HypaCas9 och Cas9-HF1 uppvisar långsamma klyvningshastigheter
Vi inleder våra kinetiska analyser genom att mäta koncentrationen av enzymet på den aktiva platsen för var och en av Cas9-varianterna23,24,25. Mätning av mängden produkt som bildas i en titrering av enzym med ökande koncentrationer av DNA avslöjade aktiva platskoncentrationer på 31 nM, 26 nM, 23 nM för SpCas9, HypaCas9 respektive Cas9-HF1 för enzymprover med en nominell koncentration på 100 nM baserad på absorbans vid 280 nm (kompletterande fig. 1a-d). Vi mätte också koncentrationerna av den aktiva platsen för SpCas9 och HiFiCas925 från Integrated DNA Technologies (IDT) och observerade liknande koncentrationer av aktivt enzym (kompletterande figur 1e-f). Det är viktigt att notera att i varje fall var den koncentration av DNA som krävdes för att mätta signalen lika stor som koncentrationen av den produkt som bildades, vilket eliminerar farhågor om att en del av enzymet skulle kunna binda DNA men inte reagera. Alla efterföljande experiment sattes upp med hjälp av den koncentration av aktivt enzym som bestämdes i titreringen av den aktiva platsen.
För att jämföra kinetiken för on- eller off-target DNA-substrat för SpCas9 med de konstruerade varianterna undersökte vi först tidsförloppet för målsträngens (HNH) klyvning för varje enzym (fig. 1 och kompletterande fig. 2). Data anpassades med antingen en enkel- eller dubbel-exponentialfunktion med hjälp av Eq. (1) respektive Eq. (2).
där Y representerar koncentrationen av klyvningsprodukten, A1 representerar amplituden och λ1 representerar den observerade sönderfallshastigheten (egenvärde)17.
där Y representerar koncentrationen av klyvningsprodukten, A1 representerar amplituden och λ1 representerar den observerade hastigheten för den första fasen. A2 representerar amplituden och λ2 representerar den observerade hastigheten för den andra fasen.
En jämförelse av de observerade klyvningsavklingningshastigheterna för on- och off-target-substrat av SpCas9 visar att den 3 bp PAM-distala missmatchningen bromsar enzymet 13-faldigt (från 1 s-1 till 0,076 s-1). Båda Cas9-varianterna med hög fidelitet minskar dramatiskt den observerade nedbrytningshastigheten för klyvning av DNA-substrat på måltavlan 21- till 35-faldigt jämfört med SpCas9 (0,028 s-1 för HypaCas9 och 0,047 s-1 för Cas9-HF1 jämfört med 1 s-1 för SpCas9). Dessutom minskar HypaCas9 och Cas9-HF1 ytterligare nedbrytningshastigheterna för DNA-klyvning utanför måltavlan 8- till 290-faldigt (0,0033 s-1 respektive 0,00016 s-1) i förhållande till deras respektive hastigheter med DNA inom måltavlan. Dessa data visar på dramatiska förändringar i de observerade klyvningshastigheterna hos de konstruerade varianterna med DNA som är på och utanför måltavlan. Dessa mätningar i sig definierar dock inte förändringar i specificitet, som är en funktion av den kinetiska fördelningen av DNA-klyvning jämfört med dissociation, som omfattar alla steg som leder fram till det första irreversibla steget i vägen17 , inklusive reversibel DNA-bindning, bildning av R-loop, dockning av HNH-domänen och DNA-klyvning.
