En biologi av p38-kinas
Den p38 MAPK-signalvägen har varit ett av de mest intensivt studerade ämnena inom biologin sedan den först identifierades för mer än tio år sedan. Intresset för denna väg har främst drivits av två faktorer. För det första aktiveras denna signalväg av ett stort antal stimuli och är inblandad i många sjukdomar, framför allt inflammation. För det andra gav den tidiga tillgången på selektiva p38-hämmare de kritiska verktyg som krävs för att ytterligare beskriva den roll som proteinkinaser spelar i signalvägar, och medel för att utnyttja den terapeutiska potentialen hos p38-hämning. Under de senaste fem åren har ett stort antal p38-hämmare gått in i kliniska prövningar.
När p38 MAP-kinas upptäcktes hade den första medlemmen av MAP-kinasfamiljen, extracellulärt signalreglerat kinas (ERK), redan identifierats. Man visste dock inte att det fanns ytterligare två underfamiljer av threonin/tyrosinkinaser med dubbel specificitet (p38 och JNK). År 1994 identifierade flera forskargrupper oberoende av varandra en ny kinasaktivitet (Freshney et al., 1994; Han et al., 1994; Rouse et al., 1994;) och därefter ledde kloning av det mänskliga cDNA:t till identifiering av p38 α (Lee et al., 1994). Kort därefter identifierades tre andra skarvvarianter av p38-familjen, p38β, P38y och p38h (Jiang et al., 1996, Jiang et al., 1997, Kumar et al., 1997). Två medlemmar av familjen, p38α och β, är ubiquitärt uttryckta men differentiellt reglerade i olika celltyper, medan de andra två är mer begränsade i vävnadsdistribution. Hittills är p38α, som har varit inblandad i en mängd sjukdomar, den bäst förstådda medlemmen i familjen (granskad i Kumar et al., 2003 och Saklatvala, 2004).
Aktivering av p38 har observerats i olika organismer som ett svar på många stimuli. De ortologer av p38α som finns i jäst, mask och groda har involverats i osmoreglering, stressreaktioner och cellcykelreglering. Regleringen av p38α i däggdjursceller har också studerats väl (granskad i Zarubin och Han, 2005). Det står nu klart att p38α-signalvägen är komplex och påverkas inte bara av stimuli och celltyp utan också av olika regulatorer och kombinationer av aktiverande kinaser uppströms. Det är väl känt att det finns två huvudsakliga uppströmsaktiverande kinaser för p38α, MKK3 och MKK6. Dessutom finns det en MKK-oberoende mekanism för p38α-aktivering som involverar transforming growth factor activated protein kinase 1 (TAK1)-bindande protein (TAB) (Ge et al., 2002). Aktiveringen av p38α kan uppnås genom autofosforylering efter interaktion med TAB1. Det föreslås också att p38 negativt reglerar TAK1-signalering genom fosforylering av TAB1 (Cheung et al., 2003). Nedströms från TAK1-signalering finns IKK, som fungerar som ett viktigt aktiveringssteg för Tpl2-kinaset och dess nedströmsmål, MEK1 och ERK (Waterfield et al., 2004). Hämning av p38 resulterar således i en uppreglering av TAK1, vilket leder till ERK-aktivering. Detta förklarar varför aktivering av ERK ofta observeras i celler som behandlas med p38α-hämmare. Detta fynd belyser behovet av att förstå potentiell icke-linjär korskoppling mellan kinasignalvägar. Förutom TAK1 är andra uppströms kinaser (MAP3K) också inblandade i aktiveringen av p38α och dess nära granne JNK. Till aktiveringsprocessen bidrar också små GTP-bindande proteiner som Rac1 och Cdc42 och deras interaktion med PAK (p21-aktiverade kinaser) och MLK1.
Downstream-substrat till p38 MAP-kinaser är MAPKAPK2 (Kotlyarov et al, 2002) och MAPKAPK3 (McLaughlin et al., 1996), som fosforylerar olika substrat – däribland litet värmeschockprotein 27 (HSP27), lymfocytspecifikt protein 1 (LSP1), cAMP response element-binding protein (CREB), transkriptionsfaktor (ATF1), SRF och tyrosinhydroxylas. Av särskilt intresse är MAPKAPK2-substratet tritetraprolin, ett protein som destabiliserar mRNA (Tchen et al., 2004). MNK är ett annat p38-substrat som verkar vara involverat i translationsinitiering, eftersom det fosforylerar eIF-4E (Waskewicz et al., 1997). Dessutom är p38-aktiverat kinas (PRAK) och mitogen- och stressaktiverat proteinkinas (MSK1) också kända för att aktiveras av p38α, även om MSK1 också aktiveras av ERK (Deak et al., 1998). Det är inte överraskande att det finns ett stort antal transkriptionsfaktorer som regleras av p38 (granskad i Zarubin och Han, 2005). Några exempel är aktiverande transkriptionsfaktorer 1, 2 och 6, SRF-accessoriprotein (Sap1), GADD153, p53, c/EBPb, myocytförstärkande faktor 2C (MEF2C), MEF2A, DIT3, ELK1, NFAT och high mobility group-box protein (HBP1). Andra orelaterade proteiner, såsom cPLA1, Na+/H+-utbytare isoform-1 (NHE-1), tau, keratin 8 och stathmin har också visat sig vara substrat för p38α.
