China (bidragsnummer: 81172824 och 30971465) för deras finansieringsstöd.