DNA-avveckling är i stort sett oförändrad med Cas9-varianterna
Med tanke på att vårt tidigare arbete identifierade R-loop-bildningen som hastighetsbegränsande för on-target-klyvning och att andra senare föreslog att R-loop-bildningen och avvecklingshastigheterna kan diktera enzymspecificiteten för SpCas9 och Cas9-HF116, testade vi om HypaCas9 skulle uppvisa liknande kinetik. För att direkt mäta hastigheterna för bildandet av R-slingor för alla enzymer använde vi en stoppad flödesanalys baserad på mätning av fluorescensen av tCo vid -16 nt, en fluorescerande tricyklisk cytosinanalog som släckts av basstapling i dsDNA så att öppnandet av duplexen resulterar i en stor ökning av fluorescensen. Våra kontrollexperiment med användning av både våra tCo- och 2-AP-märkta basanaloga substrat vid positionerna -16, -9 respektive -1 nt (kompletterande figur 3) visar att ingen av analogerna påverkar den observerade avklingningshastigheten för DNA-klyvning. De kemiska strukturerna hos tCo och 2AP är mycket mindre skrymmande än större Cy3- och Cy5-märkningar och det är mindre troligt att de stör enzymkinetiken (kompletterande figur 4). I närvaro av Mg2+ avvecklar SpCas9, HypaCas9 och Cas9-HF1 DNA-substratet på måltavlan med nästan identiska avvecklingshastigheter (~2 s-1) (fig. 2). Överraskande nog var avvecklingshastigheten för bildandet av R-slingor för off-target DNA-substrat för alla Cas9-varianter också i stort sett oförändrad (mellan 0,85 s-1 och 2,59 s-1). Därför är DNA-avvecklingen inte hastighetsbegränsande och korrelerar inte med de observerade klyvningshastigheterna för hög-fidelitetsvarianterna, till skillnad från SpCas9.
Med tanke på tCo:s placering vid -16 nt är det troligt att våra mätningar avspeglar ett sent steg i avvecklingsprocessen. Som jämförelse mätte vi nedbrytningshastigheten för bildandet av R-slingan med hjälp av tCo märkt vid en position omedelbart närmast PAM (position -1 nt). Efter att snabbt ha blandat Cas9-RNA med DNA-substratet på måltavlan observerade vi en markant ökning av fluorescensen när DNA:t avvecklade tCo-basanalogen. Vi anpassade data till en dubbelexponential för att bestämma den huvudsakliga avklingningshastigheten på 10 s-1 (fig. 3a-f). Intressant nog tyder dessa resultat på att när en PAM-plats väl är engagerad i enzymet är den inledande avvecklingen av DNA snabbare än vad som observerades vid -16 nt. Dessa data tyder på att den nettoavvecklingshastighet som observerats vid -16 nt kan vara en funktion av flera snabba avvecklingssteg som leder till fullständig avveckling. Eftersom ingen fördröjning observerades i kinetiken verkar det dock som om de snabbare, tidigare partiella avvecklingsstegen leder till ett slutligt hastighetsbegränsande steg av fullständig avveckling, mätt vid positionen -16 nt. Även om ytterligare studier behövs för att undersöka effekterna av missmatchningar i tidigare skeden av avvecklingen, ger vår nuvarande mätning den bästa uppskattningen av nettohastigheten för bildandet av R-slingor. Den nedbrytningshastighet som mäts för R-loop-bildning med hjälp av denna etikett är omöjlig att särskilja för både SpCas9 och varianterna med hög fidelitet på alla substrat som testats, så hastigheterna för DNA-avveckling tycks vara oförändrade av de konstruerade Cas9-enzymerna.
För att korrelera hastigheterna för bildandet av R-slingor med de steg som är involverade i HNH-domänens dockning på målsträngen, mätte vi enzymets konformationsförändring med hjälp av stoppad flödesanalys på en Cas9 som var märkt med Cy3 och Cy5 enligt tidigare beskrivning18. Kortfattat märktes en Cystein-light-version av Cas9 med Cy3 vid aminosyra 355 och Cy5 vid aminosyra 867. FRET-effektiviteten ökar när HNH-domänen omarrangeras till det katalytiskt aktiva tillståndet (fig. 3g). Efter att snabbt ha blandat det FRET-par-märkta Cas9 med ett perfekt matchat on-target-DNA observerade vi en ökning av FRET-effektiviteten, vilket tyder på att HNH-domänen omorganiserades till ett katalytiskt aktivt tillstånd. Vi mätte avklingningshastigheten för HNH-dockning till ~2,5 s-1 (fig. 3h), vilket liknar FRET-mätningar av enskilda molekyler. Överraskande nog är de observerade hastigheterna för bildandet av R-slingan (1,5 s-1) och HNH-domänens dockning mycket lika, vilket tyder på att dessa steg kan vara kinetiskt kopplade. Den något snabbare observerade avklingningshastigheten för HNH-domänens rörelse kan bero på den omvända reaktionen när domänrörelsen kommer i jämvikt efter eller samtidigt med R-loop-bildningen.
