Abstract
Åldrande leder till en mängd förändringar i det kardiovaskulära systemet, inklusive systolisk hypertoni, ökad central kärlstyvhet och ökat pulstryck. I den här artikeln kommer vi att granska effekterna av åldersassocierad ökad kärlstyvhet på systoliskt blodtryck, pulstryck, augmentationsindex och hjärtats arbetsbelastning. Dessutom kommer vi att beskriva pulsvågshastighet som en metod för att mäta kärlstyvhet och granska effekten av ökad kärlstyvhet som ett index för kärlhälsa och som en prediktor för negativa kardiovaskulära utfall. Dessutom kommer vi att diskutera de underliggande mekanismerna och hur dessa kan ändras för att förändra resultaten. En grundlig förståelse av dessa begrepp är av största vikt och har terapeutiska implikationer för den allt äldre befolkningen.
1. Kännetecken för det åldrande kardiovaskulära systemet
Att åldras leder till en mängd förändringar i det kardiovaskulära systemet, bland annat ökad kärlstyvhet. Faktum är att åldersrelaterade blodtrycksökningar huvudsakligen beror på en ökning av det systoliska blodtrycket samtidigt som det diastoliska blodtrycket bibehålls eller minskar något. Detta leder till en ökning av pulstrycket (skillnaden mellan systoliskt och diastoliskt blodtryck) . Systoliskt högt blodtryck är så nära förknippat med åldrande att personer som är 65 år gamla har 90 % chans att utveckla högt blodtryck under sin livstid . Isolerad systolisk hypertoni är den vanligaste subtypen av hypertoni hos medelålders och äldre och är nära kopplad till ökad arteriell stelhet och tryckökning genom reflekterade vågor. Andra orsaker till ett utvidgat pulstryck, inklusive svår anemi, aortainsufficiens, tyreotoxikos eller arteriovenös shunting, är mycket ovanligare.
Det arteriella systemet har två huvudfunktioner. För det första fungerar det som en kanal för att leverera syresatt blod och näringsämnen till organen. För det andra utgör det en kudde för att mildra de pulsationer som hjärtat genererar så att det kapillära blodflödet är nästan kontinuerligt. Människokroppen är mycket väl anpassad för att uppnå dessa funktioner. Sammansättningen av artärerna, särskilt media, förändras avsevärt när man rör sig från proximal (centrala stora artärer, t.ex. aorta och dess större grenar) till distal (perifera, huvudsakligen muskulära artärer, t.ex. brachial- eller radialartärer). Medan de dominerande fibrösa elementen i den thorakala aorta huvudsakligen innehåller elastin, innehåller de mer distala artärerna huvudsakligen kollagen. Denna skillnad är avgörande för att de centrala kärlen ska kunna upprätthålla sin Windkessel-funktion att dämpa det pulserande blodflödet. Med åldrandet leder störningar i tvärbindningen av elastinmolekylerna till en försvagning av elastinuppsättningen med predisposition för mineralisering av kalcium och fosfor, som alla leder till ökad arteriell styvhet . Det ökade pulstrycket som ses med åldrandet är ett direkt surrogat för arteriell styvhet. Den ökade kärlstyvheten har direkta konsekvenser för den ventrikulära-arteriella kopplingen (hjärtats interaktion med det systemiska kärlsystemet) . Ökningen av det systoliska blodtrycket ökar den systoliska arbetsbelastningen för vänster kammare och ökar vänster kammares endosystoliska styvhet och minskar den diastoliska följsamheten . Detta leder till ökad syreförbrukning, vänsterkammarhypertrofi och potentiellt subendokardiell ischemi på grund av obalans mellan myokardiell syretillgång och syrebehov.
2. Vaskulär styvhet: Mekanismer
Det normala unga kärlträdet, särskilt aorta, har förmågan att dämpa den pulserande ventrikulära utstötningen och omvandla den till ett nästan kontinuerligt flöde . Detta fenomen beskrivs ofta som Windkessel-funktionen och kräver en hög grad av aortisk följsamhet , definierad som en volymförändring som svar på en tryckförändring (𝐶=Δ𝑉/Δ𝑃). Vaskulär styvhet eller elasticitet är reciproken av compliance. Detta måste särskiljas från i) motstånd som karakteriserar förhållandet mellan medeltryck och flöde och ii) impedans som är ett mått på hur mycket en struktur motstår rörelse när den utsätts för en given kraft. I oscillerande system påverkas momentana mätningar också av de mätningar som omedelbart föregår dem.