Mekanismen genom vilken p38 MAP-kinashämmare undertrycker uttrycket av inflammatoriska cytokiner har varit svår att förstå. Inflammatoriskt genuttryck är starkt reglerat på både transkriptionell och posttranskriptionell nivå. Tidiga studier som undersökte effekterna av p38-hämmare i humana monocyter tydde på att regleringen av biosyntesen av inflammatoriska cytokiner (främst IL-1 och TNF) skedde på posttranskriptionell nivå. Senare blev det uppenbart att mRNA-stabiliteten kan påverkas negativt av hämning av p38-banan (Frevel et al., 2003). Denna observation föranledde ytterligare studier som visade att andra inflammatoriska responsproteiner, t.ex. COX-2, påverkades på ett liknande sätt (Lasa et al., 2000). Andra mRNA som stabiliseras av p38 är bland annat MIP-1a, gm-CSF, VEGF samt MMP-1 och -3 (Dean et al., 2004). Intressant nog är MAPKAPK-2, ett substrat för p38, också involverad i mRNA-stabilisering av p38. Katalytiskt aktiva former av MAPKAPK-2 stabiliserar reporter-mRNA, medan dominant negativ MAPKAPK-2 blockerar dess uttryck (Winzen et al., 1999).
Ett gemensamt kännetecken för strukturella egenskaper som påverkar mRNA-stabiliteten är det AU-rika motivet i den förlängda 3′UTR. Detta motiv beskrevs först av Shaw och Kamen (1986). Det finns tre olika klasser av sådana AU-rika element (AREs): den ena innehåller ett litet antal AREs (t.ex. c-Fos), den andra innehåller ett större antal AREs som besitter flera pentamerer (t.ex. TNFα, COX-2 osv.), och den tredje klassen innehåller AREs som saknar pentamerer, men som innehåller U-rika regioner. ARE:erna är inriktade på mRNA för snabb deadenylering i cellerna. I allmänhet har p38-regulerade ARE:er liknande strukturella motiv med flera överlappande pentamerer i 3′UTR:erna. Det finns dock undantag, t.ex. MMP-1 och -3 (Reunanen et al., 2002) och tristetraprolin (Mahtani et al., 2001, Tchen et al., 2004), mRNA som innehåller minst en pentamerisk och U-rika sekvenser. Den exakta mekanism genom vilken p38 reglerar mRNA-stabiliteten är fortfarande oklar. Man tror att nedströmskinaset MAPKAPK-2 är inblandat, liksom ett svårdefinierat ARE-bindande protein. Det finns ett antal kandidater (Dean et al., 2004), men ingen av dem uppfyller alla kriterier för att vara det protein som kopplar samman p38-vägar och ARE-innehållande mRNA. Av dessa är tristetraprolin en intressant möjlighet, även om det huvudsakligen fungerar som en ”avbrytare” i mRNA-stabiliseringen.
En stor mängd data från prekliniska studier visar på en central roll för p38 i immunologiska och inflammatoriska reaktioner (Dong et al., 2002; Kracht och Saklatvala, 2002; Kumar et al., 2003). Det är nu känt att p38-systemet aktiveras selektivt i Th1-effektor-T-celler som svar på IL-12 och IL-18. Produktionen av Th1-cytokiner, t.ex. interferon gamma, hämmas av p38-hämmare, medan produktionen av IL-4, en Th2-cytokin, inte hämmas. I makrofager regleras ett antal inflammatoriska cytokiner – t.ex. TNF, IL-1, IL-6 och IL-8 – genom p38-vägar. MKK3 knock-out musembryofibroblast reagerar på TNF, men inte på IL-1, UV eller sorbitol, vilket tyder på att MKK3 spelar en roll för TNF, men inte för IL-1. I p38α knock-out musembryofibroblaster är dock den IL-1-inducerade IL-6-produktionen kraftigt nedsatt. Dessa uppgifter tyder på att olika ligander kommer att framkalla funktionen hos olika kinaser i p38-systemet. Tillsammans med ett stort antal genetiska och farmakologiska bevis in vivo stöder dessa resultat p38 som ett giltigt mål, vars hämning skulle kunna ge terapeutiska fördelar vid en rad olika inflammatoriska sjukdomar, särskilt reumatoid artrit (Foster et al., 2000). Andra möjligheter till farmakologisk intervention är hjärthypertrofi, Alzheimers sjukdom, kärlskador, psoriasis och inflammatoriska tarmsjukdomar.