Avklingningshastigheterna för DNA-avveckling har också mätts med hjälp av metoder för enstaka molekyler med hjälp av ett FRET-par-märkt DNA, Cy3 och Cy5 märktes på positionen -6 nt på målsträngen respektive -16 nt på den icke-målsträng16. Därför testade vi också de FRET-parade DNA-substraten i ett försök att korrelera FRET-signalen med de observerade hastigheterna för DNA-klyvning. Först testade vi det substrat som tidigare använts i studier av enskilda molekyler utan Cy3/Cy5-märkning16 , som har en skillnad på två nukleotider jämfört med vårt substrat, närmare bestämt en T-substitution i positionerna -16 och -18. Avklingningshastigheten för målsträngens (HNH) klyvning liknar den för vårt substrat (0,7 s-1 jämfört med 1 s-1, kompletterande figur 5a), så sekvenskontexten vid denna position har ingen betydande inverkan. Vi testade också klyvning med Cy3/Cy5-märkt DNA med denna andra sekvens, och den visade en liknande avklingningshastighet som vår sekvens (0,05 s-1 vs 0,06 s-1, kompletterande figurer 5b och 6a). Senare undersökte vi tidsförloppet för målsträngens (HNH) klyvning av Cy3/Cy5-märkt DNA med vår sekvens för varje enzym (kompletterande figur 6). Med SpCas9 följer reaktionen av det Cy3/Cy5-märkta DNA:t en enkel exponential med en markant minskad avklingningshastighet (0,06 s-1 jämfört med 1 s-1) som visar en ~17-faldig minskning av den observerade avklingningshastigheten för DNA-klyvning jämfört med omärkt substrat. De konstruerade HypaCas9 och Cas9-HF1 uppvisade också minskade DNA-klyvningshastigheter på 0,0046 s-1 respektive 0,0016 s-1, vilket är 5,9 gånger respektive 28,75 gånger långsammare än omärkta substrat som mättes under identiska förhållanden. Det är tydligt att interferens från Cy3/Cy5-märkningen förändrar effekten av varianterna med hög tillförlitlighet på DNA-klyvningshastigheten. Sammantaget påverkade märkningen av DNA med skrymmande Cy3- och Cy5-märkningar enzymet dramatiskt. Av dessa skäl utfördes inga ytterligare studier med FRET-par-märkt DNA.
Cas9-specificitet styrs av kinetisk fördelning
Då enzymspecificitet är en funktion av alla steg som leder fram till det första, till stor del irreversibla steget, måste alla händelser före DNA-klyvning beaktas17. För att mäta den inneboende klyvningshastigheten förbigick vi det normalt hastighetsbegränsande steget för bildning av R-slingan genom att preinkubera SpCas9 med off-target-DNA i frånvaro av Mg2+ för att låta bindning och konformationsförändringar komma i jämvikt och bilda ett SpCas9.DNA-komplex. Vi inledde sedan den kemiska reaktionen genom att tillsätta 10 mM Mg2+. I våra tidigare studier var R-loop-bildningen hastighetsbegränsande när SpCas9 reagerade med on-target-DNA, och den inneboende klyvningsavklingningshastigheten var snabbare när den mättes med hjälp av förinkubationsprotokollet. Här, med off-target-DNA, uppmättes hastigheten för HNH- och RuvC-klyvning till 0,12 s-1 respektive 0,14 s-1 (kompletterande fig. 7c, d och kompletterande fig. 8), vilket är mycket långsammare än hastigheten för R-loop-bildning. Intressant nog visar dessa resultat att det hastighetsbegränsande steget i enzymbanan för SpCas9 med ett off-target är DNA-klyvning eftersom den avklingningshastighet för R-loop-bildning som vi mätte var 0,85 s-1 (fig. 2b). Dessa data tyder på att diskrimineringen åtminstone delvis baseras på en förändring av identiteten hos det hastighetsbegränsande steget när man jämför on- och off-target-DNA.