Elasticiteten hos ett givet artärsegment är inte konstant utan beror snarare på dess utbredningstryck . Ett högre distensionstryck leder till en ökad rekrytering av kollagenfibrer och därmed till en minskning av elasticiteten . Detta utbredningstryck bestäms av det genomsnittliga arteriella trycket och måste beaktas när mätningar av arteriell styvhet görs. Förutom elastin påverkar även arterieväggens glatta muskulatur och tonus arteriell styvhet. Endotelet, som har förmågan att modulera tonen i den glatta muskulaturen, modulerar alltså styvheten. Dessutom påverkar kärldiametern också kärlens styvhet. I allmänhet är mindre kärl relativt styvare än större kärl på grund av deras mindre radie . Ett stort kärl kan ta emot en större volym för samma förändring av det utbredande trycket och har därför större följsamhet. Dessutom varierar väggens sammansättning med storleken, där media i stora centrala kärl huvudsakligen består av elastin, medan perifera ledningsartärer innehåller relativt mycket kollagen. Med åldrandet förändras den arteriella väggens struktur till följd av frakturer i den elastiska lamina, förlust av muskelfästen, ökning av kollagenfibrer, lokal inflammation, infiltration av glatta kärlmuskelceller och makrofager, fibros, avlagring av slemmigt material, fokal nekros av glatta kärlmuskelceller i media och förkalkning. Den intima-mediala tjockleken tredubblas mellan 20 och 90 års ålder. En stor del av denna förändring av sammansättningen med åldrandet är en följd av elastinbrott, där elastin successivt ersätts av kollagen . Detta leder till stora åldersrelaterade förändringar i kärlsystemet: det ökar den arteriella styvheten, vilket leder till en ökning av det systoliska blodtrycket och en ökning av pulstrycket. Dessutom leder dessa förändringar till artärdilatation när viktbärande elastin bryts ner .
Styrkan ökar också genom ackumulering av AGE-produkter (Advanced Glycation End) . Dessa är resultatet av irreversibel icke-enzymatisk glykering av proteiner (t.ex. kollagen) . Tvärbindning och AGE-bildning kan också omfatta elastin, vilket försämrar kärlväggens elastiska matris . AGE ökar dessutom bildningen av syreradikaler, proinflammatoriska cytokiner, tillväxtfaktorer och vaskulära adhesionsmolekyler . Dessa mediatorer ökar kärlstyvheten via matrismetalloproteinas, vilket ökar tonen i den glatta muskulaturen, dämpar vasodilatationen och främjar aterosklerotiska plack . I en nyligen genomförd klinisk prövning av Kass et al. har den icke-enzymatiska brytaren av tvärbindningar av avancerade glykningsändprodukter ALT-711 visat sig förbättra den totala arteriella följsamheten hos åldrade människor med kärlstyvhet, och kan därför utgöra ett nytt terapeutiskt tillvägagångssätt för denna abnormitet .
Förutom de ovannämnda förändringarna utövar kärlens glatta muskeltonus och endoteliala signalering en betydande effekt på kärlstyvheten . Mekanisk stimulering kan direkt förändra den vaskulära tonen genom cellsträckning, förändringar i kalciumsignalering, oxidativ stress och kväveoxidproduktion . Den viktigaste mediatorn för endotelberoende vasorelaxation är kväveoxid (NO) . Det framställs från L-arginin av NOS (kväveoxidsyntetas) . NOS-avkoppling, dvs. generering av reaktiva syrearter i stället för NO , bidrar till åldersrelaterad endoteldysfunktion, ökad kärlstyvhet, långsammare ventrikelrelaxation och åderförkalkning, som alla ökar PWV. NOS-avkoppling kan ha flera orsaker, bland annat begränsad tillgång till substrat (arginin) eller kofaktor (tetrahydrobiopterin) samt en nyligen identifierad posttranslationell modifiering genom enzymet glutathionylering (oxiderad glutation) . Förutom sina vasoaktiva effekter modulerar NO aktiviteten hos det korsbindande enzymet transglutaminas (TG) via S-nitrosylering, vilket också leder till ökad arteriell stelhet . Andra mekanismer som anses bidra till utvecklingen av ökad kärlstyvhet vid åldrande är en minskning av NOS-uttrycket , en ökning av xantinoxidasaktiviteten och en ökning av reaktiva syrearterier , medan stelhet i sig kan leda till en minskning av NOS-aktiviteten .
3. Mätningar av kärlstyvhet
Den arteriella tryckvågformen är en sammansättning av två vågformer, nämligen en framåtriktad tryckvåg på grund av ventrikelkontraktion och utstötning av blod i aorta och en bakåtriktad våg som skapas av reflektioner vid vaskulära förgreningar och vid punkter med impedansmissmatchning (förgreningar, plötslig förändring av kärldiametern och arterioler med hög resistans; figur 1) . Vågens hastighet längs artären kallas pulsvågshastighet (PWV) . I unga kärlbäddar kommer den reflekterade vågen tillbaka till aortikaroten under diastolen . Ökad arteriell styvhet, som till exempel vid åldrande, resulterar i en ökning av PWV och den reflekterade vågen kommer tillbaka till den centrala cirkulationen under systolisk ejektion. Detta läggs till den framåtriktade vågen, vilket ökar det systoliska blodtrycket och breddar pulstrycket. Denna förstärkning kan kvantifieras genom att mäta augmentationsindexet med hjälp av applanationstonometri. Den förstärkta komponenten representeras av skillnaden mellan den första och andra systoliska toppen, och förstärkningsindexet definieras som förhållandet mellan denna komponent och pulstrycket (figur 2). Augmentationsindexet utgör därför ett komplext mått på vågreflektion och omfattar arteriell stelhet, men är inte i sig självt ett mått på stelhet . Ett annat index för kärlstyvhet är pulstryckförstärkning, som kan kvantifieras som förhållandet mellan amplituden av proximalt pulstryck och distalt pulstryck . Noterbart är att Mitchell et al. nyligen har lagt fram bevis som ifrågasätter den reflekterade tryckvågens dominerande roll. De studerade en oselekterad samhällsbaserad population och föreslog att den sena ökningen av pulstrycket i livet främst beror på en ökning av amplituden av den framåtriktade tryckvågen och att vågens reflektion endast spelar en minimal roll . Oavsett vilken faktor som bidrar mest är åldrande förknippat med systolisk hypertoni, ökat pulstryck och ökade ventrikulära belastningsförhållanden. Augmentationsindex, pulstryckförstärkning och framför allt PWV används alltmer som en markör för kardiovaskulär sjukdom . PWV ökar med styvheten och definieras med Moens-Korteweg-ekvationen: PWV = √(𝐸ℎ/2𝑝𝑅), där 𝐸 är Young-modulen för artärväggen, ℎ är väggtjockleken, 𝑅 är artärradien och 𝑝 är bloddensiteten. Trots denna ganska komplexa formel är mätning av PWV relativt enkel. Den arteriella pulsvågen registreras på både proximal artärplats (t.ex. vanlig carotis) och distal artärplats (t.ex. femoral- eller brachialartär) . Tidsfördröjningen mellan pulsvågens ankomst erhålls antingen genom samtidig mätning eller genom att man väljer att använda sig av toppvärdet för R-vågen i EKG. Avståndet mäts över kroppsytan och PWV beräknas som avstånd/tid (m/s). Mätningen av avståndet mellan de två punkterna är endast en uppskattning av det verkliga avståndet med tanke på den individuella kroppshabitus. Arteriella pulsvågor kan upptäckas med hjälp av tryckkänsliga givare, Doppler ultraljud eller applanationstonometri. Ett annat icke-invasivt men mer komplicerat alternativ är att mäta PWV med MRT. Detta har fördelen att man kan bestämma tryckvågens exakta väg, men det är tidskrävande, opraktiskt kliniskt sett och mycket kostsamt.
Denna figurer illustrerar sammansättningen av den arteriella tryckvågsformen från en kombination av en framåtriktad tryckvåg som skapas av ventrikelkontraktion och en reflekterad våg. MAP: medelartärtryck, SBP: systoliskt blodtryck (se ).