Vi upprepade dessa experiment med HypaCas9 och Cas9-HF1 med on- eller off-target-DNA. Dessa resultat definierar observerade hastigheter för HNH-klyvning på 0,035 s-1 och 0,0023 s-1 för HypaCas9 med on- och off-target-substrat, respektive (kompletterande figur 7g, k). Den observerade klyvningshastigheten för Cas9-HF1 för on- och off-target-substrat uppmättes till 0,038 s-1 respektive 0,00014 s-1 (kompletterande figur 7o, q). Dessa observerade klyvningshastigheter är något snabbare än de som uppmätts vid samtidig tillsats av DNA och Mg2+, vilket tyder på att något annat steg än R-slingebildning men som föregår DNA-klyvningen kan sakta ner den observerade avklingningshastigheten. Dessa resultat visar ändå att de observerade klyvningshastigheterna för on-target-DNA reduceras ~100 gånger för både HypaCas9 och Cas9-HF1 i förhållande till SpCas9. För DNA utanför måltavlan minskar de observerade klyvningshastigheterna 50- eller 860-faldigt för HypaCas9 eller Cas9-HF1 i förhållande till SpCas9.
Diskriminering definieras inte enbart av de relativa klyvningshastigheterna för DNA. Eftersom R-loop-bildningen är snabb är diskrimineringen snarare en funktion av den kinetiska fördelningen mellan hastigheterna för frisättning av DNA och klyvning17,26,27. För att kvantifiera den kinetiska fördelningen inkuberade vi enzym och märkt DNA i avsaknad av Mg2+, vilket gör det möjligt för R-loop-bildningen att komma i jämvikt, men förhindrar katalysen15. Vi tillsatte sedan Mg2+ för att initiera reaktionen i närvaro av ett stort överskott av identiskt, omärkt on-target-DNA för att fungera som en fälla. En jämförelse mellan parallella experiment som utförs i närvaro och frånvaro av DNA-fällan ger en uppskattning av den fraktionella kinetiska fördelningen för dissociation kontra klyvning av bundet DNA (fig. 4a). När SpCas9 väl var bunden till mål-DNA klyvs det snabbt, och DNA-fällan hade liten effekt (fig. 4b). Däremot separerades 33 % av off-target-DNA:t från enzymet, medan ~67 % av DNA:t var bundet till klyvning (fig. 4c och kompletterande fig. 9a). Dessa resultat visar att SpCas9 diskriminerar mot det PAM-distala mismatchade DNA:t genom att minska klyvningshastigheten, vilket ökar andelen DNA som frigörs snarare än klyvs. Effekten är dock liten så dissocieringshastigheten verkar vara långsammare än klyvningen.
Nästan undersökte vi den kinetiska fördelningen för HypaCas9 och Cas9-HF1 som är bundna till on-target-DNA (Fig. 4d, f, Supplementary Fig. 9b, d). Våra resultat med HypaCas9 och Cas9-HF1 visar att ~75 % respektive ~92 % av on-target-dna:t klyvdes i närvaro av fällan. Procentandelen klyvda är mindre än för SpCas9 av vildtyp eftersom den observerade inneboende klyvningshastigheten för on-target-DNA av HypaCas9 (0,035 s-1) och Cas9-HF1 (0,038 s-1) var 100 gånger långsammare än för SpCas9 (4,3 s-1). Denna långsammare klyvningshastighet ger tid för en liten fraktion (8-25 %) av on-target-DNA att dissociera innan det klyvs.