(a)
(b)
(a)
(b)
Schematisk framställning av pulstryckförstärkning. Tryckspårningar från brachialartären och centrala aorta visas, från en ung individ med ett mycket följsamt kärlträd (vänster) och från en gammal individ med stela kärl (höger). Trots liknande brachialblodtryck varierar det centrala blodtrycket avsevärt. Hos unga individer markerar 𝑃1 (som sammanfaller med det systoliska blodtrycket) den utåtriktade blodtrycksvågen, medan 𝑃2 representerar ankomsten av den reflekterade tryckvågen i diastole, vilket ökar det diastoliska blodtrycket och kranskärlsfyllningen. Pulstryckökning i gamla, stela kärl leder till en betydande ökning av 𝑃2 jämfört med 𝑃1, eftersom vågreflektionen sker tidigare och snabbare, vilket leder till en ökning av det systoliska blodtrycket. Augmenteringsindex beräknas som skillnaden mellan den andra (𝑃2) och den första (𝑃1) systoliska toppen (delta 𝑃) i procent av pulstrycket (se ).
Central kärlstyvhet kan bedömas icke-invasivt genom att mäta pulsvågshastighet, bedöma tryckvågsformer eller mäta pulstrycket. Försiktighet måste iakttas när man använder pulstryck som ett index för central stelhet. I perifera artärer ligger reflektionsställena närmare varandra, vilket resulterar i en större förstärkning av tryckvågen i perifera artärer. Därför är det perifera pulstrycket normalt högre hos unga personer med friska kärl. Hos äldre personer, inklusive patienter med högt blodtryck eller diabetes, ökar det centrala pulstrycket på grund av förändrade styvhetsegenskaper, och det centrala pulstrycket kan närma sig och till och med vara lika stort som det perifera pulstrycket.
4. Kärlstyvhetsmätningar som prognostisk indikator
Flera stora epidemiologiska studier, inklusive en av Framingham-kohorterna som omfattade 2 232 patienter, har fastställt den roll som det systoliska blodtrycket och pulsvågshastigheten har som en prognostisk faktor för negativa kardiovaskulära händelser . Ytterligare studier har visat att det brachiala pulstrycket är en stark och oberoende prediktor för kongestiv hjärtsvikt och stroke hos hypertonipatienter och i den allmänna befolkningen . I ABC-studien med 2 488 äldre deltagare var högre PWV förknippat med högre kardiovaskulär dödlighet, hjärtsvikt och stroke efter justering för ålder, kön, ras, systoliskt blodtryck, känd kardiovaskulär sjukdom och andra kända kardiovaskulära riskfaktorer . Liknande resultat erhölls i Rotterdamstudien som omfattade 2 835 friska personer och som visade att aortisk pulsvågshastighet är en oberoende prediktor för kranskärlssjukdom och stroke . Monica-studien med 1 678 deltagare i åldern 40-70 år och en 10-årsuppföljning visade att ökad aortisk pulsvågshastighet förutsäger en sammansatt kardiovaskulär utfall . Detta upprepades nyligen av Wang et al. som studerade 1 980 polikliniska patienter (medelålder 50±13 år) med 10 års uppföljning och som visade att PWV var signifikant förknippat med dödlighet av alla orsaker och kardiovaskulär dödlighet, oberoende av tidigare kardiovaskulär sjukdom . Liknande resultat erhölls i Strong Heart Study med 3 520 personer, som visade att icke-invasivt bestämt centralt pulstryck är en bättre prediktor för vaskulär hypertrofi, ateroskleros och kardiovaskulära händelser än brachialisblodtryck . ASCOT-studien med 259 deltagare bekräftade dessa resultat , liksom en studie av Safar et al. på 180 patienter som visade att pulstryckförstärkning är en oberoende prediktor för dödlighet av alla orsaker . Slutligen, och av avgörande betydelse, visade Dublin Outcome Study med 11 291 personer som omfattade medelålders deltagare utan högt blodtryck tydligt att ett index för arteriell styvhet och pulstryck var oberoende prediktorer för dödlighet i hjärt- och kärlsjukdomar och stroke . Detta bekräftades återigen av en ännu större studie i Paris som omfattade 125 151 medelålders patienter under 12 år utan kardiovaskulära sjukdomar som genomgick en regelbunden hälsokontroll . Författarna visade att brachialis-pulstryck, beräknat karotis-pulstryck och förstärkning av karotis-brachialis-pulstrycket alla förutspår kardiovaskulär dödlighet, med förstärkning av karotis-brachialis-pulstrycket som den starkaste prediktoren .
Förutom att vara en prediktor för kardiovaskulära händelser i den allmänna befolkningen har pulstrycket också visats vara oberoende och signifikant förknippat med njurfunktionsstörningar och njursvikt efter kranskärls-bypassoperation . I denna internationella prospektiva kliniska multicenterstudie med 4801 patienter var varje 20 mmHg ökning av det perioperativa pulstrycket över 40 mmHg förknippad med en signifikant ökning av njurdysfunktion eller njursvikt . Dessutom har förhöjt pulstryck visat sig vara en prediktor för stroke efter hjärtkirurgi . På senare tid har pulstrycket också visat sig vara en oberoende prediktor för kardiovaskulär död i en liknande kohort efter koronar bypassoperation .
En nyligen genomförd systematisk genomgång och metaanalys av Vlachopoulos et al. utvärderade 17 longitudinella studier som studerade effekterna av aortiskt PWV på sammanlagt 15 877 patienter under en genomsnittlig tid på nästan 8 år . De visade att de sammanlagda relativa riskerna ökar stegvis från den första till den tredje tertilen. Vidare delade de in sina analyser i tre kategorier: (a) hög kontra låg aorta-PWV, b) ökning av aorta-PWV med 1 m/s och c) ökning av aorta-PWV med 1 standardavvikelse, som alla visar att det hos högriskpersoner (personer med kranskärlssjukdom, njursjukdom, högt blodtryck eller diabetes) och lågriskpersoner (den allmänna befolkningen) finns en ökning av totala kardiovaskulära händelser, kardiovaskulär dödlighet och dödlighet av samtliga orsaker (figur 3). De drar därför slutsatsen att PWV är en mycket stark prediktor för kardiovaskulära händelser och dödlighet av alla orsaker och stödde införandet av aortisk pulsvågshastighet i klinisk praxis . Denna studie följdes av ett initiativ för att bestämma och fastställa referensvärden för pulsvågshastighet hos friska personer som nu kan användas för att identifiera personer med högre risk i en viss åldersgrupp .
(a)
(b)
(c)
(a)
(b)
(c)
Denna figur visar poolad RR och 95 % KI för aorta PWV och totala CV-händelser (a), CV-dödlighet (b) och total dödlighet (c), enligt utgångsrisk och sjukdomstillstånd. Data tillhandahålls för hög kontra låg aortisk pulsvågshastighet (PWV) (vänster kolumn), ökning av aortisk PWV med 1 m/s (mittenkolumn) och ökning av aortisk PWV med 1 SD (högerkolumn) (se ).
5. Vaskulär stelhet och behandlings-/hanteringsstrategier
Centralt pulstryck är en stark prediktor för negativa kardiovaskulära utfall. I CAFE-studien som omfattade 2 199 patienter i fem centra utvärderades två olika blodtrycksregimer . En kombination av amlodipin och en ACE-hämmare var överlägsen när det gällde att sänka det centrala trycket jämfört med en kombination av atenolol och ett tiaziddiuretikum . Detta gällde trots att båda läkemedelsregimerna sänkte det brachiala blodtrycket i samma utsträckning. Dessutom var de kardiovaskulära resultaten på lång sikt bättre i den grupp som behandlades med en kombination av amlodipin plus en ACE-hämmare. Författarna föreslog att skillnader i centrala aortatryck kan vara en potentiell mekanism som ligger bakom de olika kliniska resultaten mellan olika blodtrycksbehandlingar. Senare analyser visade att den huvudsakliga orsaken till den uppenbara bristen på effekt av betablockerare plus ett diuretikum på centrala tryck var att betablockerare sänkte hjärtfrekvensen i högre grad än amlodipin plus ACE-hämmare. Detta leder till ett högre augmentationsindex och därmed högre centrala aortatryck. Orsakerna till detta är tvåfaldiga: (i) En sänkning av hjärtfrekvensen leder till en ökning av slagvolymen för att bibehålla hjärtminutvolymen, som när den sprutas ut i en stel aorta orsakar en ökning av det systoliska blodtrycket, (ii) en lägre hjärtfrekvens förlänger hjärtcykelns varaktighet, vilket fördröjer tiden till topp för den utgående pulsvågen och gör att den reflekterade vågen återvänder i slutet av systolen, vilket också resulterar i en ökning av det systoliska blodtrycket. Efter att dessa forskare justerat för hjärtfrekvens var skillnaderna i centrala systoliska tryck och pulstryck mellan behandlingsarmarna inte längre signifikanta och skillnaderna i index för ökning av det centrala blodtrycket var minimala.