Kinetisk fördelning för att gynna dissociation förstärktes när HypaCas9 och Cas9-HF1 reagerar med off-target-DNA eftersom klyvningshastigheterna reducerades ytterligare till 0,0023 s-1 respektive 0,00014 s-1 (fig. 4e, g, kompletterande fig. 9c, e). Dessa hastigheter är 50- till 860-faldigt långsammare respektive jämfört med SpCas9 på ett substrat utanför måltavlan. Följaktligen var endast ~24 % och ~10 % av det bundna off-target-DNA:t förpliktigat att gå framåt för klyvning av HypaCas9 respektive Cas9-HF1 i närvaro av fälla-DNA. Sammantaget visar dessa resultat att de konstruerade varianterna med hög tillförlitlighet fick förbättrad specificitet mot PAM-distalt missmatchat DNA genom en markant minskad klyvningshastighet, vilket ändrar den kinetiska fördelningen så att det bundna substratet frigörs i stället för att klyvas för både on- och off-target-DNA, men effekten är större för off-target-DNA. Beräkning av de skenbara dissociationshastighetskonstanterna med hjälp av Eq. (3) visar att varianterna med hög tillförlitlighet inte ökar den skenbara hastigheten för frisättning av DNA (kompletterande tabell 1).
Istället tillskrivs den ökade diskrimineringen helt och hållet minskningar av den skenbara hastighetskonstanten för klyvning.
I våra beskrivningar av kinetiken hos Cas9-enzymerna hittills uppskattades de observerade avklingningshastigheterna för reaktionerna baserat på att data anpassades till exponentiella funktioner, vilket ger egenvärden som vanligen är komplexa funktioner av flera hastighetskonstanter17. För att fullt ut förstå kinetiken och mekanismen anpassades alla experiment för varje enzym och DNA-substrat globalt baserat på numerisk integration av hastighetsekvationerna med hjälp av en enda enhetlig modell (fig. 5 och kompletterande fig. 10-14). Global dataanpassning visar att vår minimala modell (fig. 5f, inset) förklarar våra data och att var och en av hastighetskonstanterna är väldefinierad baserat på en analys av konfidenskonturerna som testar i vilken utsträckning varje parameter begränsas av data (fig. 6)17,28. Observera särskilt att vår modell förklarar de bifasiska spår som ses i vissa experiment utan att man behöver åberopa heterogenitet, och den ger inneboende hastighetskonstanter för varje steg i vägen, inklusive R-loop-bildning och HNH- och RuvC-klyvningshändelser. Även om det är troligt att ytterligare, olösta strukturella omarrangemang kan krävas för anpassning av katalytiska rester för DNA-klyvning, har dessa ännu inte lösts upp som kinetiskt distinkta händelser. Den nuvarande modellen representerar en minimal väg som är nödvändig och tillräcklig för att redogöra för alla tillgängliga data, och den kan enkelt utvidgas när ny information blir tillgänglig för att definiera ytterligare steg i vägen.
För att förstå enzymspecificitet måste hastighetskonstanter tolkas i samband med alla kinetiskt relevanta steg, vilket illustreras i profilen för den fria energin (beräknad med Eq. (4) från hastighetskonstanter i tabell 1).
Transmissionskoefficienten A = 0,001
Då den globala datainpassningen ger hastighetskonstanter för varje relevant steg (figurerna 5 och 6), kan vi konstruera en äkta frienergiprofil (figur 7b, och kompletterande figurer 10-14). De fria energiprofiler som jämför SpCas9, HypaCas9 och Cas9-HF1 visar en förändring i hastighetsbegränsande och specificitetsbestämmande steg. Enzymspecificitet definieras av kcat/Km och ges av den högsta totala barriären i förhållande till starttillståndet, medan den maximala hastigheten, kcat, definieras av den högsta lokala barriären i förhållande till det föregående tillståndet, dämpad av eventuella föregående snabba jämviktssteg. Eftersom hastighetskonstanterna för bildandet av R-slingan inte förändras nämnvärt med olika substrat och enzymvarianter styrs specificiteten till stor del av den kinetiska fördelningen av Cas9:s R-slinga, EDH-tillståndet i vår kinetiska modell (fig. 5f, inset), så att den antingen går framåt och resulterar i irreversibel klyvning eller släpps ut genom att DNA:t återförenas och kastas ut från enzymet. De högre totala barriärerna för klyvning som ses med varianterna med hög tillförlitlighet ökar den kinetiska fördelningssannolikheten till förmån för dissociation av DNA (fig. 6c).