Forskning inom området kärlstyvhet motiveras av en önskan att förstå och förhöra underliggande mekanismer och på så sätt modulera styvhet och de resulterande kardiovaskulära följdsjukdomarna. Många interventioner som innefattar livsstilsoch kostförändringar, till exempel rökstopp , användning av omättade fettsyror , isoflavoner (rikligt förekommande i sojabönor) , minskat saltintag i kosten , regelbunden kardiovaskulär träning och måttlig alkoholkonsumtion har alla kopplats samman med en minskning av kärlstyvhet. Andra strategier omfattar farmakologiska åtgärder som kalciumkanalblockerare, diuretika, ACE-hämmare, betablockerare, nitrater, fosfodiesteras-5-hämmare och statiner. Även om alla dessa behandlingar sänker blodtrycket är deras effekt på arteriell stelhet endast blygsam. En delstudie av REASON-studien av de Luca et al. på 146 personer visade att en kombination av ACE-hämmare och en nonthiazidsulfonamid sänkte vänsterkammarmassan samt det centrala och brachiala blodtrycket i större utsträckning än behandling med atenolol . Liknande resultat sågs i en studie av Morgan et al. på 32 äldre patienter; de visade att ökningstrycket efter betablockerare var större än med placebo, medan ökningstrycket efter ACE-hämmare, kalciumkanalblockerare eller diuretika var betydligt mindre jämfört med placebo . De lägsta centrala aortatrycken uppnåddes med kalciumblockerande läkemedel och diuretika . I en liten studie av Hayashi et al. på 24 normotensiva äldre personer förbättrade administrering av en ACE-hämmare den åldersrelaterade ökningen av carotisartärens styvhet . Nitrater å andra sidan påverkade inte aorternas styvhet även om de sänkte pulstrycket genom selektiv venodilatation och dämpning av perifer vågreflektion . Fosfodiesteras-5-hämmare som sildenafil fungerar på samma sätt som nitrater och minskar också vågreflektionen och sänker pulstrycket, men utan nitraternas biverkningar . Arteriella stelhet kan eventuellt förbättras med HMG-co A-enzymhämning med statiner, även om denna effekt åtminstone delvis beror på en minskning av LDL-kolesterol och NOS-aktivering . En nyligen genomförd metaanalys, som omfattade 471 deltagare, kunde dock inte visa att statiner orsakar en minskning av arteriell stelhet. Författarna rekommenderade att prospektiva randomiserade kliniska studier bör genomföras för att nå mer robusta slutsatser .
6. Slutsatser
Åldrande leder till en mängd förändringar i det kardiovaskulära systemet, och det är en kraftfull prediktor för negativa kardiovaskulära händelser. Ett kännetecken för denna process är ökad central kärlstyvhet, vilket resulterar i en tidigare återkomst av den reflekterade pulsvågen, vilket adderar till den framåtriktade vågen och följaktligen ökar det centrala systoliska blodtrycket, vidgar pulstrycket, ökar belastningsförhållandena för hjärtat och äventyrar perfusionen av vitala organ. Även om systoliskt blodtryck och pulstryck är surrogat för denna process kan kärlstyvhet mätas mer exakt med hjälp av pulsvågshastighet (karotis-femoral) .
Kärlstyvhet, som är ett index för kärlhälsa, har visat sig ge ytterligare oberoende prediktivt värde för negativa kardiovaskulära utfall. Vaskulär stelhet kan potentiellt ändras om vi förstår de specifika underliggande mekanismerna. Viktigt är att även i avsaknad av riktade terapier har en förståelse av dessa begrepp prognostiska implikationer, ett begrepp som redan är etablerat inom kardiologin och som är på väg att växa fram inom den perioperativa medicinen.
Finansiering
D. E. Berkowitz och D. Nyhan har fått finansiering från NIH R01 105296.
Acknowledgments
Författarna vill tacka alla medlemmar i Shoukas-Berkowitz-laboratoriet för deras stöd i detta projekt och Mary Ann Anderson för hennes sekretariatshjälp.